Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Таксономический статус и происхождение байкальского омуля 11
1.1.1. Краткое описание таксономии и филогении сиговых рыб 11
1.1.2. Таксономический статус и происхождение байкальского омуля 14
1.2. Внутривидовая структура байкальского омуля 18
1.3. Выбор маркера для эволюционных исследований 20
1.4. Методы построения филогенетических схем 27
1.4.1. Методы генетических расстояний 27
1.4.2. Метод максимальной экономии 31
1.4.3. Бутстреп анализ 31
1.5. Краткая геолого-климатическая история оз. Байкал 32
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1. Сбор образцов тканей сиговых рыб 34
2.2. Выделение ДНК 35
2.2.1. Выделение суммарной ДНК 35
2.2.2. Выделение мтДНК из икры рыб 35
2.3. Электрофорез ДНК в агарозных гелях 37
2.4. Рестрикционный анализ мтДНК 37
2.5. ПЦР-амплификация 37
2.6. Прямое определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК 39
2.6.1. Определение нуклеотидной последовательности с помощью радиоактивных изотопов 39
2.6.2. Определение нуклеотидной последовательности на автоматическом секвенаторе 40
2.7. Обработка данных рестрикционного анализа мтДНК 40
2.8. Компьютерный анализ последовательностей фрагментов ДНК 41
2.8.1. Выравнивание и первичный анализ последовательностей 41
2.8.2. Построение филогенетических схем 41
Глава 3. Результаты 42
3.1. Рестрикционный анализ мтДНК байкальского омуля 42
3.2. Молекулярная филогения байкальских сиговых, основанная на нуклеотидных последовательностях фрагментов генома 49
3.2.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 50
3.2.1.1. СябмтДНК 50
3.2.1.2. Область контроля репликации мтДНК 50
3.2.1.3. ITS1 рибосомной ДНК ядерного генома 52
3.2.2. Построение и анализ филогенетических схем 55
Глава 4. Обсуждение 62
4.1. Популяционная структура байкальского омуля 62
4.2. Таксономический статус байкальского омуля 63
4.3. Происхождение байкальского омуля и его "байкальский" возраст 65
4.4. Филогенетические взаимоотношения между сиговыми бассейна Байкала 68
Заключение 70
Выводы 72
Список цитируемой литературы 73
- Таксономический статус и происхождение байкальского омуля
- Краткая геолого-климатическая история оз. Байкал
- Прямое определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК
- Молекулярная филогения байкальских сиговых, основанная на нуклеотидных последовательностях фрагментов генома
Введение к работе
Актуальность проблемы. Комплекс сиговых рыб бассейна оз. Байкал представляет большой интерес для исследования процессов формирования биоразнообразия уникального озера. Сиговые в Байкале освоили практически все реки и заливы, а в открытом озере глубины до 400 м., не образовав при этом большого количества видов (Черепанов, 1986). В свою очередь, байкальские сиговые, как обитатели ультра глубоководного озера, -уникальный объект для изучения закономерностей эволюции самого семейства, поскольку фенотипическая пластичность его наиболее полиморфных групп особенно ярко проявляется в условиях озерного обитания (Скрябин, 1979, Решетников, 1980; Bernatchez et al., 1999; Turgeon and Bernatchez, 2003).
Происхождение ихтиофауны Байкала по сей день является предметом острых споров. Нет единого мнения и относительно появления в озере представителей Coregonidae. Исследования сиговых рыб Байкала имеют очень давнюю историю, со времени описания И. Георги байкальского омуля под названием Salmo migratorius (Georgi, 1775) и П. Палласом байкальского сига под названием Salmo oxyrhinchus (Pallas, 1811). В настоящее время, согласно определителю П.Г.Борисова и Н.С.Овсянникова (1964), за байкальским омулем закрепилось название Coregonus autumnahs migratorius (Georgi), а за байкальским сигом, после детальных исследований Ф.В. Крогиус (1933), названия двух его форм - байкальского озерного сига Coregonus lavaretus baicalensis Dyb. и байкальского озерно-речного сига Coregonus lavaretus pidschian Gmelin. Общепринято, что байкальские сиги произошли от пыжьяна, Coregonus lavaretus pidschian, проникшего в Байкал из рек Сибири. Расхождение на две формы, различные по морфологии и биологии, шло по пути освоения в озере разных экологических ниш (Крогиус, 1933; Скрябин, 1969, 1979). Что касается происхождения байкальского омуля, на протяжении практически всего периода его исследований сосуществовало 2 основные гипотезы:
1 - Произошел от арктического омуля Coregonus autumnalis autumnalis (Pallas) проникнув в Байкал из окраинных морей Северного Ледовитого океана по системе рек в межледниковый период (Березовский, 1927; Берг, 1932, 1948; Мухомедиаров, 1942; Nikolsky and Reshetnikov, 1970; Решетников, 1980).
2 - Является эндемиком Байкала (Черешнев, 1994; Смирнов, 1997). Как и все сиговые виды рыб Восточной Сибири, байкальский омуль имел предковую форму, обитавшую в тепловодных водоемах олигоцен- миоценового возраста (Дрягин и др., 1969; Мац, Покатилов, 1976; Лут, 1978; Попова и др., 1989; Смирнова-Залуми, 1971).
