Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Экология, физиология и биохимия рода солодка - Glycyrrhiza L. 9
1.1. История изучения Glycyrrhiza L. 9
1.2. Ботанико-географическая характеристика рода Glycyrrhiza L. 12
1.2.1. Ареал произрастания рода Glycyrrhiza L. 12
1.2.2. Морфологические особенности видов рода Glycyrrhiza L. 14
1.2.2.1. Ботаническая характеристика G. korschinskyi Grig. 14
1.2.2.2. Ботаническая характеристика G. glabra L. 16
1.2.2.3. Ботаническая характеристика G. echinata L. 17
1 1.3. Биологически активные вещества растений Glycyrrhiza L. 18
1.3.1.Биологическая роль вторичных метаболитов растений рода Glycyrrhiza L. 18
1.3.2. Тритерпеновые гликозиды Glycyrrhiza L. 19
1.3.З.Фенольные соединения Glycyrrhiza L. 21
1.4. Эколого-физиологический контроль накопления вторичных метаболитов 27
1.4.1. Абиотические факторы 27
1.4.1.1. Географическая и экологическая изменчивость фе-нольных соединений 27
1.4.1.2. Влияние уровня освещенности на накопление вторичных метаболитов 28
1.4.1.3. Влияние гидротермических факторов 30
1.4.2. Влияние биотических факторов 33
1.4.2.1. Эколого-ценотические условия 33
1.4.2.2. Роль лектинов и фенольных соединений в симбиотических взаимоотношениях солодки с клубеньковы ми бактериями Rhizobium 34
1.5. Биологические особенности и методы прорастания семян Glycyrrh izaL. 36
1.6. Применение растений рода Glycyrrhiza L. 40
1.6.1. Применение Glycyrrhiza L. в медицине 40
1.6.2. Применение Glycyrrhiza L. в промышленности 48
1.6.3. Применение Glycyrrhiza L. в сельском хозяйстве 49
Глава 2. Объекты и методы исследований 52
2.1. Выделение эколого-фитоценотических градиентов распределения природных ценопопуляций Glycyrrhiza korschinskyi Grig. 52
2.1.1. Почвенно-климатические условия 52
2.1.2. Фитоценотические условия 56
2.2. Отбор растительного материала 58
2.2.1. Полевые исследования 58
2.3. Анализ растительного материала 59
2.3.1. Морфофизиологические показатели 59
2.3.2. Биохимические анализы 61
2.3.2.1. Биохимический состав и зольные элементы растений 61
2.3.2.2. Определение суммы флавоноидов 62
2.3.2.3. Определение глицирризиновой кислоты 63
2.3.2.4. Определение антиоксидантной активности экстрактов Glycyrrhiza glabra L., Glycyrrhiza korschinskyi Grig., Glycyrrhiza echinata L. 64
2.3.2.5. Определение лектинов 66
2.4. Предпосевная обработка семян солодки 66
2.5. Статистическая обработка данных 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Ресурсы солодки Коржинского в Башкирском Зауралье 68
3.2.Эколого-фитоценотическая характеристика солодки Коржинского- Glycyrrhiza korschinskyi Grig. 74
3.2.1. Синтаксономический анализ G. korschinskyi Grig. 74
3.2.2. Адаптивная стратегия G. korschinskyi Grig. 79
3.2.3. Ценопопуляционный анализ G. korschinskyi Grig . 81
3.3. Анализ морфофизиологических показателей G korschinskyi Grig. 101
3.4. Изменчивость накопления флавоноидов и тритерпеновых глико-зидов G. korshinskyi Grig, в различных эколого-ценотических градиентах 105
3.5. Сравнительная характеристика роста, развития и накопления флавоноидов G korshinskyi в зависимости от эдафических факторов 110
3.6. Интродукция солодки Коржинского и щетинистой в Республике Башкортостан 118
3.6.1 Предпосевная обработка семян солодки 118
3.6.2. Развитие растений в условиях Южного Урала 121
3.7.Сравнение результатов интегральной биологической оценки экстрактов G. korshinskyi Grig., G. glabra, G. echinata 124
3.7.1 Лектины 124
3.7.2. Оценка антиоксидантной активности трех видов солодки . 126
Заключение 131
Выводы 132
Литература 139
Приложение 161
- Тритерпеновые гликозиды Glycyrrhiza L.
