Содержание к диссертации
Введение
1. Классификация и химическая структура сапропелей, сапропелеобразователи, биологическая активность и применение сапропелей 6
1.1.Классификация сапропелей 6
1.2. Химический состав органической части сапропеля 11
1.3 .Химический состав минеральной части сапропеля 19
1.4. Массовые виды сапропелеобразователей, их химический состав 27
1.5. Вопросы физиологической активности сапропелей 41
1.6. Применение сапропелей 44
2. Аппаратура и методы исследования 50
2.1. Технический анализ 50
2.2. Элементный анализ 50
2.3. Эмиссионный спектральный анализ 50
2.4. Рентгено-флуоресцентный анализ 51
2.5. ИК-спектроскопия 51
2.6. Спектроскопия УФ- и видимой области 51
2.7. !Н-ЯМР-спектроскопия высокого разрешения 52
2.8. Дифференциально-термический анализ 53
2.9. Экстракция органической массы сапропеля 53
2.9.1. Выделение водорастворимых веществ 53
2.9.2. Выделение битумов 53
2.9.3. Определние группового состава гуминовых веществ 53
2.9.4. Выделение гуминовых кислот 54
2.9.5. Выделение фульвокислот 54
2.10. Определение органических пигментов 54
2.11. Тонкослойная хроматография водного экстракта и фульвокислот 55
2.11.1. ТСХ аминокислот 55
2.11.2. ТСХ углеводов 55
2.11.3. ТСХ водорастворимых карбоновых кислот 56
2.12. Определние биологической активности 56
2.12.1. Определение биологической активности на проростках пшеницы 56
2.12.2. Определние физиологической актвиности 57
2.12.3. Бактерицидная и антигрибковая активность гуминовых препаратов 58
3. Экспериментальная часть 60
3.1.Биотические и абиотические условия формирования карбонатнохарового сапропеля 60
3.2. Исследование химического состава сапропеля и харовых водорослей 64
3.2.1 .Изучение минеральной части сапропеля 65
3.2.2. Элементный состав и термический анализ сапропеля и харовых водорослей 68
3.2.3.Групповой состав органического вещества сапропеля 75
3.3.Исследование химического состава экстрактов сапропеля и харовых водорослей 79
3.3.1 .Водный экстракт 86
3.3.2.Гексановый экстракт 88
3.3.3 .Бензольный экстракт 89
З.З.4 Хлороформный экстракт 90
3.3.5.Ацетоновый экстракт 91
З.З.б.Этанольный экстракт 92
3.3.7. Бензольно-этанольный экстракт 93
3.3.8. Разнополярные экстракты харовых водорослей 94
3.3.9.Исследование гумусовых веществ сапропеля 101
3.4. Н-ЯМР спектроскопия фракций сапропеля и харовых водорослей 107
4. Исследование биологической активности экстрактов сапропеля и харовых водорослей 123
4.1. Физиологическая активность 124
4.2. Бактерицидная и антигрибковая активность гуминовых препаратов 133
4.3 Изучение влияния препаратов фульвокислот, гумата натрия и сухого сапропеля на проростание, всхожесть, силу роста и устойчивость к грибковым заболеваниям семян пшеницы 136
Выводы 140
- Химический состав органической части сапропеля
- Элементный анализ
- Исследование химического состава сапропеля и харовых водорослей
- Бактерицидная и антигрибковая активность гуминовых препаратов
Введение к работе
Возрастающий интерес к изучению сапропелей обусловлен перспективой прямого использования в качестве сырья для химической промышленности, в сельском хозяйстве, в бальнеологии и для получения на их основе биологически активных препаратов.
Сапропели карбонатного типа интересны в связи с исследованиями, показавшими особую ролью ионов кальция в ингибировании денатурации растворенных органических веществ, образующихся после отмирания сапропелеобразователей. Это способствует обогащению сапропеля продуктами полураспада и влияет на химическую и физиологическую активность, как сапропеля в целом, так и его отдельных компонентов.
В изучении сапропелей важной проблемой является поиск корреляций химической структуры сапропелеобразователей с химическими свойствами и биологической активностью донных отложений. Видовое и, следовательно, биохимическое разнообразие сапропелеобразователей внутренних водоемов огромно, что является объективной причиной усложнения исследований формирования тех или иных качеств сапропелей полигенного происхождения.
Объект наших исследований - карбонатно-харовый сапропель, происхождение которого связано с безусловным доминированием одного сапропелеобразователя - харовых водорослей, являются удобным модельным объектом для прояснения некоторых сторон формирования химических и биологических свойств биолита.
Если эффективность применения сапропелей и их экстрактов при лечении некоторых заболеваниях не вызывает сомнения, то вопрос о действующих началах - до настоящего времени остается открытым. В связи с этим в задачу наших исследований, наряду с изучением химических свойств сапропеля, входило выделение различных фракций органического вещества, исследование их химической структуры и оценка биологической активности.