Детальные исследования экологии байкальских сиговых рыб на протяжении более чем полувека (Мухомедиаров, 1942; Мишарин, 1953, 1958; Скрябин, 1969, 1979; Краснощеков, 1981; Смирнов, Шумилов, 1974; Смирнов, 1997 и др.) позволили выстроить достаточно четкую картину их морфо-экологической дифференциации и адаптивной эволюции в Байкале и подготовили хороший фундамент для генетических исследований. Не считая отдельных работ более раннего времени (Талиев, 1941; Ушаков, 1962), генетический анализ байкальских сиговых активно проводился последние 15 лет. Большой материал о степени генетической подразделенности байкальских сиговых внутри озера накоплен В.МЛхненко и A.M. Мамонтовым в исследованиях, в основу которых был положен изоферментный анализ (Мамонтов, Яхненко, 1987; Яхненко и др., 1992; Mamontov, Yakhnenko, 1995, 1998). Проведена первая оценка дивергенции последовательностей мтДНК байкальского и баунтовского озерных сигов (Слободянюк и др., 1993). Исследовался полиморфизм мтДНК в популяциях байкальских сиговых (Суханова, 1996, 1998; Brzuzan, 1998; Brzuzan et al., 1998). Анализом митохондриальной ДНК (мтДНК) и изоферментов была показана близость байкальского омуля к группе сигов с нижним ртом (Politov et al., 2000, 2002) и, прежде всего к виду С. lavaretus L. (Sukhanova et al., 2000; 2002; Гордон и др., 2004). В связи с этим высказывались предположения о возможном гибридном происхождении байкальского омуля (между арктическим омулем или его предковой формой с одной стороны и какой либо формой С. lavaretus L. с другой) (Politov et al., 2000, 2002). В последующем детальном филогеографическом анализе мтДНК Палеоарктических и Неоарктических пелагических сиговых Д. Политов и соавторы приходят к выводу, что байкальский омуль занимает корневое положение по отношению к комплексу омулевидных сигов, а также делают предположение о возможном базальном положении байкальского омуля по отношению ко всему роду Coregonus (Politov et al., 2004).
В данном исследовании осуществлены молекулярно-филогенетические реконструкции, объединившие всех байкальских сиговых, их ближайших родственников из соседствующих с Байкалом водоемов и других представителей семейства Coregonidae. Это позволило сделать выводы о происхождении и родственных связях как байкальского омуля, так и сиговых рыб Байкала в целом (Sukhanova et al., 2000,2002,2004а, b).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение эволюционной истории байкальского омуля: исследование меж- и внутрипопуляционного полиморфизма и установление филогенетических взаимоотношений с другими представителями семейства Coregonidae. В конкретные задачи работы входило:
1. Исследование генетического полиморфизма трех наиболее многочисленных популяций байкальского омуля (селенгинской, северобайкальской и посольской) с помощью рестрикционного анализа митохондриального генома.
2. Определение нуклеотидных последовательностей контрольной области мтДНК, митохондриального гена цитохрома Ъ (Cytb) и первого внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК (ITS1) для байкальского омуля, а также некоторых представителей семейства Coregonidae, обитающих в оз.Байкал и за его пределами.
3. Обработка полученных последовательностей, изучение вариабельности последовательностей данных участков генома, построение филогенетических схем и оценка времени дивергенции байкальского омуля от других представителей семейства Coregonidae.
4. На основе филогенетических схем, построенных по нуклеотидным последовательностям фрагментов ядерного и митохондриального геномов, и данных рестрикционного анализа, реконструкция истории расселения сиговых рыб в бассейне оз. Байкал, происхождения байкальского омуля и формирования его популяционной структуры.
Научная новизна работы. Впервые для исследования эволюционных взаимоотношений байкальских организмов применен молекулярно-филогенетический подход, совмещающий использование независимо наследуемых генетических маркеров, имеющих разный характер и скорость эволюции. Определение полных нуклеотидных последовательностей гена Cyt b мтДНК, контрольной области мтДНК и внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК у представителей сиговых разного таксономического ранга позволило подтвердить на исследуемой группе рыб закономерности эволюции данных участков генома. Впервые проведен анализ родственных связей всех байкальских сиговых с другими представителями Coregonidae, позволивший проследить генеалогическую историю их появления в озере. Доказана принадлежность байкальского омуля к полиморфному виду Coregonus lavaretus L. Впервые показаны возможные связи эволюции комплекса байкальских сиговых с конкретными геологическими и климатическими событиями истории Байкала.
Научно-практическое значение. Для научно обоснованного сохранения и рационального использования природных ресурсов оз. Байкал необходимо прогнозирование характера и степени изменений его экосистемы под воздействием тех или иных факторов, что требует знания истории формирования современного биоразнообразия озера. Байкальские представители вида Coregonus lavaretus L. (озерный сиг, озерно-речной сиг и омуль), являются важным компонентом экосистемы озера. Будучи объектами интенсивного промысла и искусственного разведения, направленного на поддержание их численности, сиговые рыбы в большей степени, чем остальные обитатели Байкала подвержены влиянию хозяйственной деятельности человека. Исследование истории формирования сложившихся в озере взаимоотношений между экологическими формами вида - один из необходимых этапов на пути разработки методов генетического мониторинга байкальских сиговых рыб.
Апробация работы. Результаты работы представлялись: на международной конференции: "Байкал - природная лаборатория для исследования, изменений окружающей среды и климата" в г. Иркутске (Май 11-17, 1994 г.); на VI, VII и VIII международных симпозиумах: "Биология и использование сиговых рыб" в г. Констанца, Германия (1996 г. 23-26 сентября), в г. Энн Арбор, Америка (9-12 августа, 1999 г.), в г. Рованиеми, Финляндия (26-29 августа, 2002г.); на международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии", 21-28 августа 2000 г. в г. Новосибирске, Россия; Ежегодной конференции Экологического общества Японии, 26-31 марта 2001, Кумам ото; на международном семинаре "Байкал и Хубсугул, проект - бурение" в г. Улан-Батор, Монголия 2002 г.; на 3-ем международном совещании: "Видообразование в древних озерах мира" (SIAL) Иркутск, Россия 2002 г.