- Почвенно-климатические условия
- Ценопопуляционный анализ G. korschinskyi Grig
- Оценка антиоксидантной активности трех видов солодки
Тритерпеновые гликозиды Glycyrrhiza L.
Многогранный спектр применения солодки обусловлен содержанием в различных частях растения биологически активных соединений, которые включают в себя две большие группы (Аммосов, Литвиненко, 1995). Первая группа соединений в основном представлена тритерпеновыми сапонинами, преимущственно производными глицирретиновой кислоты, а именно ее гли-козидом - глицирризиновой кислотой. Вторую группу биологически активных веществ солодки составляют фенольные соединения - флавоноиды и изофлавоноиды.
Глицирризиновая кислота - является одним из основных биологически активных КОМПОНеНТОВ КОрНЯ СОЛОДОК Glycyrrhiza glabra L., Glycyrrhiza uralensis Fisch., Glycyrrhiza korshinskyi Grig, Glycyrrhiza aspera Pall., Glycyrrhiza inflata L. и имеет структуру [(Зр, 20(3) - 20-карбокси-11-оксо-30-нор-олеан-12-ен-3-ил]-2-0-(3-Д-глюк-уронопиранозил-а-Д-глюкуроно-пиранозида (Толстиков и др., 1997). Агликоном глицирризиновой кислоты является одноосновная (30=СООН) глицирретиновая кислота с характерной для нее кетогруппой у С-11. Сахарная часть представлена 2 молекулами глюкуроновой кислоты (Муравьева, 1991). Глицирризиновая кислота содержится в корнях солодки в виде смешанной K-Mg-Ca- соли, состав которой колеблется в зависимости от места произрастания (Ikram, Zirvi, 1976; Pat.4176228, 1979; Денисова, 2000).
Считается, что тритерпеновые сапонины выполняют функцию защиты растений от патогенов, в первую очередь от патогенных грибов (Osbourn, 1996). Тритерпеновые гликозиды могут выполнять также роль осморегуляторов бобовых, модулируя активность мембранных насосов (Hartman, 1998).
Эта соль обуславливает приторно-сладкий вкус солодкового корня (Lutomski et al., 1991) (в 50-200 раз слаще сахарозы). Содержание глицирризиновой кислоты в корнях различных видов солодки колеблется от 8 до 24 % и может достигать 28 % (Муравьева, 1991; Fenwick et al., 1990). В корнях солодки уральской глицирризиновая кислота сопровождается небольшим количеством другого сапонина, названного ураленоглюкуроно-вой кислотой. При его гидролизе освобождается агликон - ураленовая кислота (оксиглицирретиновая кислота) и 1 молекула глюкуроновой кислоты (Муравьева, 1991).
Из корней Glycyrrhiza spp. выделена 24-оксиглицирретовая кислота (Кирьялов и др., 1972), 13 тритерпеновых олигогликозидов олеанового типа: сапонины A3, В2, С2, D3, Е2, F3, G2, Н2, J2, К2 и L3, апиоглицирризин и арабоглицирризин совместно с глицирризином (основной сапонин) (Kitagawa, 1993).
Изучено влияние различных доз g-излучения на содержание глицирри-зина и аммонийных солей глицирризиновои кислоты в тонко измельченных и грубых порошках (Takuhiro et al., 1997).
