Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Краткий обзор литературы . б
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 20
2.1. Материал и учитывавшаяся реакция 20
2.2.Техника облучения 22
2.3. Сопутствующие факторы 23
ГЛАВА 3. Результаты опытов 27
3.1. Влияние пострадиационного изменения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 2,4; 7,6 и 12,6$ 27
3.2. Влияние пострадиационного увеличения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 2,4$ 40
3.3. Влияние пострадиационного уменьшения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 6% 47
ГЛАВА 4. Заключение 69
4.1. Общие итоги опытов 69
4.2. Обсуждение полученных результатов 72
4.3. Заключительные замечания 89
Выводы 93
Литература 95
- Материал и учитывавшаяся реакция
- Сопутствующие факторы
- Влияние пострадиационного изменения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 2,4; 7,6 и 12,6$
- Влияние пострадиационного уменьшения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 6%
Введение к работе
Действие ионизирующих излучений на клетку представляет собой цепь реакций и процессов, которая начинается исходным физическим пусковым механизмом и завершается конечной формой биологического проявления данной реакции на облучение.
Одной из фундаментальных задач количественной радиобиологии по-прежнему остается изучение физико-химических процессов развития первичного поражения и явлений восстановления в связи с анализом природы и механизмов наиболее существенных и глубинных биологических эффектов ионизирующих излучений. Согласно современным представлениям, модификация лучевого эффекта после облучения возможна на двух этапах формирования наблюдаемых биологических изменений. Первый этап - этап первичных физических и физико-химических превращений, приводящих к изменению элементарных внутриклеточных структур, а второй - этап ферментативных, или биохимических превращений, приводящих или не приводящих к восстановлению первичных повреждений.
В связи с физико-химическим аспектом модификации всё большее внимание привлекает вопрос о влиянии сопутствующих факторов на выход радиационного поражения в сухих тест организмах, в которых проводится изучение биологического последействия на уровне физико-химических событий, по возможности исключая ферментативные процессы.
Материал и учитывавшаяся реакция
Объектом исследования в наших опытах служили покоящиеся семена crepis capillaris (L.) Wallr. , имеющие малочисленный набор (п =3) крупных, морфологически различающихся хромосом.
Цитологический анализ семян проводился в метафазе митоза, т.е. в период, когда хромосомы максимально спирализованы и их структура четко видна под микроскопом. Преимуществом метафазного метода перед ана- и телофазным является, как известно, возможность учета всех основных типов возникающих аберраций хромосом.
После облучения и соответствующей пострадиационной обработки семена проращивали в термостате при 25С в чашках Петри на фильтровальных бумагах, смоченных водой; последнюю за 4 часа до фиксации заменяли 0,01#-ым раствором колхицина. Колхицин обладает следующими свойствами: во-первых, он блокирует митотические центры и не допускает развития веретена; во-вторых, он, по-видимому, удлиняет время протекания стадии метафазы. Благодаря первому свойству колхицина хромосомы распределяются в цитоплазме свободно, а не скученно, что облегчает их морфологическое изучение. Кроме того, в клетках, находящихся в растворе колхицина, клеточный цикл проходит без деления на две дочерние клетки, и потому с каждым новым циклом хромосомный набор клетки увеличивается вдвое (колхициновый или К-митоз). Таким образом, первое свойство колхицина дает также возможность отличить клетки, прошедшие первый митоз, от клеток, вступивших в последующие митозы (Немцева, 1970).
Что касается второго свойства колхицина, то оно приводит к "накоплению метафаз", а это расширяет возможности количественного анализа.
Фиксация проростков производилась в спирт-уксусной смеси -(3:1), причем для исследования отбирались корешки длиной в 1,5 -- 2 мм.
Как ранее было показано, клетки зародыша в сухих семенах Crepis находятся на стадии G j, предшествующей синтезу ДНК, и обладают одинаковой радиочувствительностью, которая не зависит от времени фиксации ( Sire, Nilan , 1959, Протопопова, 1968). Эта Эта особенность клеток зародыша позволила нам во всех экспериментах производить фиксацию материала только в один срок - через 32-38 часов (в зависимости от опыта) от начала проращивания.