Публикации. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе четыре публикации в рецензируемых журналах.
1. Суханова Л.В., Смирнова Н.С., Смирнов В.В. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа мтДНК // Тезисы. Байкал - природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата, Иркутск, Май 11-17, 1994. Том 5. С. 96.
2. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Слободянюк С.Я, Кирильчик СВ. Исследование популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) методом рестрикционного анализа митохондриальной ДНК // Вопросы ихтиологии. 1996. Т 36(3). С. 667-673.
3. Sukhanova L.V., Skulin, V.A., V.V. Smirnov, N.S. Smirnova-Zalumi. Investigation of Baikal omul populations by restriction analysis of mtDNA.// Abstract. VI International Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Germany, Konstanz, 23-26 September, 1996
4. Суханова Л.В., Смирнов В.В., Смирнова-Залуми Н.С., Кирильчик СВ. Новые данные по рестрикционному анализу мтДНК популяций байкальского омуля Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) II Сибирский экологический журнал. 1999, Т. 6. С. 655-658.
5. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D. The taxonomic position of the Lake Baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), in the family Coregonidae II Abstract. VII Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Ann Arbor, Michigan, USA, 9-12 August, 1999. P. 89.
6. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., The phylogenetic relationships of Lake Baikal coregonines as revealed by mitochondrial DNA d-loop analysis.// Proceeding of International Conference: Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia, IC,G, Novosibirsk, 2000. V. 5(2). P. 199-201.
7. Smirnov V.V., Sukhanova L.V., Smirnova-Zalumi N.S., Shimizu I. Limnogenesis of Baikal rift zone and Baikal omul origin II Abstract. International workshop for the Baikal , Hovsgol drilling project in Ulan Bator. Ulan Bator, Mongolia. October 4-7, 2001. P. 62.
8 . Sukhanova L.V., Kirilchik S.V., Smirnov V.V., Shimizu I. Study of the Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) from DNA analysis II Abstr. of Annual meeting of Ecologycal Society of Japan, 26-31 March 2001, Kumamoto. P. 301. 9. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Griffiths D., Belikov S.I. The taxonomic position of the Lake Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) as revealed by sequence analysis of mtDNA Cytochrome b gene and control region II Pol. Arch. Hydrobiol. Spec.Issues Advanc. Limnol. 2002. V. 57. P. 97-106.
10. Sukhanova L.V, Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Knizhin LB., Matveev A.N., Sokolov A. V., Shimizu I. Evolution of the Coregonus lavaretus complex in the Baikal rift zone: A Preliminary Molecular-Biological Study //Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history. Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 182.
11. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Baikal omul as a part of C. lavaretus complex II Abstr. of the Third International Symposium of the Series Speciation in Ancient lakes (SIAL-3): Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history.- Novosibirsk: Nauka, 2002. P. 183.
12. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. The close genetic relationship of Baikal omul, Coregonus autumnalis migratorius (Georgi), to the C.lavaretus complex, revealed by the mtDNA sur\ey, is confirmed using a nuclear DNA marker II Abstr. of the VIII International Symposium on Biology and Management of Coregonid Fishes, Rovaniemi, Finland, 26-29 August, 2002. P. 51.
13. Sukhanova L.V., Smirnov V.V., Smirnova-Zalumi N.S., Kirilchik S.V., Shimizu I. Grouping of Baikal omul Coregonus autumnalis migratorius (Georgi) within the C. lavaretus complex confirmed by using a nuclear DNA marker// Annales Zoologici Fennici. 2004. V. 41(1). P. 41-49.
14. Sukhanova L.V., Kirilchik S.V., Smirnov V.V. Evolution of Lake Baikal coregonid fishes as revealed by DNA analysis II Abstr. of the First Baikal International Workshop on Evolutionary Biology "Tracing Past Environmental Changes in the Genetic diversity of Contemporary Faunas", Irkutsk, 6-11 September, 2004.
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю С.Я. Слободянюку за помощь и поддержку; сотруднику Байкальского музея СО РАН В.В. Смирнову и сотрудникам ЛИН СО РАН Н.С. Смирновой, СВ. Кирильчику за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах работы; A.M. Мамонтову за консультации и помощь в сборе материала; И.Б. Книжину, А.Н. Матвееву (Иркутский Госунивеситет), А.В. Соколову, А.И. Бобкову (Воссибрыбцентр, г. Улан-Уде), Н.М. Пронину (Ин-т Общей и экспериментальной биологии, г. Улан-Уде) за помощь в сборе материала; а также сотрудникам ИЦиГ (г. Новосибирск) С.А. Демакову и А.Г. Блинову за ряд ценных предложений, высказанных на этапе подготовки диссертационной работы.
Таксономический статус и происхождение байкальского омуля
Байкальский омуль принадлежит к роду Coregonus семейства Corcgonidae (Атлас пресноводных рыб России, 2002). Обитая в пелагиали озера Байкал до гл бин 350-400 м, омуль обладает морфологическими особенностями, типичными для представителей группы пелагических сигов (ciscoes): конечный рот, большое количество жаберных тычинок и характеристики тела рыбы, питающейся в пелагиали. Общее морфологическое сходство с пелагическими сигами, и, прежде всего, с арктическим омулем Coregonus autumnalis (Pallas), до сих пор служит основанием считать его эндемичной формой последнего. В официальных таксономических сводках байкальский омуль числится подвидом арктического омуля, Coregonus autumnalis migratorius Georgi (Аннотированный каталог, 1998; Атлас пресноводных рыб России, 2002).