Почвенно-климатические условия
Южный Урал расположен между 5Г-530 с.ш. и 58-59 в.д. (рис. 6). По климатическим условиям район Зауралья крайне неоднороден. Для него характерно резкая континентальность климата: длительный период отрицательных температур, значительные отклонения по годам от средних норм по тепловому режиму и количеству осадков (рис. 7, 8.). Находясь в "тени" Уральского горного барьера, Башкирское Зауралье заслонено от атлантических воздушных масс и широко открыто влиянию Азиатского материка. Находящиеся на пути атлантического увлажненного воздуха, Уральские горы усиливают выпадение осадков на западной периферии и обуславливают уменьшение их количества к востоку. Зимой эта территория находится под влиянием сибирского холодного воздуха. Летом атлантический воздух проникает сюда уже нагретым и иссушенным, поэтому зима здесь холодная, а лето засушливое , с частыми суховеями (Агроклиматические..., 1976; Тайчи-нов, Бульчук, 1975).
Южная часть Зауралья - зона умеренно теплого засушливого климата характеризуется резко континентальным сухим климатом. Число солнечных дней в году колеблется от 260 до 290, средняя годовая температура воздуха от 0,3 до 2,8 С, сумма температур за вегетационный период с температурой более 10 составляет 2000-2200 С. Среднегодовое количество осадков - 270-350 мм. Начало безморозного периода - первая половина мая, конец - около 20 сентября. Продолжительность периода составляет 127-136 дней, безморозного - 100-120 дней. Гидротермический коэффициент (ГТК) в районе изменяется от менее 0,8 до 1,0. Устойчивый переход температуры через 0 С происходит 4-9 апреля и 24-29 октября. Высота снежного покрова в течение всей зимы небольшая, плохо защищающая зимующие культуры от вымерзания. К концу ноября высота снега достигает 10-11 см. В это время минимальная температура воздуха может понижаться до -25, -30С. Только к 20-28 февраля высота снежного покрова составляет 20 см. Абсолютный минимум температуры воздуха достигает -48 С. (Агроклиматические..., 1976).
Летние месяцы изобилуют засушливыми днями с частыми сильными ветрами - суховеями южного, юго-западного направлений, с пыльными бурями. Среднеиюльская температура ниже +18-20С. Засухи часты и продолжительны, их повторяемость 40-50 % (Биккужина и др., 1999).
Среднегодовая температура воздуха за 1985-2000 гг. составила по метеостанции Баймак - 2,4С, по метеостанции Акъяр - 3,0 С. Среднегодовое количество осадков за этот же период составило по Баймаку -351 мм, по Акъяру - 325 мм (рис. 7, 8; приложение 1, 2, 3, 4).
Почвы. Неравномерное распределение климатических ресурсов, сложное геоморфологическое строение и различные высотные уровни находят отражение в почвообразовательных процессах и почвенном покрове.
Зауральская равнина простирается вдоль границ Башкортостана с Челябинской и Оренбургской областями и целиком включается в степную зону. Ее естественная растительность, уничтоженная на значительных площадях распашкой, сохранилась только отдельными участками. Она представлена в юго-восточной части равнины ковыльно-типчаковыми степными группировками, в меньшей степени - типчаково-полынными, обедненным разнотравьем ковыльными, типчаковыми и каменистыми степями.
В связи со сложностью условий почвообразования почвенный фон Зауралья характеризуется большим разнообразием типов и разновидностей (Хазиев и др., 1995). Преобладающими почвами являются черноземы. В южной части Зауральской равнины распространены относительно малогумусные черноземы обыкновенные, южные и солонцеватые, в средней части - черноземы обыкновенные полноразвитые и широкое распространение получили примитивные органогенно-щебнистые почвы. Солонцевато-солончаковый комплекс не образует самостоятельного фона, обычно они комплексируются с солонцеватыми черноземами и лугово-черноземными почвами.
