Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Методы сравнительной цитогенетики 12
1.1.2 Сравнительное картирование 13
1.1.3 Хромосомньмгойшингвсршшпшшойцитогенешке 14
1.1,4 Кладисшческий анализ в сравнительной 20
1.2 Характеристика подсемейства 23
12.1 Систематика 23
122 Кариспипическое разнообразие подсемейства Ашсоїіпае 27
123 Скорость эволюции в подсемействе Агуісоїіпае 35
1.3 Хромосомный пэйнтинг в исследовании кариотипических отношений видов подсемейства Агуісоїіпае 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1 Материалы 46
2.1.1 Растворы иреактвы 46
2.12 Суспензии фиксированных мепафазныхклегок 48
2.2 Методы 51
2.2.1 Получение и культивирование первичных фибробласгов 51
2.2.1.1 Методы получения культур 51
2.2.1.2 Культивирование и криоконсервация 53
222. Получение суспензии фиксированных клеток 54
2.2.2.1 Фиксация клеток костного мозга 54
2.2.2.2 Получение фиксированных клеток га культур первичных фибробластов...55
2.2.2.3 Хранение фиксированных клеток 56
22.3 Дифференциальное окрашивание хромосом. 57
22.4 Хромосомный гойншнг 58
2.2.4.1 Характеристика наборов сортированных хромосом 58
2.2.4.2 Выделение СоіЮДНКМ. гоззіаетегісіїопаїін 63
2.2.4.3 Реамплификация библиотек в БОР-ПЦР 63
2.2.4.4 Меченые зондов в DOP-ПЦР 64
2.2.4.5 Флуоресцентная in situ гибридизация 64
22.5 Получение и обработка изображения 65
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 66
3.1 Локализация хромосомных проб пашенной полевки — Microtus agrestis - на хромосомы шестнадцати видов подсемейства Arvicolinae 66
3.1.1 Род Mcwus 67
3.1.3 Род Bkmfordmiys, Lasiopodomys, Chiommys, Arvcola, Qetlirioriomys, Dicmstonyx 80
3.2 Реципрокный пэйнтинг между хромосомами копытного лемминга - Dicrostonyx torquatus и пашенной полевки — Microtus agrestis 85
3.3 Локализация пэйнтинг-проб половых хромосом М. agrestis на хромосомы исследуемых видов подсемейства Arvicolinae 87
3.4 Сопоставление GTG-окрашенных хромосом М. agrestis с хромосомами М. clarkei, Е. proditor, Е. miletus 89
3.5 Реконструкция предковых кариотипов 95
3.6 Возможный ход эволюции подсемейства полевковых. Скорость кариотипических преобразований 101
Заключение 115
Выводы 117
Список литературы 118
- Сравнительное картирование
- Характеристика подсемейства
- Получение и культивирование первичных фибробласгов
- Локализация пэйнтинг-проб половых хромосом М. agrestis на хромосомы исследуемых видов подсемейства Arvicolinae
Введение к работе
Актуальность проблемы Изучение генома является одной из актуальных задач генетики На основании данных по картированию геномов человека и других видов млекопитающих удалось показать, что синтенные группы генов в течение многих миллионов лет сохранились неизменными (Nash, O'Brien 1982)
С помощью методов классической цитогенетики были предложены первые предковые кариотипы для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающігх (Viegas-Pequignot et al 1985, Dutnllaux, Couturier 1983, Graphodatsky 1989) Однако из-за внутрихромосомных перестроек многие районы синтении не выявляли видимой цитологической гомологии Появление метода хромосомного пэйнтинга позволило избавиться от многих ограничений в сравнительных исследованиях. Метод основан на использовании наборов индивидуальных библиотек сортированных или микродиссектированных хромосом (пэйнтинг-проб) разных видов животных Использование этих наборов в гетерологичной флуоресцентной гибридизации in situ (Zoo-FISH) явилось прорывом в цитогенетике млекопитающих, так как с его помощью стало возможным быстро и эффективно сравнивать геномы филогенетически далеких видов животных Полученные данные свидетельствуют о том, что в эволюции большинства таксонов млекопитающих не происходило перераспределения генетического материала между крупными консервативными районами, сохранившимися целиком у современных видов Можно считать, что эти районы присутствовали и в кариотипе предка плацентарных млекопитающих (Murphy et al 2001) В то же время в ряде таксонов (Canidae, Hylobatinae, Cncetidae-Mundae) высокая частота хромосомных перестроек приводила к массовой перетасовке предковых синтенных групп и быстрой реорганизации геномов (Графодатский 2001) Скорость кариотипическои эволюции не одинакова в разных таксонах млекопитающих Практически каждый таксон млекопитающих характеризуется как определенным набором консервативных районов, так и специфическими перестройками между и внутри этих районов
Настоящая работа посвящена изучению грызунов подсемейства полевковых Arvicolinae (полевки и лемминги) на основе использования метода сравнительного хромосомного пэйнтинга Подсемейство представляет значительный интерес межвидовыми контрастами базовых кариотипических характеристик локализация и размеры блоков С-гетерохроматина, наличие добавочных хромосом, широкая вариабельность диплоидных чисел, нестандартная система определения пола у некоторых видов Подсемейство Arvicolinae является весьма интересным объектом для исследования закономерностей хромосомной эволюции, так как объединяет виды, обладающие одними из самых перестроенных и быстро эволюционирующих геномов в классе млекопитающих (Ferguson-Smith
1997, Conroy, Cook 1999, Galewski et al 2006). Кариотипы большинства представителей Arvicohnae описаны с помощью методов классической цитогенетики рутинной и дифференциальных окрасок Вследствие значительной перестроенности хромосом выявление гомологичных элементов в кариотипах некоторых видов часто оказывалось затруднительным без применения современных молекулярно-цитогенетических методов, таких как хромосомный пэйнтинг
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является исследование кариотипических взаимоотношений полевок подсемейства Arvicohnae Для достижения данной цели, были поставлены следующие задачи
Охарактеризовать кариотипы представителей подсемейства Arvicohnae с помощью пэйнтинг-проб пашенной полевки (М agrestis)
Сравнить хромосомы М agrestis и копытного лемминга (D torquatus) с помощью реципрокного пэйнтинга
Реконструировать предковые кариотипы для рода Microtus, рода Ellobius и для подсемейства Arvicohnae
Реконструировать вероятную последовательность преобразований, приведшую к формированию кариотипов современных видов полевковых
Оценить темпы кариотипической эволюции видов подсемейства Arvicohnae
Положения, выносимые на защиту.