Впервые байкальский омуль был описан И. Георги (1775) как Salmo migratorius. В 1776 году идентифицирован П.Палласом как арктический омуль (Arctic cisco) Salmo autumnalis, который населяет опресненные районы арктических морей и размножается в северных реках, таких как Печера, Кара, Енисей, Хатанга, Яна, Индигирка и другие. Данилевский (1862), Дыбовский (1876), Варпаховский (1901) также идентифицировали байкальского омуля как арктического, присвоив ему видовое название Coregonus omul (цитировано по (Berg, 1948, р.344)). Л.С.Берг (1948) описал байкальского омуля как Coregonus autumnalis migratorius, т.е. подвид арктического омуля Coregonus autumnalis (Pallas). Это мнение разделяли Г.В. Никольский и Ю.С.Решетников (Nikolsky and Reshetnikov, 1970; Решетников, 1980, 1995, Аннот. каталог - 1998; атлас - 2002). В подвидовом названии отражено объяснение, каким образом арктический омуль оказался в Байкале (migratorius - мигрирующий). Т.е., согласно наиболее распространенной точке зрения, омуль проник в Байкал из Ледовитого океана по системе северных рек, когда уровень моря был высоким (Березовский, 1927; Berg, 1948, Мухомедиаров, 1942; Nikolsky and Reshetnikov, 1970; Reshetnikov, 1980).
Начиная с 40-х годов, существовала и другая точка зрения. На основе сравнительно-морфологического анализа (Мухомедиаров, 1942; Gazowska, 1960; Шапошникова, 1968; Smith and Todd, 1992; Черешнев, 1994) байкальского омуля выделили в отдельный вид Coregonus migratorius (Georgi). Той же точки зрения придерживались Р. Бенке (Behnke, 1972) и П.Л. Пирожников с соавторами (1975). При этом большинство исследователей продолжало считать байкальского омуля эндемичной формой арктического омуля, и только некоторые авторы высказывали гипотезу о его независимом внутриконтинентальном автохтонном происхождении (Дрягин и др., 1969; Карасев, 1977, 1987; Черешнев, 1994).
История изучения происхождения омуля и его таксономического статуса - характерный пример сложностей, с которыми сталкивались исследователи, занимавшиеся филогенетическими реконструкциями и эволюцией сиговых. Первой попыткой определить степень генетического родства между байкальским омулем и его предполагаемым ближайшим родственником, арктическим омулем, были серологические исследования Д.Н. Талиева (1940). Автором показаны близкие значения титра реакции преципитации между антисывороткой против ангарской расы байкальского омуля и антигенами как арктического омуля (р. Енисей), так и байкальских речного и озерного сигов. Однако, по утверждению самого автора, "отвечают ли эти определения истинному серодиагиостическому родству ангарской расы байкальского омуля с енисейским (арктическим) омулем сказать вполне определенно затруднительно, т.к. антиген енисейского омуля был получен не из свежей (как все прочие антигены), а из подсоленной мускулатуры" (по Д.Н. Талиеву, 1940, стр. 302).
Опыты по гибридизации ДНК (Каукоранте, Медников, 1988) показали обособленность байкальского омуля от арктического омуля. Коэффициент дивергенции (CD), рассчитанный по значениям термоустойчивости гибридных ДНК равен 29,1%. Однако вызывает сомнение пропорциональность между полученными коэффициентами дивергенции и степенью реальных генетических различий между исследованными в работе видами. Так, например, коэффициент дивергенции в реакции С. pollan (ирландский омуль) х C.lavaretus (европейский сиг) очень мал (CD=5.1%) по сравнению с парой ирландский омуль х арктический омуль (CD=18.5%). Это полностью противоречит данным рестрикционного анализа митохондриальной ДНК (Bernatchez et al., 1991) и изофементного анализа (Ferguson et al., 1978; Bodaly et al., 1991), в которых представлены все основные представители семейства Coregonidae. Данные этих двух анализов, полученные с помощью независимых генетических маркеров, имеющих разный механизм наследования, хорошо согласуются между собой. В то же время, результаты последующих работ по изоферментам, касающиеся байкальского омуля, оказались противоречивыми. Так, в работе Д. Бодали и соавторов (Bodaly et al., 1994) к уже опубликованным данным по изоферментному анализу сиговых Европы и Северной Америки (Bodaly et al., 1991) добавлены данные для пяти сибирских представителей сиговых, среди которых и байкальский омуль. В тезисах, предшествующих этой п бликации, авторы подчеркивают, что сибирские популяции похожи генетически на популяции тех же самых таксонов, обитающих вне Сибири, "исключая байкальскую форму арктического омуля, Coregonus autumnalis migratorius Georgi, которая генетически совершенно отличается от всех других Arctic cisco types" (Bodaly et al., 1993). Под Arctic cisco types авторы подразумевают группу пелагических омулевидных сиговых (Arctic cisco -С, autumnalis, Pollan - С. pollan, Bering cisco - С. laurettae, Lake cisco - C. artedn) более тесное родство которых между собой, чем с другими членами семейства Coregonidae было показано рестрикционным анализом мтДНК (Bernatchez et al., 1991) и анализом изофементов (Bodaly et al., 1991). Однако в вышедшей затем статье приведенные значения генетических расстояний между байкальским и арктическим омулем не превышают, по словам авторов, подвидовые значения. Позднее, на тех же изоферментных системах, Д. Политовым и соавторами был выполнен анализ шести видов сибирских сиговых (Politov et al., 2000, 2002).