Характерной особенностью этих почв являются повышенное содержание гумуса, слабокислая и / или нейтральная реакция надсолонцового горизонта, гидролитическая кислотность либо практически не выражена, либо не превышает 2 мг экв на 100 г почвы. Количество общего (в среднем 0,75 мг/кг с колебаниями от 0,6 до 1,50 мг/кг) и подвижного бора (0,6-1,0 мг/кг) - высокое, подвижного марганца - среднее (50-200мг/кг). Содержание подвижного фосфора (по Чирикову и Труогу) не превышает 4-6 мг на 100 г почвы, общее содержание фосфора - 0,14-0,19 %. Выявлена различная степень обеспеченности подвижным кобальтом (3-6 мг/кг) и медью (в среднем 7 мг/кг). По содержанию подвижного молибдена преобладает средняя обеспеченность (Гирфанов, Ряховская, 1975; Мукатанов, 1994; Хазиев и др., 1995).
Ценопопуляционный анализ G. korschinskyi Grig
По 23 морфологическим параметрам (см. разд. 2.3.) проанализированы растения из 10 пространственно разделенных ценопопуляций. Как видно из рис. 10, структура параметров существенно не меняется по годам. Однако проведение комплексного кластерного анализа на базе тех же параметров дало более устойчивую картину. По результатам анализа (рис. 10) показано, что ЦП показали устойчивую дифференциацию. Следует отметить, что ЦП сохраняют устойчивые различия в годы с разными погодными условиями (рис.10).
Наиболее выражен градиент между ценопопуляциями нарушенных и ненарушенных местообитаний. Как следует из представленного рисунка выборки в течение 1999-2000 гг. образовали два кластера (табл. 4). Первый кластер образован ценопопуляциями, приуроченными к целине, второй кластер образован ЦП, сформированными в результате деятельности человека (рис. 10).
Для изученных ЦП солодки Коржинского были задействованы популяционные и морфофизиологические характеристики. Следует заметить, что солодка является представителем преимущественно вегетативно размножающихся растений, за рубежом называемых клональными (Plant clonality..., 1995, Миркин, Наумова, 1998). Поскольку у клональных растений, особенно в природных условиях, трудно вычленить целиком материнское растение со всеми вегетативными побегами, то при морфологической характеристике оценивались параметры 1 побега, соответствующего 1 рамете клона.
При характеристике ЦП солодки Коржинского на 10 учетных площадках в 1 м , заложенных вдоль площади заросли через 5 м, определяли следующие параметры: надземную биомассу солодки, надземную биомассу сопутствующих видов, число вегетативных и генеративных побегов солодки. Учитывая редкость вида, подземная биомассу солодки определяли лишь на 3 площадках и корневища выкапывали только до глубины 30 см.
Результаты, представленные в таблице 5, показывают, что в нарушенных ЦП из окрестностей Сибая надземная биомасса солодки наибольшая и только здесь она превышает надземную биомассу сопутствующих видов. Не исключено также, что это связано с изменением микроэлементного состава почвы под воздействием промышленных выбросов. В этих же ЦП отмечено максимальное число генеративных побегов. Только в трех ЦП (№ 7, 8, 9) число генеративных побегов превышает число вегетативных. Максимальное число вегетативных побегов на площадке выявлено в старовозрастном деградированном посеве многолетних трав (ЦП № 4). В то же время, максимум подземной биомассы приходится на целинную ЦП 3, отличающуюся низкими показателями надземной биомассы и числа побегов на 1 м . Из 4 целинных ЦП в 3 отмечены наивысшие значения подземной биомассы. Минимум надземной фитомассы образуется на солончаковых почвах (ЦП № 10), продукция подземной сферы здесь, тем не менее, достаточно высока.
Интересно, что коэффициент оводненности корневищ солодки из сообществ посевов многолетних трав (ЦП 1, 2, 4, 5, 7) составляет 0,9 - 2,6, а из целинных сообществ - 1,3 - 3,7 (табл. 5). Повышение содержания сухого вещества является фактором, повышающим водный потенциал корня, т.е. сосущая сила корня увеличивается. При этом увеличивается эффективный радиус, в котором поток почвенного раствора направлен к корню, т.е. повышается количество веществ, в том числе азота, притекающих к корню. Это явление может быть одним из механизмов, повышающих эффективность первичного накопления ионов и использования растениями обедненных сред (Усманов, 1987). Также выше накопление влаги в более северных местообитаниях Баймакского района (ЦП 8, 9 и 10).