При сравнении кариотипов видов подсемейства Arvicohnae истинную гомологию некоторых хромосом и хромосомных районов возможно установить только с привлечением сравнительного хромосомного пэйнтинга Кариотипы современных видов сформированы на основе различных комбинаций гомологичных хромосомных элементов
Сравнение консервативных элементов в геномах видов подсемейства Arvicolmae и видов из аутгруппы дает возможность реконструировать гипотетический предковый кариотип этого подсемейства и построить схему, отражающую возможный ход кариотипических преобразований, приведших к формированию современных видов
Темпы эволюции кариотипов в подсемействе Arvicohnae неодинаковы в разных филогенетических ветвях и в среднем значительно выше, чем во многих других таксонах млекопитающих
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые проведено GTG-окрашивание М dogramacu и L brandtn Полученные данные использованы для сравнения этих видов с другими представителями полевковых Arvicolmae
Впервые проведена гомологичная гибридизация in situ набора сортированных хромосом М agrestis, что позволило охарактеризовать этот набор пэйнтинг-проб и эффективно использовать его в исследовании кариотипов полевковых Arvicolinae Хромосомные пробы М agrestis локализованы на хромосомах 17 других видов полевковых, выявлена межхромосомная гомология кариотипов исследованных видов
Впервые по результатам пэйнтинга составлена хромосомная карта, включающая сравнение кариотипов 15 видов полевковых Arvicolinae Это позволило наглядно представить гомологичные ряды хромосом, описать кариотипические преобразования, свойственные представителям этого подсемейства В дальнейшем такие хромосомные карты могут быть использованы в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов
Предложены предковые кариотипы для представителей рода Microtus, рода Ellobim и подсемейства Arvicolinae Реконструкция предкового кариотипа подсемейства необходима для воссоздания полной картины кариотипической эволюции, приведшей к формированию хромосомных наборов исследуемых ныне живущих видов
Впервые на основе сравнения истинно гомологичных районов хромосом построено филогенетическое древо, отражающее возможный ход кариотипической эволюции полевковых Arvicolinae Полученные результаты в совокупности с данными зоологических, палеонтологических и молекулярно-генетических исследований, могут быть полезны для уточнения таксономического положения некоторых видов полевковых, для выявления факторов, обуславливающих хромосомные преобразования, и для оценки скорости кариотипической эволюции видов этого подсемейства
Апробация работы. Результаты работы были доложены на следующих конференциях 1) Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы» Новосибирск, 26-29 июня 2005 г, 2) XV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра" Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г, 3) Динамика генофондов растений, животных и человека Отчетная конференция. Москва 2005 , 4) Динамика генофондов растений, животных и человека Отчетная конференция Москва, ФИАН 2007 г, 5) V конференция молодых ученых СО РАН, посвященная М А Лаврентьеву Новосибирск, 20-22 ноября 2007г
Вклад автора. При непосредственном участии автора были получены культуры первичных фибробластов, суспензии метафазных хромосом, проведено С- и G-дифференциальное окрашивание и анализ хромосом значительной части животных, вовлеченных в исследование Амплификация и мечение зондов, выделение Cot 10 ДНК М rossiaemeridionahs и флуоресцентная in situ гибридизация проводились автором самостоятельно Автором была проведена локализация пэйнтинг-проб пашенной полевки на хромосомы 16 из 18 видов, вовлеченных в данное исследование Гомологичная гибридизация пэйнтинг-проб
M agrestis и гетерологичная гибридизация с метафазными хромосомами М rossiaemeridionahs была выполнена сотрудниками лаборатории НА Сердюковой и кбн НВ Рубцовой Раскладки хромосом для иллюстрации кариотипов М arvalis, М rossiaemeridionahs, М sociahs, В aghanus и С gud были выполнены ранее к б н О В Саблиной (Sablma et al 2006) Автор принимал также непосредственное участие в обработке, анализе и описании полученных результатов
Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (160 ссылок) и два приложения Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и содержит 9 таблиц
Сравнительное картирование
Целью картирования является создание максимально насыщенной упорядоченной карты хромосом, содержащей последовательности различных генов и других генетических маркеров в количестве, соответствующем их встречаемости в геноме.