Химический состав органической части сапропеля
«Органическое вещество сапропелеи это комплекс низкомолекулярных органических соединений и биополимеров как в свободном виде, так и в виде гетерополярных солей, комплексно - гетерополярных солей и адсорбционных комплексов с минеральной частью» [10]. Источник ОВ -нерастворимые остатки гидробионтов и коллоидные вещества автотрофного происхождения и привнесенные в составе терригенного стока. Классифицируя формы ОВ биолитов, одни исследователи рассматривают сапропель как подводную форму гумуса [11], другие обособляют гумусы почв, торфа и сапропелей, считая их различными по происхождению формами накопления ОВ [12]. И, хотя в ОВ сапропеля имеются все составляющие гумуса (вещества исходных органических остатков, промежуточные продукты их трансформации и специфические ГВ с их органо-минеральными производными), часто для обозначения этой части сапропеля применяют термин «органическая компонента», а ОВ сапропеля рассматривают как сочетание органической и биологической компонент [13]. В различных типах сапропелей общее количество ОВ колеблется в пределах: в органических - 70 -93%, кремнеземистых и карбонатных -15 -60%, смешанных - 43 -58%. Г.А. Евдокимовой [14], на основании изучения элементного состава сапропелей 130 месторождений Белоруссии, было выявлено, что колебания содержания С, Н и N в пределах одного типа обусловлены участием в формировании отложений разных сапропелеобразователей. Повышенное содержание С и пониженное Н и N наиболее характерно для отложений, образовавшихся при значительном участии растений -торфообразователей и содержащих 40-60 % ГВ. При возрастании доли зоогенных остатков в сапропелях количество Н и N увеличивается, С уменьшается. Содержание S в ОВ сапропелей изменяется от 0.1 до 1.8 % (не более 3 % на сухое вещество). При промышленной заготовке и хранении сапропеля соединения S окисляются и это повышает обменную кислотность озерных илов [15, 16]. Наиболее высокий уровень серы в ОВ карбонатных сапропелей. Путем фракционирования ОВ определяют его групповой состав. По традиционной схеме из высушенного и измельченного сапропеля последовательно извлекают битумы (липиды) спирто-бензольной смесью (1:1), из дебитуминизированного сапропеля горячей водой извлекают легкогидролизуемые вещества, а щелочью, после декальцирования -специфические ГВ. Остаток подвергают гидролизу концентрированной минеральной кислотой для извлечения трудногидролизуемых веществ.
В модификации Евдокимовой и Пунтус [14] перед извлечением липиднои фракции сапропели декальцируют 0.05 н раствором НС1. Битумы (липиды) это - органические вещества, извлекаемые из сапропеля органическими растворителями. Состав битумов характеризуется содержанием жирных кислот, фталиевых эфиров, стероидов, каротиноидов, порфиринов, восков, глицеридов [17]. Г.А. Евдокимова и М.З. Лопотко [9,14] описывают извлечение битумов бензолом или бензином после декальцинирования сапропелей соляной кислотой. По результатам этих исследований бензиновые битумы сапропелей по ряду показателей идентичны торфяному битуму, однако число омыления меньше аналогичного показателя битумов торфа в 1.5-2 раза. Это свидетельствует о большей молекулярной массе жирных кислот, входящих в состав сапропеля, что подтверждается ИК-спектроскопией. Наиболее интенсивные полосы поглощения в ИК-спектре 2920; 2850; 1470 см"1 свидетельствуют о наличии углеводородных радикалов длинноцепочечного строения, дуплет 730-720 см"1 - о высокой степени упорядоченности метиленовых групп. По данным Н.А. Курмышевой [18] при хранении сапропелей в поле в течение 2х месяцев количество битумов в них возрастает в 1.5 раза. Битумным компонентам сапропелей уделяется особое внимание в связи с тем, что они обладают наиболее высокой бактерицидной, бактериостатической и антиокислительной активностью [19, 20]. Это определяет необходимость разработки доступных и эффективных методов извлечения битумов из сапропелей. Битумы пелоидов входят в состав малопреобразованного ОВ, которое содержит большое число двойных связей и функциональных групп (каротины, фосфолипиды, ненасыщенные жирные кислоты, спирты). Исследованиями Е.И.