Реакция семян на облучение и соответствующие пред- и пострадиационные обработки оценивалась по выходу хромосомных аберраций в метафазе первого пострадиационного митоза. Чтобы судить о влиянии различного рода воздействий на спектр аберраций,-учитывались все основные типы перестроек: асимметричные и симметричные транслокации, кольца, микрофрагменты, инверсии, делеции. Фиксировались также все хроматидные перестройки. Особо следует выделить так называемые неполные разрывы, или пробелы ( gaps ), которые часто занимают весь диаметр хроматиды. Ширина пробелов обычно меньше 1,5 диаметра хроматиды, их можно наблюдать отдельно или по парам в идентичных локусах сестринских хроматид. Такие повреждения часто считают репарабельными разрывами, не переходящими в истинные разрывы и перестройки (Сидоров, Соколов, 1966, Evanst 1966, 1967). В первой работе была прослежена судьба пробелов в последовательных стадиях клеточного цикла у Crepis , включая смежные клеточные поколения. Они обнаружили, что пробелы не переходят в истинные разрывы и перестройки. Эванс ( Evans , 1966, 1967) изучал количественные закономерности появления пробелов в зависимости от дозы и стадии клеточного цикла во время облучения и пришел к выведу, что они являются репарабельными, обратимыми разрывами, претерпевающими восстановление во время синтеза ДНК. Однако Конгер ( Conger,1967) при анализе действия излучения на споры традесканции показал, что 2/3 пробелов, наблюдаемых в метафазе, приводят к образованию фрагментов в анафазе. Изучение с помощью сканирующего электронного микроскопа пробелов, индуцированных рентгеновским излучением в хромосомах Vicia faba , показало, что эти повреждения представляют собой не просто неокрашивающиеся места, а потерю или сильную деспирализацию хромосомного материала ( Scheid, Traut г І97І). Дишлер в своих исследованиях (Дишлер, 1974) относил пробелы к типу одноударных перестроек. Однако в нашей работе мы придерживаемся мнения тех авторов, которые не учитывали пробелы в числе индуцированных облучением перестроек.
Окраска материала производилась ацетокармином. Необходимая процедура - мацерация материала перед раздавливанием для получения монослоя хромосомных пластинок - проводилась с помощью 45% уксусной кислоты и хлоралгидрата (5 г хлоралгидрата на 2 мл дисти-лированной воды).
На временных давленых препаратах в каждом корешке анализировали по 50 метафазных пластинок. В первом основном эксперименте было просмотрено по б корешков в каждом опытном варианте, а в остальных - по 10 корешков. Наряду с облученными вариантами в каждом опыте имелись контрольные необлученные варианты, для которых проанализировано вдвое больше метафаз. Произведены необходимые статистические расчеты.
Сопутствующие факторы
В качестве сопутствующих факторов нами были избраны влажность и пострадиационное хранение.
Влажность семян строго контролировалась как в момент облучения, так и при пострадиационном хранении. Во избежание влияния процессов метаболизма при изучении физико-химического эффекта радиации, с одной стороны, и для проявления биологического последействия, с другой стороны, диапазон влажностей семян выбран в пределах от 2,4% до 12,6%. Как было показано на семенах гороха, при высокой влажности семян (выше 20$) вступают в силу биохимические процессы (Порядкова, 1965). Действие влажности при пострадиационном хранении облученных семян изучалось с помощью варьирования влажности при хранении. Так, например, если в опыте исследова -лись семена трех различных влажностей, то после облучения группу семян данной влажности делили на три части и хранили в каждой из имеющихся в этом опыте установок.
В первом опыте была определена временная зависимость биологического последействия при недельном хранении семян. Результаты опыта выявили наличие значительного быстрого компонента в развитии поражения у сухих (2,4%) семян при отсутствии такового у более влажных (7,6 и 12,6$). Эти данные предопределили наши дальнейшие исследования по модификации радиационного поражения семян. В последующих опытах срок хранения ограничивался 4-мя часами, т.е. промежутком времени, вполне достаточным для формирования быстрого компонента пострадиационного поражения.
При оценке влияния пострадиационного изменения влажности на выход хромосомных аберраций необходимо было в течение ограниченного отрезка времени суметь в значительной степени изменить содержание воды в ту или иную сторону.
Удобство работы с семенами Crepis как раз и заключается в том, что они обладают способностью быстро отвечать на изменения влажности в окружающей среде. Требованию способности к достаточно быстрому изменению влажности в семенах должна также удовлетворять установка, в которой хранятся семена после облучения. Для получения семян определенной влажности обычно пользуются эксикаторами, внутри которых создается соответствующая относительная влажность воздуха. Такая техника, однако, таит в себе ряд недостатков. В частности, для приведения влажности семян к определенному стабильному уровню требуются значительные сроки. Это обстоятельство, не играющее существенной роли в определенных опытах, для целей нашей задачи, однако же, делает технику использования эксикаторов совершенно неприемлемой. Ряд других возражений против использования эксикаторов приводится в статье Осборна и Бэкона ( Osborne , Bacon , 1961): 1) Существует некоторый градиент давления паров от поверхности соли или раствора к краям (обычно к вершине) объема внутри эксикатора. 2) Существует также градиент давления паров от внутренних частей к внешним частям образца, который в лучшем случае располагается в один слой. 3) Атмосфера внутри объема может значительно меняться при открывании эксикатора. 4) Удостовериться в изменении влажности образца трудно без разбора системы и/или разрушения образца.
