Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Состояние исследований в области изучения репродуктивной стратегии голотурий
1.1.1. Развитие гонады 10
1.1.2. Дифференцировка пола и соотношение полов 12
1.1.3. Половой диморфизм 12
1.1.4. Репродуктивная система 13
1.1.5. Организация гаметогенеза 14
1.1.5.1. Сперматогенез 16
1.1.5.2. Оогенез 18
1.1.5.3. Резорбция и дегенерация гамет 21
1.1.6. Форма и размеры гамет 23
1.1.7. Развитие 26
1.2. Заключение 29
ГЛАВА 2. Биология cucumaria frondosa баренцева моря и природные условия обитания
2.1. Таксономическое положение 31
2.2. Морфология 33
2.3. Химическое строение 41
2.4. Образ жизни, питание 43
2.5. Распространение и влияние абиотических факторов на распределение кукумарии. Роль в сообществах 43
2.6. Перспективы использования 47
2.7. Особенности океанологических условий Баренцева моря 49
2.7.1. Физико-географическое описание Баренцева моря 49
2.7.1Л. Гидрологический режим 51
2.7.1.2. Гидрохимический режим 52
2.7.1.2.1. Распределение кислорода 53
2.7.1.2.2. Распределение фосфатов 55
2.7.1.2.3. Сроки наступления и продолжительность гидрологических и биологических сезонов в Баренцевом море 56
2.7.2. Гидрологические и гидрохимические характеристики
районов обитания баренцевоморской голотурии C.frondosa 58
2.7.2.1. Мурманское мелководье 58
2.7.2.2. Северо-Канинская банка 60 2.123. Северный склон Гусиной банки 62
2.7.2.4. Святоносский район 65
2.7.2.5. Западный Прибрежный район 67
2.7.2.6. Восточный склон Медвежинской банки 67
2.8. Заключение 71
ГЛАВА 3. Материалы и методы 72
3.1. Районы и сроки работ. Объем обработанного материала 72
3.2. Морфология гонад и динамика гонадного индекса 73
3.3. Репродуктивный цикл и стадии зрелости 74
3.3.1. Морфометрический анализ 74
3.3.2. Гистологический анализ 75 3.3.2.1. Этапы гистологической техники 75
3.4. Плодовитость 80
3.5. Статистическая обработка результатов 80
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение
4.1. Морфология гонад
4.1.1. Гипотезы образования гонадных трубочек
4.2. Диагностика пола
4.3. Пространственная организация оогенеза
4.4. Репродуктивный цикл и стадии зрелости гонад
4.5. Сезонная динамика развития гонад
4.5.1. Состояние гонад в летний период
4.5.2. Состояние гонад в осенний период
4.5.3. Состояние гонад в зимний период
4.5.4. Состояние гонад в весенний период
4.6. Динамика гонадного индекса
4.7. Характер, сроки и продолжительность нереста
4.8. Факторы, стимулирующие нерест
4.9. Плодовитость
Заключение
Выводы
Список сокращений
Список литературы
- Дифференцировка пола и соотношение полов
- Распространение и влияние абиотических факторов на распределение кукумарии. Роль в сообществах
- Морфология гонад и динамика гонадного индекса
- Гипотезы образования гонадных трубочек
Введение к работе
Одним из перспективных объектов промысла являются иглокожие, в частности голотурии. В Баренцевом море встречается массовый вид голотурий - Cucumaria frondosa, запасы которой представляют интерес для промышленного освоения. Особенно в последнее время, когда наблюдается тенденция уменьшения запасов традиционных объектов промыслового рыболовства в Северном бассейне, изыскание дополнительных источников морских биоресурсов приобретает особую значимость. Несмотря на огромный интерес к этим животным, они остаются недостаточно изученными.
Актуальность работы. Голотурии входят в состав большинства бентических сообществ и играют в них доминирующую роль. Велика экологическая роль голотурий, они оказывают мощное воздействие на биопереработку органического материала на дне моря. Во избежание подрыва ресурсов и нарушения целостности донных сообществ необходимым аспектом является изучение репродуктивной биологии вида.