Казакова [21] установлены различия группового состава ОВ сапропелей различных природных зон. Отложения степной зоны и зоны смешанных лиственных лесов дают выход битума 0.3- 0.9 % на сухой образец и до 3.9 % на органическую массу. Сравнительно высокий выход битумов дают сапропели хвойных лесов (5.1-6.4 % и 7.7.-9.0 %) и зона смешанных лиственных лесов (1.5-6.4 % и 5.5- 10.6 %). Содержание битумов в различных местах каждого из отложений оказалось неодинаковым. Выход битумов из сапропелей ниже, чем из торфов [22]. Элементный анализ показал следующий состав органической массы битумов: содержание Н для большинства образцов составляет 6-7%, наибольшее содержание Н оказалось в сапропеле Ленинградской области (7.47%), а наименьшее в низкозольных сапропелях Кубанской (5.4%) и Харьковской (4.8%) областях. Все образцы сапропелей показали высокое содержание N (3.1-5.2%), превышающее содержание N в торфах (до 3.0%), бурых и каменных углях (0.3-1.5%). Содержание S в исследованных сапропелях колеблется от 0.53% до 3.13%. Битумы сапропелей состоят главным образом из предельных соединений с небольшой примесью ненасыщенных (низкие йодные числа). От битумов торфов битумы сапропелей отличаются более низкими числами омыления и кислотности. Это указывает на то, что в их состав входят соединения нейтрального характера - углеводороды [21]. Углеводы сапропелей. С помощью гидролиза горячей водой, разбавленной соляной и концентрированной серной кислотами из сапропеля извлекаются легкогидролизуемые и трудногидролизуемые углеводы. Для сапропелей характерно низкое содержание углеводного комплекса, так как в ходе сапропелеобразования активно идут процессы распада углеводов до углекислого газа и гумификации с образованием ГВ по реакции конденсации с аминокислотами. Содержание гемицеллюлоз составляет в среднем 6-25% на ОВ, целлюлозы -1-8 % [6]. В работе М.З.Лопотко и ГА. Евдокимовой [9] углеводы сапропелей Белоруссии были исследованы в 150 сапропелях различных типов. Гемицеллюлозы составляют 80% от суммы Сахаров.
Содержание моносахаридов в составе легкогидролизуемых веществ находится в пределах 6-8% , количество гексоз достигает 42-78% от суммы Сахаров, галактозы и маннозы 6-45%, ксилозы 25%. Идентифицированы глюкоза 11-52%, арабиноза и рамноза 6-25%. Сапропели бедны целлюлозой составляющей, в среднем, 1-2%. Углеводный комплекс сапропелей, состоящий на 80% и более из гемицеллюлоз, предопределяет возможность получения на основе сапропелей кормовых средств и удобрений [9]. ГВ сапропелей. Содержание и состав ГВ определяют такие важные свойства сапропелей как биологическая активность, биохимическая устойчивость, клеящая способность и другие. В зависимости от содержания и соотношения специфических ГВ, внесенные в почву сапропели, могут по-разному влиять на биохимические процессы, формирование структуры почв и качество получаемой сельскохозяйственной продукции [23]. ГВ сапропелей отличаются от гумуса почв более высоким соотношением Н/С и отсутствием конденсированных ароматических колец [10]. Следовательно, это более молодые и более восстановленные ГВ, которые обладают большей активностью по сравнению с ГВ почвы. В состав специфических ГВ сапропелей входят: гуминовые кислоты (ГК), фульвокислоты(ФК) и гематомелановые кислоты (ГМК). Выделение ГВ из комплекса сопутствующих минеральных и органических соединений сапропелей, большинством исследователей проводится по, ставшей классической, схеме Тюрина - впервые примененной в исследованиях химии почв в начале прошлого века [24]. Ее суть состоит в: декальцинировании, с целью удаления карбонатов исследуемого образца, разбавленными растворами минеральных кислот; исчерпывающем экстрагировании ГВ 0.1 н раствором NaOH; последующем разделении ГК (выпадают в осадок в виде геля) и ФК (остаются в растворенном виде) в кислом растворе при рН 1-2; экстрагировании из нерастворимого в кислотах осадка (геля) органическими растворителями ГМК. Изложенная схема привлекает простотой исполнения, однако методам растворения и осаждения природных полимеров присущ объективный недостаток - присутствие в гелевой фазе заметных количеств низкомолекулярных компонентов - углеводы, спирты, аминокислоты, так называемый "хвостовой эффект".