Эти же авторы -предложили удобные системы для работы с семенами, позволяющие обойти указанные трудности. В своей работе мы использовали разработанную ими систему "стеклянных трубок", несколько модифицированную с учетом специфики нашей задачи. Небольшой внутренний объем системы и постоянная циркуляция воздуха в ней способствовали быстрой стабилизации уровня влажности одновременно в большом количестве семян. К тому же, изменение влажности семян в процессе самого опыта никак не отражалось на относительной влажности воздуха внутри системы (рис.2). Система, с помощью которой были получены самые сухие семена (2,4% влажности), состояла изг а) колбы с гранулированным КОН в качестве поглотителя влаги, б) стеклянных трубок-ячеек, в которых хранились семена, в) микрокомпрессора, с помощью которого обеспечивалась циркуляция водуха в системе. В системах для более влажных семян вместо КОН использовались растворы глицерина различной концентрации: 70#-ый раствор глицерина давал 6%-ое содержание влаги в семенах, 63 -ый - 7,6$ влажности, а 42#-ый - 12,6$ влаги.. На рисунке 3 приведена кривая зависимости влажности сеян от концентрации глицерина, полученная в наших системах постоянной влажности.
Влияние пострадиационного изменения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 2,4; 7,6 и 12,6$
Прежде чем перейти к основной серии опытов, следовало получить ответы на следующие вопросы: (I). Как изменяется радиочувствительность семян с влажностью? (2). Как изменяется величина биологического последействия с влажностью? (3). Как выбрать экспериментальные условия, максимально подходящие для решения поставленной задачи? Первые два вопроса в литературе изучались интенсивно, и наши данные не представляют самостоятельного интереса. Нам следовало установить, однако, зависимость начального поражения и последействия от влажности семян crepis для наших конкретных условий. Мы лишь вкратце остановимся на полученных результатах.
Предварительные опыты (I) Изменение радиочувствительности семян с влажностью. Под радиочувствительностью мы будем иметь в виду начальное поражение (или немедленное поражение), измеряемое по выходу хромо -сомных аберраций в кончиках корешков из семян, замоченных сразу после облучения. Табл.1. Относительная радиочувствительность семян разных влажностей (относительно радиочувствительности, при влажности 2,0 - 2,6« В табл.1 приведены значения относительной радиочувствительности семян в широком диапазоне влажностей. Таблица составлена на основании усредненных данных нескольких опытов, в каждом из которых сравнивались семена двух-трех влажностей. На основании полученных кривых доза-эффект в каждом опыте устанавливали значения изоэффективных доз (доз, вызывающих одинаковый выход хромосомных аберраций) для семян каждой данной влажности. Близкие значения влажностей сгруппированы. Значения относительной радиочувствительности, приведенные в таблице, представляют собой частные от деления соответствующих изоэффективных доз.
Из таблицы видно, что радиочувствительность семян Crepis capillaris зависит от их влажности сложным образом. Наиболее резистентны семена, практически не содержащие воды. С повышением влажности в узком диапазоне - от 0 до 2-2,6$ - чувствительность семян повышается в 4 раза. С дальнейшим повышением влажности чувствительность падает до минимума в районе влажностей 7-7,6$. Повышение резистентности семян в диапазоне влажностей 7,6-18,6$ незначительно.
(2) Изменение биологического последействия с влажностью Под биологическим последействием мы будем иметь в виду усиление поражения в пострадиационный период относительно начального по ражения. Измерять биологическое последействие мы будем в факторах изменения дозы (ФИД), орределяемых как отношение изоэффективных доз при регистрации поражения сразу после облучения и после хранения. Иными словами, ФИД показывает, во сколько раз выход хромосомных аберраций в процессе хранения изменяется относительно начального выхода. Табл.2. Изменение биологического последействия с влажностью семян Влажность, 0 2,0-2,6 5,3-6,0 7,0-7,6 12,6 17,8-18,6 ФИД I 2,2-3,7 1,5-3.0 1,9-2,2 1,7 I
В табл.2 приведены данные по изменению биологического последействия с влажностью семян. Таблица составлена на основании данных, полученных во многих опытах. Величина последействия от опыта к опыту варьирует, и здесь указаны диапазоны, в пределах которых мы наблюдали изменение ФИД для семян каждой данной группы,. В наиболее сухих и наиболее влажных семенах последействие вообще не наблюдалось. Семена влажности 2-2,6$ наиболее чувствительны к пострадиационному хранению. Эти данные получены при хранении семян в атмосфере, поддерживающей их влажность на начальном уровне.