Эти животные играют важную роль в хозяйственной деятельности человека. Их используют в качестве пищевых продуктов, которым приписывают не только гастрономические, но и лечебные качества. Установлено, что органы и ткани Cucumaria frondosa, как и у других видов голотурий, содержат большой спектр ценных биологически активных веществ (БАВ), которые обладают противоопухолевой, антимикробной активностью, им присущи иммуномодулирующие и радиозащитные свойства. Концентрация и сезонные изменения химических соединений тесно связаны с динамикой и интенсивностью гаметогенетических процессов (Хотимченко и др., 1993). Поэтому при проведении работ по разработке биотехнологии получения и использования БАВ необходимой основой является знание особенностей функционирования репродуктивной системы вида в разные сезоны года (Оганесян, 1996).
Изучению репродуктивного цикла промысловых голотурий посвящено много работ (Tanaka, 1958; Низовская, 1971; Jordon, 1972; Coady, 1973; Green, 1978; Размножение иглокожих..., 1980; Cameron, Fankboner, 1986; Мокрецова, 1987; Касьянов, 1989; Hamel et al., 1993 и др.), а С. frondosa Баренцева моря в этом отношении является мало изученной.
Знание репродуктивных возможностей организмов, составляющих морские сообщества, необходимо для прогнозирования изменений, происходящих в них под влиянием различных факторов и для осуществления рационального промысла этих животных.
Цели и задачи работы. Цель исследований состояла в изучении репродуктивного цикла на примере особенностей оогенеза промысловой голотурии Баренцева моря.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
изучить морфологию гонад и клеточный состав половых трубочек;
выявить стадии зрелости яичников;
исследовать сезонную динамику развития гонад;
установить связь факторов среды с оогенетическими процессами и размножением;
определить сроки, характер и продолжительность нереста;
оценить плодовитость у среднеразмерных особей.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые на основании морфометрического и гистологического анализов проведены исследования по изучению репродуктивной биологии самок С. frondosa Баренцева моря. Выявлены стадии зрелости яичников, для каждой стадии установлены свои цитоморфологические особенности. Описана сезонная динамика развития гонад, для среднеразмерных особей рассчитана плодовитость. Установлена четкая взаимосвязь изменений факторов среды с гаметогенетическими процессами и нерестом кукумарии.
Практическая ценность работы. Полученные данные могут быть использованы при проведении промысла кукумарии в Баренцевом море. В
целях сохранения естественного воспроизводства голотурий следует учитывать сроки их нереста. Наши исследования показали, что нерест кукумарии в Баренцевом море происходит с марта по май и на этот период необходимо ввести запрет на промысел.
Нерест не является единственной причиной ограничения промысла. Невысокая плодовитость, низкие темпы роста, малоподвижный образ жизни, большая продолжительность жизни (не менее 20-24 лет) требуют очень аккуратного обращения с ресурсами кукумарии Баренцева моря. Поэтому вылов голотурии С. frondosa может производиться только малыми партиями с использованием маломерных судов и щадящих орудий лова.
Результаты работы могут быть использованы при изучении типа Иглокожих в вузовских курсах «Зоология беспозвоночных», «Эмбриология» и «Биология размножения и развития».
Основные результаты выполненных исследований внедрены в учебный процесс; используются при чтении лекций и постановке лабораторных работ; включены в учебно-методическую литературу для студентов высших учебных заведений по специальностям 020201 «Биология», 020803 «Биоэкология» и 020209 «Микробиология». Имеются акты о внедрении.
Апробация работы. Результаты исследований, проводимых с 2001 г. по настоящее время в рамках госбюджетных научно-исследовательских работ кафедры микробиологии Мурманского государственного технического университета, представлены в отчетах о научно-исследовательской работе во Всероссийском научно-техническом информационном центре (г. Москва, 2006 г.).
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях в период с 2002 г. по 2006 г.:
1. XX юбилейная конференция молодых ученых Мурманского
морского биологического института (ММБИ КНЦ РАН, Мурманск, 2002);
2. Всероссийская научно-техническая конференция «Наука и
образование - 2002» (МГТУ, Мурманск, 2002);
3. Международная научная конференция «Новые технологии в
решении проблем сохранения биоразнообразия в водных экосистемах»
(Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2002);
4. Всероссийская научно-техническая конференция «Наука и
образование - 2003» (Мурманск, 2003);
5. Молодежная международная конференция «Экология - 2003»
(Архангельск, 2003);
Международная научно-техническая конференция (МГТУ, Мурманск, 2004);
Международная научно-техническая конференция (МГТУ, Мурманск, 2005);
Международная научно-техническая конференция (МГТУ, Мурманск, 2006);
12th International Echinoderm Conference (Durham, New Hampshire, 2006);
IV Международная научная конференция «Биотехнология - охране окружающей среды, посвященной 295-летию М.В. Ломоносова» (Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2006).