При характеристике растений (раметов) солодки Коржинского для 10 произвольно взятых растений определялся ряд параметров вегетативной и генеративной сфер (табл. 6). Из таблицы видно, что по большинству параметров вегетативной сферы лидируют молодые ЦП посевов многолетних трав 3-9 года жизни (№ 2 и 5). Целинные ЦП 8 и 9, уступающие вышеназванным по ряду показателей, отличаются максимальным числом листьев и листочков, за счет чего и складывается максимум по надземной биомассе. Целинная ЦП 3, имеет максимум диаметра корня, что определяет высокое значение ее подземной биомассы. При сравнении популяционных и метрических характеристик можно видеть, из чего складываются те или иные значения. Так, сравнивая лидирующие по многим метрическим параметрам ЦП 2 и 5, мы видим, что первая из них имеет более крупные побеги, но значительно уступает второй по величине надземной и подземной биомассы из-за небольшого их числа на 1 м2. Для целинных ЦП 8 и 9, наоборот, примерно равная надземная биомасса складывается из разных показателей -в первом случае за счет большего числа побегов на 1 м , причем имеющих максимальную из всех ЦП облиственность, во втором зарегистрировано меньшее число побегов, но они почти на треть длиннее.
В табл. 7 приведены аллометрические показатели (Злобин, 1996) ЦП солодки Коржинского. По всем отношениям максимальные значения отмечены для целинных ЦП. В целом отмечена отрицательная корреляция между величинами наземной и подземной фитомассы.
Кроме того, в августе 1999 года была проведено определение семенной продуктивности изученных ЦП. Несмотря на то, что цветение наблюдалось во всех популяциях, семена образовались только в четырех из них (1,3,5,7), причем в небольшом количестве - по 2 - 4 боба, содержащих 1 -2 семени с 1 побега. Мы связываем это с тем, что в благоприятном для Зауралья по гидротермическим показателям 1999 году с массовым развитием тли, питающейся сладкими выделениями листьев солодки и повреждающей верхушки цветоносов с более молодыми тканями.
По нашим наблюдениям, основной способ размножения солодки вегетативный, а семенное размножение используется как «запасной» вариант. Доминирование вегетативного способа размножения солодки Коржинского отмечается и в условиях Среднего Урала (В ас фи лова и др., 2001).
Не исключено, что это связано с ингибированием дыхания при стрессе, как в целом растений, так и клубеньках поставляющих аминокислоты в репродуктивные органы. Как известно, бобовые переходят к формированию репродуктивных органов, только при условии достаточного обеспечения азотом (Белима, Шипота, 1981). Замедление или ускорение перехода к цветению отмечается при стрессе или воздействие таких экологических факторов, как водный режим, обеспеченность светом и т.д.; для истинных рудералов характерен переход к цветению при стрессе (Усманов, 1987). Корреляционный анализ показал, что как количество, так и морфологические показатели репродуктивных органов положительно коррелируют с содержанием азота в корнях солодки, косвенным показателем интенсивности симбиотической азотфиксации (величина г колеблется от 0,65 до 0,83) (рис.11).
На рис. 12 видно, что наибольшее количество цветков и соцветий солодки Коржинского отмечается на участках с низким содержанием органического вещества. Высокое содержание гумуса неблагоприятно влияет на генеративное размножение в силу уже рассматривавшихся причин.
Интересен характер взаимоотношения бобовых с конкурентами -злаками и другими компонентами сообществ (рис 13). С точки зрения физиологии очень важно, что эти растения по-разному реагируют на повышенную концентрацию С02 в фитоценозах. При обогащении воздуха СОг Сз-растения солодки превосходят по массе С4- растения злаков. Солодка как представитель бобовых наиболее отзывчива на обогащение атмосферы углекислым газом, особенно при достаточной инсоляции (Третьяков, 1998). Это объясняется тем, что симбиотическая азотфиксация перехватывает значительное количество ассимилятов, предназначенных для ростовых процессов.