Согласно полученным результатам, байкальский омуль оказался близок не к своему признанному таксономическому родственнику - арктическому омулю, а к представителям группы сигов с нижним ртом (true whitefish): пыжьяну, С. lavaretus pidschian, муксуну, С. muksun и чиру, C.nasus. Поскольку совместно с омулем в Байкале обитают два представителя С. lavaretus complex (это озерная, С. lavaretus baicalensis Dyb., и озерно-речная, С. lavaretus pidschian (Gmelin), формы), выявленное сходство авторы больше были склонны объяснить возможной гибридизацией между арктическим омулем и каким-либо из представителей С. lavaretus (Politov et al., 2000, 2002). В дальнейшем рестрикционный анализ продуктов амплификации фрагмента мтДНК тех же шести видов сибирских сиговых показал, что байкальский омуль является самым полиморфным, по сравнению со всеми остальными исследованными в работе видами, в том числе и арктическим омулем (Politov et al., 2000). Авторы отмечают, что популярная гипотеза о происхождении байкальского омуля в результате позднеплейстоценовой миграции арктического омуля в Байкал по Лене или Енисею выглядит очень неправдоподобной, поскольку маловероятно, чтобы такой полиморфизм возник за короткий период. Высказывается гипотеза о том, что даже если байкальский и арктический омули и образуют монофилетичную группу (что маловероятно), то байкальский омуль скорее является не потомком предка арктического омуля, а его пре-плейстоценовым предком. Далее, с помощью того же метода, Д. Политов и соавторы проводят детальный филогеографический анализ Палеоарктических и Неоарктических пелагических сиговых, ciscoes (Politov et al., 2004). Авторы приходят к выводу, что байкальский омуль занимает корневое положение по отношению ко всей группе омулевидных сигов, упоминавшихся выше как Arctic Cisco types. Они рекомендуют сохранить за байкальским омулем статус вида с названием С. migratorius (Georgi), предложенным ранее (Gasovska, 1960; Shaposhnikova, 1968). А принимая во внимание мофологические особенности байкальского омуля (Мухомедиаров, 1942; Gasowska, 1960; Шапошникова, 1968; Smith and Todd 1992; Черешнев, 1994) и близость к сигам с нижним ртом, показанную анализом мтДНК и изоферментов (Politov et al., 2000, 2002), Д. Политов и соавторы делают предположение о возможном базальном положении байкальского омуля по отношению ко всему роду Coregonus.
Краткая геолого-климатическая история оз. Байкал
Демографическое и генеалогическое прошлое популяций и видов тесно связано с геологическими событиями, которые обеспечивают или ограничивают приемлемые условия обитания. Обычно филогеографические выводы делают на основе сравнения генетических данных с независимо возникшими теориями, описывающими геологическую и климатическую историю территорий, населяемых изучаемыми организмами. Такие сопоставления часто существенно дополняют друг друга, а также служат индикаторами правдоподобности выстраиваемых гипотез.
Многие филогеографические исследования продемонстрировали, что доминирующую роль в распределении современного генетического разнообразия сыграли события недавнего прошлого. В частности, становится очевидным, что изменения условий окружающей среды в течение ледниковых периодов были наиболее значительными событиями, повлиявшими на эволюцию многих ныне живущих видов (Hewitt, 1996; Avis, 2000; Hewitt, 1999; 2001). Например, еще 18 тыс. лет назад большая часть Северной Европы (около 6,6 миллионов км2) была покрыта 3-х километровым скандинавским ледовым щитом (Svendsen et al., 1999). В этот же период времени огромный ледовый щит укрывал и большую часть Северной Америки. Периоды оледенений повлияли на видообразование у рыб резким сокращением ареалов обитания и их фрагментации (Avis, 2000). И наоборот, межледниковые периоды также были очень важны эволюционно: талые воды отступающих ледников формировали новые озера и реки, которые обеспечивали большие возможности для выживания и распространения популяций вдоль границ ледников (Avis, 2000). И, наконец, действовал мощный естественный отбор, благодаря адаптации популяций к постоянно изменяющимся условиям среды.
С этих позиций данные палеогеографических исследований региона Байкала важны для понимания эволюции населяющих его видов. Современные теории, описывающие историю этой древней экосистемы, преимущественно основываются на геологических доказательствах. Байкал, самое глубокое (1637 м) и, одно из самых древних озер в мире, расположено на территории активной континентальной рифтовой системы - Байкальской рифтовой зоны (БРЗ), протяженность которой более 2000 км. Озеро занимает центральную, самую глубокую ее часть. К настоящему времени накоплен обширный материал по истории формирования байкальской котловины, которая делится на два крупных этана: дорифтовая (70-35 млн. лет) и рифтовая (35-0 млн. лет) стадии (Логачев и др., 1974; Mats, 1993). Рифтовая стадия делится на две подстадии: ранний орогенный (35 - 3,5 млн. лет) и поздний (необайкальский) орогенный (3,5 - 0 млн. лет) этапы, которые разделены фазой тектонической активизации на границе раннего и позднего плиоцена. В дорифтовую стадию на месте современного Байкала уже существовали неглубокие котловины. Во время раннего орогенного этапа произошло формирование крупных рифтовых котловин, не заполненных полностью осадками и занятых глубокими озерными бассейнами. На этом этапе сформировались южная и центральная байкальские котловины. Формирование северной котловины произошло в интервале 10-3,5 млн. лет. Необайкальский этап характеризовался ускорением темпов тектонической активности. Произошло значительное углубление котловин и поднятие горного обрамления. Этот этап разделяется на две стадии (Логачев и др., 1974). На