Элементный анализ
Элементный анализ нативного сапропеля и его фракций - битумов, гуминовых веществ, а также основных сапропелеобразователей - харовых водорослей, макробентоса, выполнялся на автоматическом С, Н, N анализаторе фирмы «Карло Эрба» модель 1100. Условия анализа: Температура в реакторе сжигания 1100С; набивка реактора -Сг2Оз/СиО; газ-носитель - Не. Температура в восстановительном реакторе 650С; набивка — медная стружка. Температура колонки - 127С; фаза-хромосорб-102. Детектор - катарометр по теплопроводности. Окислитель — AgMn04; стандарт - 9-нитроантрацен. 2.3. Эмиссионный спектральный анализ Эмиссионные спектры золы исследуемого сапропеля были сняты на спектрографе ИСП-30 с кварцевым трехлинзовым конденсором. Электроды угольные, безборные, выточенные в форме рюмочки (ЧССР). Дуговой промежуток 1.5 мм; ширина щели спектрографа 10 мкм; пластинки спектрографические, тип ЭС, проявитель - контрастный, метол-гидрохиноновый, экспозиция 10 мин. Расшифровка спектрограмм осуществлялась с помощью атласа спектров, прилагаемого к прибору. Фотометрирование плотности почернения линий элементов для полуколичественной оценки их содержания проводилось на микрофотометре типа МФ-2. 2. 4. Рентгено-флуоресцентный анализ Рентгено-флуоресцентный анализ минеральной части сапропеля, ГП выполнялся на спектрометре рентгеновском многоканальном флуоресцентном СРМ-25 (ГОСТ 15150-69) способом разложения рентгеновского излучения в спектр кристаллофракционный с применением кристаллов — анализаторов по схеме Иогансена и отдельных по схеме Иогана. Источником рентгеновского излучения служит рентгеновская трубка типа 3 PXB2-Rh. Режим работы трубки: Ua = 40 KV; Ja = 20 mA. Процесс анализа полностью автоматизирован с момента установки пробы до выдачи результатов анализа на ленте печатающего устройства. 2. 5. ИК-спектроскопия ИК — спектры исходного сапропеля, экстрактов, гуминовых веществ снимались на спектрофотометре NICOLET - 400 D в порошке КВг (таблетка КВг = 3 мм). Спектральная область 100 - 4000 см . Отнесение полос поглощения в ИК-спектрах проводилось в соответствии с литературными данными [158-176]. 2. 6. Спектроскопия УФ- и видимой области Спектры в УФ- и видимой областях снимались на спектрофотометрах «Спекорд М 40» (ГДР) и СФ-46 в растворе спектрально чистых гексана, бензола, хлороформа, ацетона и этанола. Для гуминовых кислот растворитель 0.1н NaOH. Концентрация растворов составляла 10"3 - 10"4 моль/л.
Кюветы кварцевые, длина рабочей грани 2 и 10 мм. Спектральная область 200 - 800 нм. Режим экстинкции. Интерпретация электронных спектров проводилась в соответствии с литературными данными [177-183]. 2. 7. !Н-ЯМР спектроскопия высокого разрешения !Н-ЯМР спектры исследуемых образцов регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP-80SY (Брюккер, ФРГ) с рабочей частотой 80 МГц в режиме подавления сигналов протонов растворителей. Образцы для съемки спектров !Н-ЯМР готовили путем растворения препаратов в дейтерохлороформе или в растворе дейтерированной щелочи в тяжелой воде. Последние подвергали дополнительному дейтериообмену, для чего полученные растворы препаратов сушили от тяжелой воды под вакуумом на водяной бане при температуре около 90 С, с последующим растворением сухого остатка в тяжелой воде. Химические сдвиги в спектрах Н-ЯМР приведены относительно химических сдвигов сигналов протонов в дейтерированных растворителях (для дейтерохлороформа 5 = 7.25 м. д. для тяжелой воды 8 = 5.00 м. д. при рН 2). Отнесение резонансных сигналов в спектрах Н-ЯМР исследуемых образцов к функциональным группам проводили по методике [184]. Среднестатистическую длину алкильных радикалов в исследуемых образцах рассчитывали путем анализа интегральных интенсивностей сигналов протонов метальных и метиленовых групп. Среднестатистическую разветвленность алкильных радикалов оценивали по относительному содержанию сигналов протонов метиновых групп. При расчете количества протонов метиленовых и метиновых групп за основу брали интегральную интенсивность сигналов протонов метальных групп. Дериватограммы снимались на дерифатографе Q-1500 (Венгрия). Навеска пробы 500 мг. Начальная температура 20 С, конечная — 1000 С. Скорость подъема температуры 10 С / мин. Масштабы: TG -500; ДТА — 500;ДГС-500. 2.9. Экстракция органической массы сапропеля С целью изучения ОМ сапропеля выделялись фракции: водорастворимые, битумы и гуминовые вещества. Разделению подвергалась воздушно-сухая проба. 2.9.1. Выделение водорастворимых веществ Экстракция проводилась дистиллированной водой в аппарате і Сокслета. 2.9.2. Выделение битумов Последовательная экстракция сапропеля осуществлялась в аппарате Сокслета следующими растворителями: гексан; бензол; хлороформ; ацетон; этанол при температуре кипения растворителя. Отдельная навеска сапропеля экстрагировалась бензол-этанольной смесью (1:1 об.). І і Групповой состав гуминовых веществ определялся по методике [185]. Препараты гуминовых кислот (ГК) выделялись исчерпывающим экстрагированием 0.1 н. NaOH после декальцирования проб сапропеля 0.1 н. НС1. Полученную вытяжку центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин. и осаждали ГК 10% НО, доводя рН до значения 1-2. Осадок ГК отделяли от раствора фульвокислот (ФК) центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 5 минут. ГК промывались дистиллированной водой в центрифужных пробирках до первых признаков растворения и высушивались под вакуумом при температуре не более 40 . 2.9.5. Выделение фульвокислот Жидкий препарат ФК получали из фильтрата после выделения ГК путем доведения рН до 5-6 и сгущения на роторном испарителе. 2.10. Определение органических пигментов Содержание хлорофиллов а и Ь, каротиноидов определялось по # модифицированным методикам [186]. Навеска экстракта экстрагировалась ацетоном. В случае если проба представляла собой твердое вещество, она растиралась в агатовой ступке с мелом и ацетоном. Экстракция повторялась 3-4 раза небольшими порциями ацетона до обесцвечивания растворителя.