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем -159 страниц, 60 рисунков, 11 таблиц, 1 приложение. Список литературы содержит 153 источника, в том числе 70 на иностранных языках.
Дифференцировка пола и соотношение полов
Строение репродуктивной системы обеспечивает размножение, рост и созревание половых клеток, их накопление и выведение.
У голотурий сохранился примитивный тип строения гонад - в передней части целома располагается одна гонада, состоящая из различного количества ветвящихся и неветвящихся трубочек с единым половым протоком (Касьянов, 1989). Половая железа не внедряется в другие органы, а свободно располагается в полости тела. Гонодукт открывается на спинной стороне около венчика щупалец или между ними на специальной половой папилле в интеррадиусе (Hyman, 1955).
В гонаде иглокожих роль несущей конструкции и своеобразного «технического этажа» играет стенка гонады. Именно она обеспечивает приток питательных веществ и кислорода, удаление продуктов обмена и резорбции, здесь же находятся нервные окончания и рецепторы (Beijnink et al., 1984; Smiley, Cloney, 1985). Соединительнотканные элементы гонады придают ей необходимую эластичность, мышечные - обеспечивают эвакуацию гамет в ходе нереста. По сравнению с другими иглокожими стенка гонады у голотурий устроена просто. Наиболее четко выражена структура стенки на препаратах гонад после нереста и в начале интенсивных гаметогенетических процессов. Перитонеальный эпителий покрывает трубочки гонады. В перитонеальном слое залегают тракты аксонов нейросекреторных клеток, участвующих, вероятно, в регуляции размножения (Smiley, Cloney, 1985). Под ресничными клетками целомического эпителия и миоэпителиальными клетками, подостланными базальной мембраной, проходят синусы гемальнои системы, не имеющие эпителиальной выстилки. Соединительнотканные волокна с одной стороны омываются гемальнои жидкостью, содержащей амебоциты, с другой - контактируют с половыми и вспомогательными клетками собственно гонады (Касьянов, 1989). Кришнан и Дейл (Krishnan, Dale, 1975) обнаружили в клетках стенки гонады Cucumaria frondosa множество полисахаридных и белковых гранул и предположили, что питательные вещества в гаметоциты голотурий поступают из гемального синуса. Ультраструктурный анализ клеток перитонеальной выстилки яичника кукумарии Eupentacta fraudatrix показал, что они содержат гранулы и находятся в состоянии апокриновой секреции, выделяя содержимое через базальную мембрану в гемальный синус гонады. Поглощение питательных веществ из целомической жидкости и их передача в гемальный синус перитонеальными клетками гонады предполагается по результатам электронно-микроскопического анализа строения стенки яичника Stichopus califomicus (Smiley, Cloney, 1985). Для женских и мужских гонад голотурий характерны очень глубокие выпячивания гемального синуса в полость трубочек.
Половые клетки, выстилающие изнутри гонаду и заполняющие ее просвет, располагаются в ацинусах упорядоченно, занимая на разных стадиях гаметогенеза определенное положение. Трубочки или ацинусы гонады обладают таким внутренним строением, которое организует весь процесс гаметогенеза, приток и распределение питательных веществ, синтез гормонов, эвакуацию гамет и гормонов, а затем обеспечивают подготовку гонады к новому гаметогенетическому циклу. В ацинусе соматические клетки гонады образуют специфические связи с половыми клетками. Структурной единицей ацинуса, в пределах которой проходит гаметогенетический цикл, являются сперматогенные столбики семенников и овариальные фолликулы яичников. По мере прохождения гаметогенеза морфология этих структурных единиц меняется, проходя полный цикл развития и угасания, и именно эта динамика описывается как гонадный репродуктивный цикл.