(3) Нашей задачей было изучить влияние пострадиационного изменения влажности на развитие последействия в семенах разной влажности.
Очевидно, такую задачу имеет смысл решать в диапазоне влажностей, в пределах которого соответствующие факторы способны влиять на физико-химические процессы развития радиационного поражения. Тем более, что это тот диапазон влажностей (до 12-13$), в котором семена реагируют на облучение как относительно инертные системы и метаболизм не искажает конечную картину.
Влияние пострадиационного уменьшения влажности на биологическое последействие в семенах Crepis влажности 6%
Результаты опыта, представленного в части 3.2 показали, что пострадиационное уменьшение влажности семян, проявляющих лишь медленный компонент последействия, не может модифицировать величину последействия. Задача, которая ставится в этой части, звучит так: возможно ли путём пострадиационного высушивания, семян увеличить величину быстрого компонента последействия»
Очевидно, выбор удобной влажности определяется следующими условиями.: а) начальная влажность должна быть дастатолно низкой, допускающей быстрое развитие последействия; б) начальная влажность должна быть, достаточно высокой, чтобы пострадиационное хранение в сухой атмосфере могло, эффективно снизить её. Судя по табл.2, семе на влажности 6% вполне могли бы удовлетворить этим; требованиям. Надо было, однако, убедиться, что последействие в них характеризуется быстрым компонентом, и установить время, в течение которого быстрый компонент завершается.
Предварительные опыты.В двух опытах мы детально исследовали изменение; радиационного, поражения семян влажности 6% в процессе пострадиационного хранения. В одном, опыте семена облучили в дозах 50 и 100 Гр. Семена после облучения хранили в условиях, поддерживающих их влажность на начальном уровне., в течение 0; 0,25; 0,5; I и: Ч часов; I, 7 и. 28 дней. Данные для числа аберраций на клетку приводятся на рио.12. Ясно видна» что в течение первых четырех часов после облучения имеет место значительное усиление поражения.
Основной опыт. Таким образом, семена влажности 6% удовлетворяют требованиям, необходимым для решения поставленной конкретной задачи. Ниже сообщаются результаты двух параллельных опытов, в которых мы изучали влияние пострадиационного высушивания на биологическое последействие в сухих семенах.
Семена влажности 6% были получены путем хранения в системе с относительной влажностью воздуха в 50$. Семена облучали в дозах 25, 50, 75 и 100 Гр. После облучения часть семян замачивали - вариант С. Оставшиеся семена хранили в начальных условиях - вариант С-а, или в условиях низкой (0$) относительной влажности воздуха -вариант С-н. Последняя обработка осуществлялась путем помещения семян в колбу с гранулированным КОН, соединенную непосредственно с микрокомпрессором, разгоняющим воздух по этой замкнутой системе. Время пострадиационного хранения - 4 часа, ибо предварительные опыты показали, что за меньшее время не происходило заметного уменьшения уровня влажности семян. Выдерживание семян в быстром потоке воздуха относительной влажности 0% снизила их влажность с 6% до 3,4$.
Кривые доза-эффект для числа хромосомных аберраций на клетку, полученные в двух независимых опытах - (а) и (б) - приводятся на рис.13. В табл.12 приводятся значения коэффициентов регрессии и МД. В конце главы в табл.13 приводятся суммарные данные - процент метафаз с аберрациями и число хромосомных аберраций на 100 клеток. Детальные сведения о частоте появления отдельных типов перестроек в различных экспериментальных вариантах приводятся в табл.14.
Уровень спонтанных аберраций в контрольных вариантах колебался незначительно, и потому все данные по контрольным точкам усреднены - на каждые 100 просмотренных метафаз в контроле приходилось 3,1 аберрации.
Как видно из рис.13 и табл.14, выход хромосомных аберраций возрастает примерно вдвое, если семена хранить в начальной атмосфере— ФИД = 2,14 и 1,98 (Р О.01), и примерно втрое, если семена хранить в более сухой атмосфере - ФИД = 3,16 и 2,98 (Р с 0,001).
Таким образом, в соответствующих экспериментальных условиях быстрое пострадиационное понижение влажности сухих семян приводит к усилению в них биологического последействия.
Резюме. Таким образом, для установления возможного влияния на биологическое последействие пострадиационного высушивания семян следовало использовать семена, содержащие достаточное количество влаги (чтобы было, что высушивать), и в то же время допускающие быстрое развитие последействия. Семена влажности 6% удовлетворяли этим требованиям. Анализ экспериментальных данных показал, что эффективное пострадиационное понижение влажности семян способно в соответствующих экспериментальных условиях привести к усилению в них биологического последействия.