Экстракты объединялись, фильтровались в мерную колбу емкостью 50 мл и объем доводился растворителем до метки. После тщательного перемешивания измерялась оптическая плоность раствора в кварцевой кювете с рабочей длиной 10 мм на спектрофотометре СФ-46 при 644, 662 и 440,5 нм. В качестве сравнительной пробы использовался ацетон. Содержание хлорофиллов a, b и каротиноидов (мг/л) рассчитывалось по формулам: CXJI.a = 9,784D662-0,99D644 С хл. ь = 21,426 D644 - 4,650D662 -каротиноидов — 4,0:0 L/440,5 — v,2oo (U хл. a " " хл. b/ I 2.11. Тонкослойная хроматография (TCX) водного экстракта и фульвокислот 2.11.1. TCX аминокислот ТСХ аминокислот осуществлялось на неактивированных пластинках «Силуфол» (ЧССР) размером 10x10 см в двух системах элюентов: Изопропанол - вода (1:1), об. Изопропанол - 25 %-ный водный раствор аммиака (7:3), об. Длина пробега смеси растворителей 10 см. Хроматографирование проводилось после насыщения камеры парами растворителей. Проявление пластин: 1 %-ный ацетоновый раствор нингидрина. 2.11.2. ТСХ углеводов ТСХ углеводов осуществлялось на неактивированных пластинках «Силуфол» (ЧССР) размером 10x10 см в двух системах элюентов: н-Пропанол - вода - метилэтилкетон (2:2:1), об. н-Пропанол - метилэтилкетон - вода — 25 %-ный водный раствор аммиака (20:10:11:1), об. Длина пробега смеси растворителей 10 см. Хроматографирование проводилось после насыщения камеры парами растворителей. Проявление пластин: а) аммиачный раствор AgN03, с последующим выдерживанием в термостате при 150 С; б) анилин - дифениламин - о-фосфорная кислота, с последующей выдержкой в термостате при 80 С. ТСХ водорастворимых карбоновых кислот проводилось на неактивированных пластинках «Силуфол» (ЧССР) размером 10x10 см в системе следующих элюентов: Бензол - метанол - уксусная кислота (45:8:4), об. Бензол — этанол - 25 %-ный водный раствор аммиака (2:4:1), об. Этанол — вода - 25 %-ный водный раствор аммиака (25:3:4), об. Длина пробега смеси растворителей 10 см. Хроматографирование проводилось после насыщения камеры парами растворителей. Проявление пластин: а). 0.5 %-ный раствор бромкрезолового пурпурного; б). 1 %-ный раствор прочного синего Б; в). 0.5 %-ный раствор бромтимолового синего. Идентификация осуществлялась с помощью калиброванных растворов стандартных соединений. 2.12,Определение биологической активности 2.12.1. Определение биологической активности на проростках пшеницы Эксперимент проводили в лабораторных условиях по общепринятой методике [187]. Семена проращивались в термостате при температуре 28 С в рулонах фильтровальной бумаги.