Оценка антиоксидантной активности трех видов солодки
В литературе довольно широко представлена информация об антиоксидантных свойствах вторичных метаболитов различных представителей рода Glycyrrhiza. Так, показано, что ликохалконы и эхинатин корней G inflata успешно ингибируют перекисное окисление липидов в различных модельных системах (Kinoshita et al., 1998). Ликохалконы являются ловушкой для супер-оксид-ионов в микросомах (Haraguchi et al., 1997).
Следует отметить, что в литературе отмечается удлинение продолжительности жизни мышей в моделях гемической и гипобарической гипоксии при введении отваров солодки голой и щетинистой (Поспелова, Барнаулов, 2000). Антиоксидантые свойства представителей рода Glycyrrhiza позволяют рассматривать их экстракты как перспективные адаптогены (Беляев и др., 2001).
Вместе с тем информацию об антиоксидантных свойствах экстрактов корней солодки Коржинского нам обнаружить не удалось.
Ингибированное окисление изопропилового спирта проводили в стандартных условиях: t=75, Vj=4xl0" М/с. В отсутствии добавок экстракта, изопропиловый спирт в присутствии инициатора АИБН окисляется по кинетической кривой 1 (рис. 24). Кривая имеет линейный вид, характерный для инициированного окисления. При добавлении экстракта солодки на кинетической кривой окисления изопропанола появляется период индукции. Снижается скорость поглощения кислорода. Так например, на рис. 24 представлены кинетические кривые поглощения кислорода с добавками 3 видов экстрактов солодки. Концентрация добавленных экстрактов одинакова для трех опытов и составляет 0,5 г/л. По этим кинетическим кривым определяли период индукции (т) действия природного АО. Период индукции определяли по точке пересечения двух касательных в начальный и в стационарный период протекания реакции. В начальный период реакции скорость поглощения кислорода в присутствии добавок экстрактов обозначена через Vo После периода индукции скорость поглощения кислорода растет и составляет величину VVOB. (табл. 12).
Как следует из рис. 24, экстракт G. echinata в 3 раза снижает скорость поглощения кислорода, период индукции составляет 10,8 мин. Другие 2 экстракта по своей АО эффективности намного превышают первый экстракт: в присутствии солодки голой скорость поглощения кислорода снижается в 25 раз, т=39 мин (табл. 12).
Таким образом изучены экстракты трех видов солодки в качестве природных ингибиторов на модельной реакции ингибированного окисления изопропилового спирта при температуре 75С и скорости инициирования Vj = 4 М/с. Выявлено, что все три вида экстракта солодки проявляют АО активность. Так, G. glabra и G. korshinskyi снижают начальную скорость окисления изопропилового спирта в 25 и 38 раз, при этом обнаружен период индукции в реакции окисления спирта (Муртазина и др, 2001; Герчиков и др., 2001). Следовательно, антиоксидантная активность экстракта солодки Коржинского сопоставима с активностью G. glabra, и несколько выше, чем у экстрактов солодки щетинистой.
Результаты сравнения оптической плотности экстрактов трех видов солодки, полученных при одинаковых условиях экстракции показал, что спектры поглощения экстрактивных веществ солодок голой и Коржинского свидетельствуют об идентичности оптических характеристик экстрактов, в составе которых, очевидно, доминируют флавоноиды. Судя по спектрам поглощения корни солодки щетинистой содержат наименьшее количество фенольных соединений, о чем свидетельствует рис. 25.
При рассмотрении количества экстрактивных веществ по временам года (осень и лето), особых отличий не отмечается. Обращает внимание близость оптических характеристик изученных экстрактов в диапазоне 250-260 нм, соответствующего тритерпеновым гликозидам.
Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования солодки Коржинского в качестве ингибитора реакций перекисного окисления липидов.