Гаметогенез и гаметогенетические процессы у голотурий подробно изучены дальневосточными учеными (Касьянов, 1989; Дроздов и др., 1986). Внутреннюю структуру половых тубул яичника образуют фолликулярные клетки, окружающие ооциты и вспомогательные клетки. Фолликулярные клетки соседних ооцитов плотно прилегают друг к другу. Они имеют уплощенную форму с вытянутым ядром и длинными отростками. Фолликулоциты, прилегающие к стенке ацинуса имеют микроворсинки. Возможно, здесь происходит перенос питательных веществ из гемального синуса в ооцит. Фолликулярный эпителий переходит в участках, где отсутствуют ооциты, в париетальный эпителий, выстилающий стенку трубочки. В зоне контакта ооцита со стенкой трубочки находится базальная мембрана ооцита - ооламина, являющаяся барьером между гемальным синусом и субфолликулярным пространством, окружающим ооцит (Smiley, Cloney, 1985). Вспомогательные клетки прилегают к стенке ацинуса, их цитоплазма заполнена фагосомами и образует псевдоподии. В ходе оогенеза яйцевые фолликулы перемещаются от стенки гонады к ее просвету.
Стенка ацинуса семенника имеет такое же строение, как и стенка ацинуса яичника. Внутренняя структура ацинуса семенника образована гигантскими осевыми клетками, окруженными сперматогенными клетками. Выросты и лакуны гемального синуса гонады глубоко впячиваются в осевую клетку. Основание осевой клетки контактирует с базальной мембраной гемалыюго синуса. Ядро осевой клетки располагается апикально и имеет неправильную овальную форму, ее цитоплазма простирается к центру ацинуса в виде филоподий и содержит различные электронно-плотные гранулы и фагосомы. Осевая клетка со всех сторон окружена сперматоцитами и сперматидами, соприкасающимися с выростами или телом осевой клетки. По направлению к стенке трубочки осевая клетка сужается, превращаясь в узкую ножку, сопровождаемую сперматоцитами. При контакте со стенкой ацинуса ножка осевой клетки образует расплющенное основание, простирающееся вдоль стенки, с сидящими на нем сперматогенными клетками. По мере завершения сперматогенеза размеры сперматогенных столбиков уменьшаются, освобождая пространство для спермиев.
Распространение и влияние абиотических факторов на распределение кукумарии. Роль в сообществах
Химическое строение кукумарии столь же необычно, как и биология этих животных. Химический состав тканей голотурии характеризуется низким содержанием органических соединений и высоким содержанием -солей и воды.
Суммарная белковая фракция представлена в основном коллагеноподобными белками соединительной ткани (Калинин и др., 1994; Саватеева, 1984). Всего идентифицировано 17 аминокислот - 7 незаменимых и 10 заменимых (Наседкина и др., 1973; Лебская, 2000).
Выявлены соединения, относящиеся к трем группам: тритерпеновые гликозиды, гексозамины и липиды (Калинин и др. 1994). Среди липидов различают следующие классы: фосфолипиды, пигменты, стерины и нейтральные жиры. Пигменты представлены в основном каротиноидами и меланинами. Среди каротиноидов идентифицированы астаксантин (определяет цвет гонад у самок) и кантаксантин (у самцов) (Matsuno, Ito, 1971).
Во всех частях тела кукумарии найдены витамины А, Е и D (Лебская, 2000). Химический состав гонад кукумарии в отличие от всех органов по содержанию в них биологически активных веществ (фосфолипиды, витамины, каротиноиды, гликозиды) изменяются по сезонам. Можно предположить, что созревание гонад сопровождается увеличением в них содержания БАВ (Лебская, 2000).
Наиболее полно исследованы у голотурий химические соединения, относящиеся к группе тритерпеновых гликозидов. Они представляют собой низкомолекулярные соединения, содержащие углеводы, водород гликозидного гидроксила которых замещен на тритерпеновый радикал. Строение гликозидов голотурий специфично для родов и даже видов (Левин и др., 1985; Калинин и др., 1994). Состав гликозидов является таксономическим признаком. Гликозиды С. frondosa - фрондозиды -содержат ксилозу в углеводной цепи и 160-ацетат в агликоне. Основной компонент гликозидной фракции - фрондозид А имеет пять моносахаридных звеньев (Girard et al., 1990; Авилов и др., 1993) (рис. 2.6). Учитывая отмеченную у ряда видов голотурий повышенную концентрацию гликозидов в гонадах в период, непосредственно предшествующий нересту, вполне допустима возможность выделения их в воду и осуществления ими сигнальной функции для агрегирования особей (Калинин и др., 1994). Наличие токсичных гликозидов помогает морским огурцам защитить покровы тела от заселения микроорганизмами и снижает возможность поедания голотурий хищниками.