Исследование химического состава сапропеля и харовых водорослей
Изучаемый сапропель в исходном состоянии имеет черный, местами серый цвет, содержит большое количество крупинок карбонатных отложений, обладает специфическим запахом харовых водорослей. В толще отложений (0.6 м) рН - 7.4 , зольность с учетом карбонатов — 75 %. Общая схема изучения сапропеля, его органической массы и доминирующего сапропелеобразователя - Chara contraria представлена на рис.3.2.1. 3.2.1. Изучение минеральной части сапропеля Количественным рентгено-флуоресцентным анализом определен химический состав минеральной части. Основной компонент прокаленной части сапропеля - СаО (52.5%, табл. 3.2.1.1) По литературным данным, его содержание в сапропелях карбонатного типа колеблется в пределах 15 - 80%. Карбонатный материал донных отложений может иметь полигенную природу [9,13,195]. Минералогической формой Са в изучаемом сапропеле является кристаллический кальцит (более 90% кристаллической части), образующийся за счет жизнедеятельности хары, аккумулирующей до 1.19 кг минерального вещества на м 2 зарослей за год [193]. Участие харовых водорослей в биотическом круговороте кальция озерных экосистем весьма значительно, особенно в тех случаях, когда они образуют сплошные заросли [113]. В процессе фотосинтеза харовые используют как свободную СОг, так и бикарбонатные ионы. При использовании последних происходит инкрустация поверхности таллома карбонатами кальция и магния, обогащающими донные отложения при отмирании водорослей [196]. При повышенной кислотности донных осадков накопления карбонатов в них может не происходить, как, например, в мелководном, зарастающем макрофитами, оз. Неро [1]. Накоплению кальцита в исследуемом сапропеле способствует его нейтральная реакция (рН 7.27). Значение отношения Si02/Al203 в золе изучаемого сапропеля равно 1, что может свидетельствовать о минимальном влиянии терригенного стока, способного изменить это соотношение с внесением глинистых и песчаных минералов до 2.3 -9.8 [9,197]. Сумма SiCb и БегОз не превышает содержания остальных компонентов золы, что характерно для сапропелей с высоким содержанием карбонатов. Отношение Si02/CaO, равное 0.05, находится в пределах значений 0.2-0.02, характерных для карбонатных сапропелей разных месторождений, в то время как для органических сапропелей это отношение достигает 8.6 и 9-20 - для кремнеземистых. Эмиссионным спектральным анализом в составе минеральной части были идентифицированы следующие элементы: основа золы Са, Mg, Fe; в значительном количестве обнаружены А1, Си; в небольшом Cr, Ni, Sr, Zr, Ті, Мп, в следовых количествах присутствуют - Sn, Со, V, Be, Sc, Pb, P. Исследование элементного состава сапропеля и его основных образователей, дающее представление о среднем составе ОВ и характере его генезиса, проводили на С, Н, N анализаторе «Карло-Эрба 1100».
Результаты, полученные в масс. %, пересчитывали в атомные проценты, т.к. более объективное представление о роли отдельных элементов в построении вещества можно получить только с использованием атомных долей [28,61]. Кроме этого, оперирование элементным составом в двух выражениях расширяет круг сопоставимых литературных данных. Содержание С, Н и N органического вещества карбонатно - харового сапропеля (табл.3.2.2.1.) находится в довольно широких пределах, характерных для разных типов сапропелей [ 9,13,195]. Из приведенных в таблице данных следует, что ОВ карбонатно -харового сапропеля в два раза менее гидрировано, чем ОВ карбонатно — макрофитного и кремнеземистого сапропелей и близко по этому показателю к низинному осоковому торфу. По насыщенности азотом (C/N) исследуемый сапропель в 2-3 раза превосходит сравниваемые сапропели и близок к осоковому торфу. Величина элементных отношений C/N, С/Н, Н/С определяется соотношением видов-образователей сапропелей. Из полученных нами результатов следует, что наибольшее сходство с карбонатно-харовым сапропелем по содержанию элементов и их соотношению обнаруживают хара и мох. Участие хары в формировании ОВ сапропеля превалирующее, по сравнению со мхом и зообентосом [193]. Некоторое различие сапропеля и хары в содержании элементов и их соотношении объясняется тем, что сравнивается ОВ разное по степени преобразованности: преимущественно постмортального характера ОВ - сапропеля и прижизненное ОВ — хары. Элементные отношения органического вещества хары имеют большое сходство (по масс.%) с соотношением элементов клеток гриба Aspergillus niger (С/Н-12.4; C/N-20.7; Н/С-0.08) [198] и его хитин -глюканового комплекса (C/N-7.4; Н/С-0.14) [199]. Судя по имеющимся литературным данным, биохимическое сходство с грибами может быть обусловлено наличием в клеточных стенках харовых водорослей веществ хитин-глюканового комплекса [97]. Продуцирование харовыми водорослями и зообентосом (бокоплавы, личинки насекомых) азотсодержащих полисахаридов — линейных полимеров N-ацетилглюкозамина (см. раздел 3.4.), относительно устойчивых к разложению в анаэробных условиях [61], объясняет установленную для ОВ карбонатно-харового сапропеля значительную степень насыщения азотом. Результаты термографического анализа сапропеля и харовых водорослей представлены на рис.3.2.2.1. и в таблице 3.2.2.2. Разбор кривых дифференциального термического анализа (ДТА) и термовесового анализа (ТВ) сапропеля и харовых водорослей (рис.3.2.2.1.) проведен в соответствии с несколькими диапазонами температур, обычно рассматриваемых в термографическом анализе биолитов: до 400, 400 -500, 500 - 700 и более 700 [9,10, 202, 203, 204].