ранней стадии определились крупнейшие черты БРЗ: происходило общее поднятие Саяно-Байкальского нагорья, древние плоские котловины превратились в рифтовые впадины, а низкогорные поверхности - в горный рельеф высокой контрастности. Горные хребты, окружающие озеро, достигли высот, достаточных для образования горнодолинных ледников, поэтому во время глобального похолодания Земли, 2,8 - 2,4 млн. лет назад, произошло формирование ледников в горном обрамлении озера. Поздняя стадия, начинаясь вторым глобальным похолоданием (1,75 - 1,45 млн. лет), охватывает классический плейстоцен и продолжается до сих пор. В ледниковые периоды озеро превращалось в огромный приледниковый водоем, что приводило к кардинальным изменениям, как в седиментационном процессе, так и в экосистеме озера (Карабанов, 1999). Своеобразной записью климатических изменений на протяжении необайкальской стадии рифтогенеза являются изменения содержания биогенного кремнезема и створок диатомовых водорослей в осадках озера Байкал (Grachev et al., 1998; Хурсевич, 2001). Согласно "байкальской записи" в рамках плейстоцена выделяется не менее 30 оледенений. Особенно сильно оледенения охватывали горные хребты (Баргузинский и Хамар-Дабан) восточного борта байкальской котловины. Ледники были также развиты на Приморском хребте западного борта. По реконструкции Логачева и др. (1974) вершины и долины гор, окружающих Северную котловину озера, были покрыты ледниками. Периодические оледенения приводили к значительным колебаниям уровня озера (Mats, 1993): похолодание и иссушение климата значительно уменьшало речной сток, а при потеплении в озеро поступало большое количество талых ледниковых вод. Возраст последнего похолодания согласно "байкальской записи" составляет 11,3 - 9,5 тыс. лет. Икра рыб посольской (Посольский сор, п=81), селенгинской (р.Селенга, п=38), и северобайкальской (р. Кичера, р. Верхняя Ангара, п=45) популяций байкальского омуля собрана в основных притоках озера Байкал в нерестовый период, в 1991 - 1993 гг. (Рис.2).
Суммарную ДНК для амплификации фрагментов митДНК и ядерного генома внебайкальских и некоторых байкальских представителей выделяли из фиксированной в 96% этаноле печени методом, описанным Сэмбруком и соавт. (Sambrook et al., 1989) с некоторыми модификациями. К 10 - 15 мм печени добавляли 100 мл раствора 0,5% детергента NP-40, 10 мМ Трис-НСІ рН 8,0 и инкубировали 2 мин. при 96 С. Затем добавляли протеиназу К до концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при 65 С 30 мин. Для инактивации протеиназы К смесь прогревали до 96 С 8 мин. Затем добавляли равный объем смеси фенола с хлороформом (1:1) и перемешивали. Фазы разделяли центрифугированием. Экстракцию смесью фенола с хлороформом повторяли 2 раза. Для осаждения ДНК к раствору добавляли NaAc рН 5,2, до концентрации 0,3 М, и два объема этанола. Смесь центрифугировали. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в буфере ТЕ.
Митохондриальную ДНК для рестрикционного анализа выделяли из икры половозрелых самок. Икру гомогенизировали в растворе содержащем 0,25 М сахарозы, 10 мМ Трис-НСІ рН 8,0, 1 мМ ЭДТА. Препараты митохондрий получали дифференциальным центрифугированием полученного раствора (Jones et al.,1988) при 3000 об./мин., 15-20 мин. При этом неповрежденные митохондрии оставались в растворе, а осадок удаляли. Митохондрии осаждали на центрифуге J2-21 в роторе JA-14 при 13000 об./мин. 25 мин. Осадок размешивали в растворе содержащем 10 мМ Трис-НСІ рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Для лизирования митохондрий к суспензии добавляли SDS до концентрации 2%, протеиназу К до концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при 65С 30 мин. Для инактивации протеиназы К смесь прогревали до 96С 8 мин. Далее очистку фенольной экстракцией и осаждение ДНК проводили как и при выделении суммарной ДНК.
Прямое определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК
Определение нуклеотидной последовательности ДНК с помощью радиоактивных изотопов проводили согласно Муррею (Murrey, 1989). ПЦР-продукт очищали от других компонентов реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим вырезанием нужного фрагмента и пассивной электроэлюцией. Количество продукта амплификации в агарозном геле определяли визуально. Для элюции ДНК, вырезанный кусочек агарозы помещали в 300-500 мкл дважды дистиллированной воды, и инкубировали при температуре 5-7 С, в течение 2-3 дней. Получившийся, таким образом, раствор использовали в качестве раствора матричной ДНК для определения нуклеотидной последовательности. 5 -концы праймеров метили изотопом фосфора у- Р в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 10 пмоль праймера, 15 пмоль [у-32Р] ATP (уд. акт. 5000 Ки/ммоль), 5 ед. акт. полинуклеотидкиназы T4, 10 мМ трис-HCl рН 7,6, 10 мМ MgCh, 5 мМ [3-меркаптоэтанол, 2 мМ спермидин. Реакцию проводили при 37 С в течение 30 минут, затем смесь нагревали до 96 С 2 минуты для инактивации полинуклеотидкиназы Т4. Чтобы определить нуклеотидную последовательность амплифицированных продуктов, проводили реакцию ПЦР в 10 мкл реакционной смеси (0,1 пмоль у-32Р меченого праймера, 2,5 мкМ суммы dNTP, 10 мМ Трис-НС1 [рН 8,9], 4 мМ MgCl, 40 мМ KCL, 0,1 мг/мл БСА, 0,5 мМ одного из дидезоксирибонуклеозидов (для ddGTP использовалась концентрация 0,05 мМ), 1-10 нг ДНК, 1 ед. акт. Taq полимеразы) последовательным 20 кратным повторением следующих стадий: плавление - 94 С, 70 сек.; отжиг 55 С, 90 сек.; полимеризация 72 С, 120 сек. Продукт амплификацни разделяли в 7,5% полиакриламидном геле, затем гель вымачивали 20 мин. в 7% растворе уксусной кислоты и 20 мин. в воде, после этого высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 12 - 72 часов.