По типу питания кукумарии относятся к подвижным сестонофагам жестких грунтов (Турпаева, 1953; Несис, 1965; Кузнецов, 1980).
Основная пища голотурий - органические остатки, ассоциированные с микроорганизмами (детрит), а также мелкие планктонные (медузы, личинки креветок) и бентосные организмы (диатомеи, ракообразные), захватываемые вместе с детритом. Совместно с органическими компонентами в содержимом кишечника всегда присутствуют минеральные частицы (Гудимова, 1998).
Рот С. frondosa окружен десятью древовидно разветвленными щупальцами, которые в расправленном состоянии достигают 10-14 см в длину. Во время питания животные сидят неподвижно с широко раскрытым венчиком щупалец. Приносимые током воды пищевые и балластные частицы механически улавливаются сетью веточек кроны, а также налипают на щупальца, покрытые железистыми клетками, способными продуцировать слизь (Филимонова, 1979). Кроме того, слизь вырабатывается также железами глотки и пищевода (Fankboner, 1981). На определенное время каждое щупальце погружается в просвет глотки, пищевые частицы «снимаются», и щупальце получает новую порцию слизи. Лабораторные наблюдения за С. frondosa показывают, что помимо улавливания взвешенных частиц, эти животные часто используют щупальца для «подметания» поверхности дна вблизи ротового отверстия (Гудимова, 1998).
Согласно исследованиям Е.Н. Гудимовой (Гудимова, 1998), активность питания зависит от температуры воды. При ее увеличении пищевая активность не только не возрастает, но и убывает.
Анализ материалов морских экспедиций «Севрыбпромразведки», ПИНРО, ММБИ и литературных данных позволяет судить о характере и распределении кукумарии в Баренцевом море. Обширные поселения кукумарии расположены на Медвежинско-Шпицбергенском мелководье, на побережье Мурмана - от о. Харлов до м. Святой Нос, на Мурманском мелководье, Северо-Канинской и Гусиной банках. Северная граница распространения этого вида проходит у островов архипелага Земля Франца-Иосифа (в прибрежье островов Хейса, Гарлей, Нортбук, Гукера, Виктория). Крайняя восточная точка обнаружения кукумарии - пролив Карские Ворота. Вид встречается также у берегов Западного Шпицбергена (Дерюгин, 1915; Шорыгин, 1928; Пропп, 1971; Баранова, 1977; Кузнецов, 1980; Гудимова, 1998)(рис.2.6).
Площади поселений кукумарии значительно варьируют от 600 до 3000 км2. Средняя масса животных в различных поселениях отличается "у незначительно и находится в пределах 10-20 г/м , хотя в отдельных точках достигает 400-500 г/м2 (Медвежинская банка). Ресурсы кукумарии, рассчитанные для юго-восточной части моря, включая прибрежные районы, оцениваются в 120-180 тыс. т, для Медвежинско-Шпицбергенского мелководья - 165-265 тыс. т (Гудимова, 1998).
В общем, ареал обитания С. frondosa (рис. 2.7) простирается от Северной Атлантики и Баренцева моря до Восточного побережья Северной Америки (штат Массачусетс), поэтому ее можно определить как арктическо-бореальный вид (Дьяконов, 1933; Гудимова, Денисенко, 1995; Современный бентос Баренцева..., 2000).
Морфология гонад и динамика гонадного индекса
Схема экспериментальной части работы представлена на рис. 3.2. При камеральной обработке у каждой особи определяли длину и массу кожно-мускульного мешка; описывали морфологию гонад: цвет, длину, массу, общее количество половых трубочек, а также число тонких, средних и толстых трубочек. Гонадный индекс (ГИ, в %) определяли как отношение массы гонад q к массе кожно-мускульного мешка (КММ) Р по формуле: ГИ = я/РхЮ0, где q - масса половых желез, Р - масса животного.
Использование в подобных расчетах значений массы КММ кукумарии вместо общей массы тела было принято различными исследователями голотурий (Jordan, 1972; Hamel, Mercier, 1996а). Это связано со значительным содержанием внутриполостной жидкости (до 40-60% массы тела) у этих животных и сильной оводненностыо внутренних органов (водные легкие, желудочно-кишечный тракт), что приводит к значительным погрешностям при вычислениях.