Слабый эндоэффект в интервале 140 — 180, характерный в более ярком выражении для сапропелей других типов [9], наблюдается только на ДТА декальцинированного сапропеля. ДТА нативного харового сапропеля в области до 200 имеет вид резко восходящей линии без эндоэффекта. Эту особенность можно объяснить значительной карбонизацией нативного харового сапропеля и более высокой, в сравнении с другими сапропелями, термоустойчивостью его веществ алифатической и углеводной групп, подвергающихся термолизу в этом диапазоне температур. ДТА нативного и декальцинированного препаратов сапропеля в области до 500 представлены большим, резко нарастающим экзоэффектом с максимума при 380 и 500 и незначительным эндоэффектом при 440. Нарастающая область полученных ДТА обусловлена сливающимися экзоэффектами термолиза гемицеллюлоз (230-265), целлюлозы (300-320) и начала распада гуминовых веществ (340 — 380). Для кривых ДТА сапропелей органического, известкового и кремнеземистого типов характерно наличие большого эндотермического эффекта (400—470), обусловленного термоконденсацией гуминовых веществ, битумов и других с образованием смол [9]. На исследованных препаратах харового сапропеля этот эффект сдвинут в сторону повышенных температур с максимумом при 530, что может свидетельствовать о значительной термоустойчивости компонентов изучаемого сапропеля. На кривой ДТА в области более 700 С наблюдается интенсивный эндотермический эффект связанный с разложением карбонатов до оксидов Ca, Mg и СОг при температурном максимуме 885. Поскольку с разложением карбонатов выделяется газообразный ССЬ этот процесс сопровождается потерей массы образца сапропеля в 56 %. Кривая ДТА нативного препарата харовых водорослей в интервале температур до 200 имеет крутой подъем без отдельных пиков, термолиз приводит к потере 4.8% массы образца, что связано с потерей адсорбированной воды и началом деструкции органического вещества. В интервале температур 200-500 наблюдаются термоэффекты характерные для термолиза полисахаридного комплекса [9,205]. Распад целлюлозы и гемицеллюлоз обуславливает эндоэффект с максимумом при 340, слабый эндоэффект при максимуме 420, по-видимому, обусловлен конденсацией ароматических веществ харовых водорослей пигментной природы. В области высоких температур (500 и более 700) характер ДТА харовых водорослей проявил большое сходство с той же частью ДТА нативного сапропеля со сравнительно близким уровнем потери массы образцов. Это сходство в значительной мере обусловлено высокой долей механических примесей карбонатов (мергеля) осаждаемых харовыми водорослями. ДТА препарата харовых водорослей с разрушенными карбонатами имеет вид плавной кривой единственного обширного экзоэффекта с максимумом при 500.
Бактерицидная и антигрибковая активность гуминовых препаратов
Гуминовые препараты карбонатно-харового сапропеля: водный экстракт (ВЭ), ФК, ПС и гумат натрия тестировались на бактериальную активность и антигрибковую активность в отношении ряда микроорганизмов по унифицированным методам [190]. Тестирование проводили на стандартных культурах: условно-патогенных бактерий - золотистого стафиллококка (Staphilococ aurelis) и кишечной палочки (Ecsherichia coli); патогенных бактериях, требующих для своего роста азотного питания — коринебактериях дифтерии, листерии и возбудителя микоза человека и животных — кандида альбиканс. Анализ результатов тестирования гуминовых препаратов харового сапропеля показал их разнокачественное влияние на бактериальные и грибковый тест-объекты (табл 4.2.1.). ВЭ и ФК проявили явное бактериостатическое действие относительно золотистого стафилококка и кишечной палочки. При этом ВЭ оказался более бактериостатичен, чем ФК. Это подтверждает литературные данные относительно бактериостатичности отдельных типов сапропелей по отношению к коли-бактериям. Объяснением тому может служить способность этой группы бактерий адаптироваться к существованию в факультативно-анаэробных условиях донных отложений [207]. ГК и гумат натрия не проявили активности относительно культуры кишечной палочки и стафилококка, интенсивность роста которых не имела статистически достоверных отличий от контрольного варианта. Отмечается значительное увеличения роста колоний дифтерийной палочки и листерии на средах с добавлением ГК и гумата натрия. Это согласуется с неоднократно упоминаемыми в литературе, фактами использования ГК патогенными бактериями-нитрофилами. Способность свободноживущих микроорганизмов нитрофилов усваивать азот и углерод гуминовой кислоты доказана с использованием масс-спектроскопии [232]. Усиление роста патогенных бактерий на средах обогащенных гуминовыми кислотами и гуматами может быть использовано в практике конструирования новых более дешевых питательных сред для диагностики инфекционных заболеваний. Тестирование показало, что ГК поддерживают рост культуры гриба-кандида, а гумат натрия оказывает противоположное действие -антигрибковое. Это соответствует результатам специальных исследований антигрибковой активности гуминовых препаратов [233], показавших отсутствие ее у ГК и максимальное проявление у натриевых, калиевых и аммонийных солей гуминовых кислот в концентрации 0.4-3%.