Продукт амплификации для автоматического секвенирования готовили, используя колонки для очистки ПЦР-продукта (QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN K.K., Japan). Нуклеотидную последовательность ДНК определяли с помощью наборов для секвенирования фирмы "Amersham" (Dye Terminator Cycle Sequencing Kit) в соответствии с инструкцией. Для разделения и визуализации фрагментов использовали секвенатор ABI 373А.
Гомогенность популяций (F) вычисляли как сумму квадратов относительных частот гаплотипов (Jonson et al., 1983) выявленных рестрикционным анализом мтДНК. Статистическую достоверность межпопуляционных различий в частотах гаплотипов мтДНК оценивали с помощью модифицированного критерия % G (Животовский, 1991).
Исходя из данных по рестрикционным фрагментам для количественной оценки доли общего полиморфизма мтДНК, приходящегося на межпопуляционные различия, (коэффициент Нея Gst), определяли величины внутри и межпопуляционной вероятности идентичности двух случайно выбранных митохондриальных геномов I и J, соответственно (Takahata and Palumbi, 1985). Анализ распределения наблюдаемого числа различий между парами гаплотипов мтДНК (pairwise mismatch analysis) проводили с помощью программы ARLEQU1N (Schneider et al., 2000). Данные по рестрикционным фрагментам мтДНК обрабатывали также с помощью пакета программ RESTSITE v. 1.2. (Miller, 1991, 1994), в которой:
Величина дивергенции между последовательностями каждой пары гаплотипов мтДНК, выраженная как процент замен нуклеотидов на рестрикционный сайт, оценивается на основе модели эволюции мтДНК Нэя и Таджимы (Nei and Tajima, 1983). Модель предполагает, что все 4 нуклеотида распределены вдоль ДНК случайным образом и эволюция происходит путем случайных замен отдельных нуклеотидов. Число нуклеотидных замен на сайт определяется, исходя из доли общих фрагментов, отдельно для каждого класса ферментов (Nei and Li, 1979; Nei, 1987; Nei and Miller, 1990).
- Величина дивергенции 7Г между последовательностями гаплотипов внутри и между популяциями (то же, что и полиморфизм мтДНК) и величины генетических дистанций d между популяциями определяются согласно Нею и Ли (Nei and Li, 1979). При расчете d определяется поправка на полиморфизм предковой популяции исходя из всех имеющихся в популяциях гаплотипов. - Стандартные ошибки полученных значений определяются методом "складноВД Шжк", последовательным исключением из анализа данных по каждой из используемых рестрикционных ферментов (Efron, 1982), или bootstrap анализом (Jukes and Cantor, 1969). - Для построения филогенетических схем используются методы UPGMA (Sneatch and Sokal, 1973) и NEIGHBOR (Satou and Nei, 1987), где в качестве исходных данных фигурирует матрица генетических расстояний. Нуклеотидные последовательности выравнивались с помощью программы CLUSTAL W (version 1.7) и, при необходимости (в случае анализа Д-петли и ITS1), корректировались вручную. Первичный анализ последовательностей проводился с помощью программы MEGA 2.1 (Kumar et al., 1993 - 2001; URL: http//www.megasoftware.net). Определялись основные характеристики последовательностей: нуклеотидныи состав, частоты кодонов. Эта же программа использовалась при трансляции нуклеотидных последовательностей в аминокислотные. Попарные генетические расстояния определяли с помощью модели Jukes-Cantor (Jukes and Cantor, 1969) и двухпараметровой модели Кимуры (Kimura, 1980), используя опции как попарного, так и полного исключения недостающих данных (делеции/вставки, неопределенные нуклеотиды). Для построения филогенетических схем также использовали программу MEGA 2.1 (Kumar et al., 1993 - 2001). Схемы, использующие в качестве исходных данных матрицу генетических расстояний строили методом объединения ближайших соседей (Neighbour-Joining method, Saitou and Nei, 1987). Метод максимальной экономии (Maximum Parsimony method, Fitch, 1971) применяли для построения максимально экономного дерева, для которого определяющим является количество филогенетически информативных позиций. При построении максимально экономного дерева использовали опции как попарного, так и полного исключения недостающих данных (делеции\вставки, неопределенные нуклеотиды). Оценку достоверности монофилетичности отдельных кластеров филогенетических деревьев проводили бутстреп анализом (Felsenstein, 1985).
Молекулярная филогения байкальских сиговых, основанная на нуклеотидных последовательностях фрагментов генома
Для исследования родственных связей и истории появления омуля в Байкале проведен анализ филогенетических взаимоотношений байкальского омуля с некоторыми представителями семейства Coregonidae, обитающими в озере и за его пределами (табл. 1). Выбраны два независимых молекулярно-филогенетических маркера: фрагмент ядерного генома - внутренний транскрибируемый спейсер рибосомальной ДНК - ITS 1, и два района мтДНК: область контроля репликации и белок-кодирующая последовательность гена цитохрома b. Нуклеотидные последовательности вышеуказанных фрагментов генома определены у 12-ти представителей семейства и помещены в банк данных EMBL под указанными в таблице 1 номерами.