При исследовании репродуктивного цикла и стадий зрелости гонад использовали морфометрический и гистологический анализы.
У каждой самки отбирали 10-20 трубочек гонады, в каждой трубочке просматривали три участка (по 1 см): концевой, средний и основание трубочки. Измерение диаметра и подсчет разных категорий ооцитов проводили под бинокуляром при помощи окуляр-микрометра. Значения диаметра ооцитов группировали в размерные классы с интервалом 200 мкм. Развитие гонад классифицировали в 5 стадий (восстановления, роста, созревания, зрелости и состояние после нереста).
Для микроскопических исследований также использовали основание, средний и концевой сегменты половой трубочки.
Часть гистологического анализа выполнена на базе Мурманского бюро судебно-медицинской экспертизы в гистологической лаборатории на оборудовании немецкой фирмы «Medite». 1. Предварительно фиксированные в 4%, 10% растворах формалина сегменты укладывались в пластмассовые кассеты и помещались в аппарат линейной проводки материала «Tissue Processor ТРС 15». Реагенты и время экспозиции материала представлены в таблице 3.2. 2. Заливку в парафин осуществляли с помощью прибора «Paraffin о Streckbad TBS 88» при t 57 С. Для этого пользовались специальными металлическими ванночками, куда помещались сегменты, сверху накрывались пластмассовыми решетками, через которые производили заливку. Для застывания парафина ванночки помещались на специальный блок охлаждения с температурой 7-Ю С. 3. Далее для охлаждения парафиновых блоков использовали охлаждающую панель СОР 20 с температурой 4-5С. 4. Гистологические срезы толщиной 6-8 мкм получали на санном микротоме «Microm НМ 400 Е». Тонкие серийные срезы в виде лент снимали мягкой кисточкой, слегка смоченной водой и переносили на поверхность воды, нагретой до 40 С для расправления. Срезы помещали на воду той стороной, которая была обращена к ножу. Затем их вылавливали на чистое, сухое, обезжиренное предметное стекло; для этого его опускали одним концом в ванну с водой, где находятся срезы, подводили под срез и подхватывали последний, удерживая препаровальной иглой на средней части стекла. При помощи кисточки срезы правильно располагали на предметном стекле и фильтровальной бумагой удаляли воду вокруг среза. Для более прочного приклеивания парафиновых срезов обезжиренные предметные стекла тщательно смазывали адсорбционной смесью. 5. Для растяжки срезы на предметном стекле помещали в парафиновую ванну TFB 35. 6. Предметные стекла с парафиновыми срезами высушивали. Для этого использовали сушилку с интенсивной циркуляцией TDO 60. 7. Для окрашивания срезов использовали красильный аппарат «Tissue Stainer СОТ 20» со следующей программой: ксилол — ксилол — ксилол ксилол — 100% спирт — 100% спирт —90% спирт — 70% спирт — проточная вода — гематоксилин — гематоксилин — проточная вода — 60 мл 0,03% НС1-95% спирт + 220 мл дистил. Н20— проточная вода -»0,5% эозин —»-0,5% эозин — проточная вода —» 100% спирт — 100% спирт — 100% спирт -» 100% спирт — ксилол — ксилол. В каждом реагенте материал выдерживали 2 мин.
8. Затем окрашенные срезы заключали в консервирующую среду «ПЕРТЕКС», для этого применяли автомат для накрывания предметных стекол с пробами RCM2000.