Гуминовые препараты харового сапропеля проявили типичную для многих типов сапропелей бактериальную и антигрибковую активность: -ФК и водный экстракт - бактериостатичны для условно патогеннных бактерий золотистого стафилококка и кишечной палочки; - ПС и гумат натрия поддерживают рост патогенных бактерий дифтерийной палочки и листерии как источники их азотного и углеродного питания; - ГК поддерживают рост культуры гриба-кандида, а гумат натрия оказывает противоположное действие - антигрибковое. 4.3. Изучение влияния препаратов ФК, гумата натрия и сухого сапропеля на прорастание, всхожесть, силу роста и устойчивость к грибковым заболеваниям семян пшеницы Результаты десятисуточного эксперимента по испытанию биологической активности гумата натрия, ФК и сухого сапропеля, наиболее часто применяемых в сельскохозяйственном производстве приведены в таблице 4.3.1. Анализ полученных результатов показал, что все испытуемые препараты оказывают некоторое ингибирующее действие на энергию прорастания семян (85-86%), особенно - ФК (66%). При этом по истечении 3 суток под влиянием всех препаратов, кроме контроля (вода), наблюдалось торможение развития корневой системы и формирования проростков. Отставание в росте, по-видимому, связано с токсическим действием, которое оказывают препараты на молодые проростки. Сильнее всего это проявилось в растворе ФК, в которых линейные параметры проростков имели величину всего 46% от контрольного варианта. По истечении пяти суток самая высокая всхожесть отмечена в растворах гумата натрия, при этом линейные параметры проростков оказались также максимальными, на 70% превышающие контроль. В варианте с сапропелем наблюдалось максимальное заболевание (31.3%) семян. Оценка силы роста молодых растений пшеницы по истечении 10 суток эксперимента показала значительный уровень этого показателя для всех испытуемых препаратов, на 10-20% превышающий контрольный вариант, при этом заболеваемость семян оказалась минимальной. Только на 3-4% семян были отмечены незначительные пятна плесени. Таким образом, все испытанные препараты оказывают некоторое ингибирующее действие на начальном этапе прорастания семян. Эти свойства препаратов, особенно сильно проявившееся у ФК соответствуют литературным данным [9,13]. Максимальное стимулирование всхожести семян раствором гумата натрия подтверждает высокую биологическую активность гуматов [13]. Низкая БА препарата высушенного сапропеля объясняется необратимой каогуляцией части органических веществ, в связи с чем, применяемый для мелиорации сельскохозяйственных земель сапропель рекомендуется вносить во влажном коллоидном состоянии, не допуская его высушивания.
Впервые эти факты установлены для белорусских сапропелей и сапропелей озер Ярославской области [13]. Выводы к главе 4 1. Изучение биологической активности препаратов гуминовой, водной и липидных фракций карбонатно-харового сапропеля проведено впервые, подтверждены выводы других исследователей о наличии в составе пелоидов комплексов гормоноподобных веществ. 2. Впервые установлена разнонаправленная гормональная активность отдельных препаратов карбонатно-харового сапропеля, что свидетельствует о возможности фракционирования ОВ пелоида с целью получения препаратов направленного физиологического действия. 3. Водный экстракт сапропеля, растворы гумата натрия, этанольного, хлороформного и бензольно-этанольного экстрактов сапропеля проявляют меланоцито-стимулирующую активность. Гормоноингибирующее действие проявляют растворы фульвокислот, гексанового, бензольного и ацетонового экстрактов сапропеля. Растворы комплекса свободных гуминовых веществ не проявляют гормональной активности. 4. Фульвокислоты и водный экстракт бактериостатичны для условно патогеннных бактерий золотистого стафилококка и кишечной палочки. ГК и гумат натрия поддерживают рост патогенных бактерий дифтерийной палочки и листерии как источники их азотного и углеродного питания и могут использоваться в качестве наполнителя питательных сред для диагностики инфекционных заболеваний. 5. ГК поддерживают рост культуры гриба-кандида, а гумат натрия оказывает противоположное действие — антигрибковое, что может служить основой для изготовления антигрибковых медицинских препаратов. 6. В целом, гуминовые препараты харового сапропеля проявляют разнонаправленную бактериальную и антигрибковую активность, что имеет большое практическое значение в экспериментальной микробиологии, санитарии и бальнеологии. 7. Эксперименты на прорастающих семенах пшеницы показали высокую, стимулирующую рост проростков, активность и антигрибковые свойства гумата натрия, а также противоположный характер активности ФК. В связи с этим, для внесения под сельскохозяйственные культуры лучше вносить сапропель, сохранивший коллоидную структуру органического вещества, биологическая активность которого значительно снижается при высушивании.