Сравнение 12-ти полных последовательностей (1140 п.н.) гена цитохрома b сиговых рыб, перечисленных в таблице 1, выявило 69 вариабельных позиций, что составляет 6% от всей проанализированной последовательности гена. 53 позиции являются филогенетически информативными. Только 2 вариабельных сайта находилось в первой и второй позиции кодона, мутация в одном из которых привела к несинонимичной замене. Состав оснований смещен в сторону уменьшения G и равен 28,4%, 30,8%, 23,7% и 17,2 для Т, С, А и G, соответственно. Среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии составило 4,6. Попарная дивергенция последовательностей варьировала от 0.1% до 4.8% замен нуклеотидов.
Полные длины последовательностей области контроля репликации мтДНК были определены для 5-ти таксонов (табл. 1) и составили от 1080 до 1163 п.н. Выявлена 61 вариабельная позиция, что составляет около 5% последовательности. Среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии составило 2,6. В среднем состав оснований Т, С, А и G равен 30 6%о, 23.9%, 31.1% и 14.5%, соответственно, и сходен во всех последовательностях.. Наблюдается смещение в сторону содержания оснований А и Т, что вполне логично для легкоплавкого района мтДНК, отвечающего за начало репликации. Попарные значения дивергенции последовательностей оказались близки таковым у гена цитохрома Ь и варьировали в пределах (0.1% - 4.1%). Сходство значений дивергенции последовательностей контрольной области и гена цитохрома Ъ, кодирующего белок со сравнительно невысоким темпом эволюции, подтверждает обнаруженную ранее у лососевидных рыб (Shedlock et al., 1992) низкую скорость эволюции этой некодирующей области митДНК, в то время как у большинства животных часто отмечаются более высокие темпы накопления замен в контрольной области, в три-пять раз и более превышающие таковые в остальных участках митохондриального генома (Avis, 2000). Шедлок и соавторы (Shedlock et al., 1992) определили полную нуклеотидную последовательность контрольной области мтДНК у восьми видов анадромных тихоокеанских лососей рода Oncorhynchus, у атлантического лосося, Salmo salar, и у представителя семейства Thymallidae - арктического хариуса, Thymallus arcticus.
Сравнение последовательностей продемонстрировало, что консервативные элементы последовательностей, прежде описанные для других позвоночных, поддерживаются и в этой группе костистых рыб. Выявленное авторами неслучайное распределение нуклеотидных замен, инсерций и делеций, свидетельствует о том, что отдельные участки области контроля репликации мтДНК находятся под разным давлением отбора, и что большая часть области контроля репликации этих рыб может эволюционировать со скоростью сходной с таковой для остальной части митохондриального генома. Таким образом, выявленный нами характер накопления и распределения мутаций согласуется с таковым, известным у позвоночных животных (Saccone et al., 1987), у рыб (Lee et al., 1995) и у лососевидных рыб (Shedlock et al., 1992), в частности. Исследованные последовательности состоят из консервативных и вариабельных блоков (рис. 3). Все инсерции/делеции находятся в районах непосредственно прилегающих к последовательностям, кодирующим транспортные РНК, которые ограничивают контрольную область с флангов. Тот факт, что среднее попарное соотношение транзиции/трансверсии в контрольной области мтДНК исследованных нами таксонов оказалось почти в два раза меньше, чем в последовательностях гена цитохрома b мтДНК (2,6 против 4,6, соответственно), по-видимому, является следствием того, что отдельные участки контрольной области находятся под действием отбора (Shedlock et al., 1992).
Неполные последовательности области контроля репликации мтДНК (отсутствует центральная часть длиной 390 п.н.) определены для семи представителей С. lavaretus из прибайкальских водоемов. Общие длины последовательностей, без отсутствующей центральной части, варьировали от 768 до 863 п.н. Характер распределения замен в проанализированных фрагментах сходен с таковым у описанных выше полных последовательностей этого района мтДНК.
Общая длина всех проанализированных последовательностей ДНК контрольной области варьировала в пределах от 1080 до 1175 п.н. Полиморфизм длины вызван присутствием танде.мно повторяющихся последовательностей в участке, соседствующем с геном фенилаланиновой тРНК (рис.3). Длина повтора варьирует от 81 до 95 п.н. Все полученные последовательности можно разбить на группы, характеризующиеся своим рисунком повторов. Так контрольная область мтДНК арктического и ирландского омулей содержит четыре повтора. Последовательности всех байкальских сиговых на один повтор короче. Представителей С. lavaretus из прибайкальских водоемов можно разделить на две группы. У одной группы рисунок повтора повторяет таковой у байкальских сиговых. У другой группы добавляется четвертый повтор, но его нуклеотидная последовательность отличается от четвертого повтора арктического и ирландского омулей.
Вариации длины мтДНК на популяционном уровне не характерны для позвоночных, хотя несколько примеров полиморфизма длины показано у рыб (Bermingham et al., 1986; Broun et al., 1992). У сиговых полиморфизм длины мтДНК был обнаружен в популяциях наиболее полиморфных видов семейства, С. artedii, (Shields et al., 1990) и С. lavaretus (Brzuzan, 1998). Каждая исследованная популяция характеризовалась присутствием варианта длины, который не был найден в другой популяции. Было показано, что у данных видов полиморфизм длины обусловлен именно наличием тандемно повторяющихся последовательностей в участке контрольной области мтДНК, соседствующем с фенилаланиновой тРНК (Brzuzan, 2000). Обычно, при построении филогенетических схем районы, содержащие сложные протяженные делеции/вставки исключаются из анализа, т.к. трудно поддаются выравниванию и, соответственно, могут увеличивать ошибку при расчетах. В то же время, области, подобные тандемным районам контрольной области мтДНК сиговых, могли бы быть существенным дополнительным источником информативных сайтов, дефицит которых наблюдается при исследовании популяций и близкородственных таксонов.