Другая часть гистологического анализа выполнена в паталогоанатомической лаборатории ЦРБ г. Кимры Тверской области. Микроскопический анализ проводили по общепринятым методикам (Основы общей гистологии..., 1959; Артишевский, Леонтюк, 1999). Приготовление гистологических препаратов осуществляли по следующей схеме (рис. 3.3): 1. Сегменты фиксировали 4% и 10 % растворах формалина. 2. Далее промывали в дистиллированной воде около 1 ч., очень осторожно, чтобы избежать потери ооцитов. 3. Объект обезвоживали с помощью спиртов. Материал проводили через ряд возрастающих концентраций спирта - 60%, 70%, 80%, 90%-растворов и абсолютного спирта. 4. После дегидратации в спиртах образец переносили в смесь равных частей ксилола и абсолютного спирта, а затем в чистый ксилол. Далее материал погружали на несколько часов в смесь парафина и ксилола (при t 37 С), потом на 1-2 ч. в чистый расплавленный парафин (при t 52-56 С), а затем переносили в бумажную форму. Из затвердевшего парафина с заключенным в него образцом вырезали прямоугольный блок с широким основанием, который закрепляли расплавленным парафином на деревянном кубике. 5. Для получения микроскопических срезов использовали санный микротом. Тонкие серийные срезы (5-7 мкм) в виде лент снимали мягкой кисточкой, слегка смоченной водой и переносили на поверхность воды, нагретой до 40 С для расправления. Срезы помещали на воду той стороной, которая была обращена к ножу. Затем их вылавливали на чистое, сухое, обезжиренное предметное стекло; для этого его опускали одним концом в чашку с водой, где находятся срезы, подводили под срез и подхватывали последний, удерживая препаровальной иглой на средней части стекла.
При помощи кисточки срезы правильно располагали на предметном стекле и фильтровальной бумагой удаляли воду вокруг среза. Предметные стекла с парафиновыми срезами высушивали в течение 24 ч. в термостате при 37 С.
Для более прочного приклеивания парафиновых срезов обезжиренные предметные стекла тщательно смазывали смесью белка с глицерином. Нанесенный на стекло тонкий слой смеси нагревали (2-3 раза проводили над пламенем спиртовки).
Гипотезы образования гонадных трубочек
Характер нереста - порционный, так как в нерестовый сезон не были найдены экземпляры с гонадой, опустошенной целиком. Обращает на себя внимание тот факт, что посленерестовые трубочки содержат значительное количество остаточных гамет. Можно предположить, что оставшаяся часть гамет у кукумарии предназначена для вымета через какой-то определенный промежуток времени. Но реализация второго нереста у данного вида не представляется возможной по двум причинам: 1) сразу после нереста у самок начинается резорбция крупных ооцитов при участии питающихся фагоцитов; 2) к моменту завершения нереста у самцов в просветах трубочек остается очень мало невыметанных сперматозоидов (Оганесян, 1996).
О сезоне размножения кукумарии С. frondosa в разных частях ареала в литературе накоплено много данных. Так, в Атлантике, вдоль побережья штата Мэн, начало нереста приходится на середину апреля (Jordan, 1972); на восточном побережье Канады в эстуарии залива Св. Лаврентия - в июне (Hamel, Mercier, 1995), а в заливе Пассамагуодди (Нью-Брансвик) - между апрелем и маем (Lacalli, 1981). У берегов Норвегии, в районе Лофотенских островов голотурии со зрелыми гонадами встречаются в феврале (Mortensen, 1927), а в южных участках, в районе Бергена, в феврале-марте (Nordgaard, 1912). Согласно данным более поздних наблюдений в районе Бергена (Lonning, 1976) наибольшее количество нерестующих особей обнаружено в период с января по март. В Северном море размножение кукумарии происходит с конца февраля до конца марта (Runnstrom, Runnstrom, 1921). У берегов Северной Норвегии нерест наблюдается в апреле-мае (Falk-Petersen, 1982). В районе мыса Святой Нос, юго-восточной части Баренцева моря, кукумария нерестится с февраля по апрель (Оганесян, 1996).
При изучении яичников С. frondosa из района Семи Островов Баренцева моря (Гудимова, 1998) исследователь отметил значительное снижение количества крупных ооцитов в феврале и расценил это как «вспышку нереста, предшествующего основному». Временем следующего нереста был назван июль, когда в гонадах самок также отмечалось резкое уменьшение числа крупных ооцитов. Вероятно, автор ошибочно принял посленерестовую резорбцию ооцитов в летнее время за вымет половых продуктов.
Наши исследования показали, что самки в преднерестовом состоянии в Баренцевом море встречаются с февраля по апрель, со зрелыми гонадами - с апреля по май, поэтому можно предположить, что нерест у некоторых особей в популяциях начинается в марте, а массовости достигает в апреле-мае. Второго нереста мы не обнаружили.
Анализ данных литературы и собственных наблюдений позволяют установить, что в популяциях продолжительность нереста составляет от 1 до 3 месяцев.
Накопление гамет и их рост в значительной степени зависят от наличия запасных питательных веществ в организме, интенсивности поступления питательных веществ из пищеварительной системы, количества доступной пищи. Любая стадия годового репродуктивного цикла, включая размножение гониев, рост гамет и их созревание зависит от внешних условий. Факторы внешней среды могут увеличивать или сокращать длительность репродуктивного цикла (Касьянов и др., 1980).
У кукумарии Баренцева моря восстановление гонад и начало новой волны гаметогенеза осуществляется с июля по октябрь, что совпадает по времени с повышением температуры воды у дна (рис. 2.20, 4.31) и обилием пищи.
В конце осени и в начале зимы в яичниках отмечена мощная резорбция ооцитов различных стадий зрелости. По-видимому, это связано с увеличением температуры придонных вод (рис. 4.31) и минимальным уровнем обеспеченности пищей.
При низких значениях температуры воды, в период гидрологической зимы, у самок происходит накопление и дифференциация гамет.
Роль факторов среды в индуцировании нереста голотурий дискутируется достаточно широко. В качестве потенциальных триггеров нереста рассматриваются температура воды (Tanaka, 1958; Conand, 1993), цветение фитопланктона (Jordan, 1972; Coady, 1973; Himmelman, 1975; Hamel et al., 1993a,b; 1995), интенсивность света (Cameron, Fankboner, 1986), изменение величины интенсивности света по окончании полярной ночи (Oganesyan, Grigorjev, 1998) и наличие спермы или феромонов в толще воды (Касьянов и др., 1980).
На наш взгляд одним из наиболее важных возможных факторов, стимулирующих нерест С. frondosa, является увеличение солнечной радиации, которая приводит к прогреванию поверхностных слоев воды и массовому развитию фитопланктона.
Прогревание поверхностного слоя в Баренцевом море происходит в апреле-мае (рис. 2.20, 4.32) и достигает максимума в августе. В марте начинается весеннее цветение фитопланктона, и к апрелю поверхностные воды почти повсеместно перенасыщаются кислородом (рис. 2.21, 4.33). Вспышка развития фитопланктона в Баренцевом море по времени совпадает с нерестом кукумарии. Весенняя вегетация фитопланктона начинается в марте и достигает максимума в апреле-мае (Vahl, 1980; Бобров, 1985; Рыжов, 1985). Вполне очевидно, что размножение голотурий, имеющих планктонное потомство, должно быть приурочено ко времени обилия фитопланктона в среде. Можно предположить, что время цветения и оседания отмерших водорослей совпадает с периодом оседания молоди С. frondosa, которая получает достаточное количество пищи для выживания.
Кроме информации об особенностях функционирования репродуктивной системы в разные сезоны года и ритме размножения, для популяционных исследований промысловых гидробионтов необходимы знания о плодовитости, как одной из центральных характеристик репродуктивной стратегии вида.
Индивидуальной плодовитостью голотурий, как и любых других морских животных с наружным оплодотворением, следует считать количество ооцитов, выметанное за сезон размножения, которое приходится в среднем на одну половозрелую самку.
Индивидуальная абсолютная плодовитость у среднеразмерных особей с массой кожно-мускульного мешка 150-200 г составила 60-150 тыс. ооцитов на гонаду (Анциферова, 2006). В пересчете на ооциты диаметром 700-900 мкм плодовитость составила 8,6-31,4 тыс. клеток (Gudimova, Antsiferova, 2006).
У С. frondosa с Атлантического побережья Канады плодовитость достигает максимального значения у животных с массой кожно-мускульного мешка 180-250 г и составляет 8-12 тыс. клеток (Hamel, Mercier, 1996а), а у этого же вида из Балсфьорда (Норвегия) годовая продукция яйцеклеток составляет от 1000 до 10000 штук (Falk-Petersen, 1982b). Подобные факты, возможно, отражают различие методов при определении данного параметра, характеризуют разнородность исходного материала, а также предполагают необходимость проверки соответствия всех исследованных образцов одной таксономической единице - С. frondosa.
Необходимо отметить, что относительно невысокая плодовитость у кукумарии, по сравнению с другими донными беспозвоночными, компенсируется наличием планктонной личинки лецитотрофного типа, что, в общем, повышает эффективность размножения этих животных и способствует успешному расселению их потомства.