Долгое время сравнительное картирование хромосом млекопитающих базировалось на использовании гибридов соматических клеток, в том числе и радиационных гибридов. В основании этого методического подхода лежит получение наборов (панелей) клеточных линий, содержащих различные комбинации хромосом и хромосомных фрагментов исследуемого генома на фоне хромосом другого вида. В большинстве случаев картирование с помощью гибридов соматических клеток дает информацию только о синтении, но не о порядке генов.
Широко применяется метод хромосомной локализации с помощью FISH фрагментов ДНК, клонированных в искусственных бактериях (ВАС), PI-фагах (РАС), дрожжевых (YAC) хромосомах (Haaf, Bray-Ward 1996).
Картирование можно проводить с помощью межвидовых гибридных бэккроссов или отдаленных внутривидовых скрещиваний (так называемое рекомбинационное или мейотическое картирование). Метод позволяет создавать насыщенные мейотические карты сцепления (Slate et al. 2002; VandeBerg, Graves 1998).
При помощи наборов геноспецифичных пар праймеров появилась возможность идентификации уникальных последовательностей в геномах большинства млекопитающих. Праймеры были сконструированы на основе сравнительного анализа данных картирования геномов человека и мыши, путем выявления наиболее консервативных пар генов (Lyons et al. 1997).
Выделяют три типа маркеров, на локализации которых основано построение генетических карт многих видов млекопитающих. К первой группе относят кодирующие гены, которые являются низковариабельными (консервативными) и имеют высокую степень гомологии у видов, относящихся не только к разным родам и семействам, но и к разным отрядам. На их базе можно проводить сравнение хромосом у видов с самой разной степенью филогенетической удаленности. Ко второму типу относят короткие тандемные полиморфные повторы (гипервариабельные микросателлиты) которые широко используются при построении родословных, но не используются при межвидовых сравнительных построениях, так как уже на уровне семейства невозможно найти консервативных последовательностей этого типа (O Brien et al. 1997; Graves 1998). Последовательности третьего типа - это общий биаллельный полиморфизм одиночных нуклеотидов в кодирующих участках генов - экзонах, а чаще в некодирующих - интронах, а также в межгенных районах. Такие маркеры бывают полезны для построения родословных и проведения семейных или популяционных внутривидовых исследований.
Сопоставление данных сравнительного картирования и результатов сравнения дифференциально окрашенных хромосом при сравнении филогенетически далеких видов и видов со сложно перестроенными кариотипами показало, что видимое сходство дифференциальной исчерченности не всегда отражает истинную гомологию хромосомных районов. Внутри многих хромосомных элементов в процессе эволюции происходили разнообразные перестройки, изменяющие порядок и взаимное расположение генетических маркеров. Данные по картированию геномов человека и некоторых других видов млекопитающих позволили установить феномен эволюционного консерватизма генетического материала. Консервативные синтенные группы генов были обнаружены у видов, предки которых дивергировали более 70-120 млн. лет тому назад (O Brien etal. 1999; Ferguson-Smith et al 2000).
Основной проблемой сравнительного картирования является невозможность одновременно охватить большое число видов. Низкая насыщенность генами хромосомных карт у большинства исследованных видов млекопитающих не позволяет идентифицировать все гомеологичные сегменты и тем самым ограничивает возможность проводить полноценные межвидовые сравнения. Оказалось, что эти проблемы могут быть успешно решены с помощью метода сравнительного хромосомного пэйнтинга.
С помощью метода хромосомного пэйнтинга удалось избавиться от многих ограничений в сравнительных исследованиях геномов млекопитающих и успешно выявлять гомологию целых хромосом на основании сходства их молекулярно- генетического состава (Scherthan et al. 1994, Ferguson-Smith et al. 2000). В то же время внутрихромосомные перестройки, которые не выявляются с помощью пэйнтинга, можно детектировать, используя данные сравнительного картирования.
Хромосомный пэйнтинг разработан на базе традиционной флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (Pinkel et al. 1988). При этом используются зонды, полученные из материала хромосомного района или целой хромосомы (районо- или хромосомоспецифичные ДНК-пробы). Сигнал, получаемый при пэйнтинге, является результатом совокупной гибридизации различных последовательностей зонда, дающей эффект закрашивания (пэйнтинга) соответствующего района (Chowdhary, Raudsepp 2001). Термины пэйнтинг (painting) и "пэйнт" (paint) были введены Пинкелем с соавторами (Pinkel et al. 1988). Для обозначения ДНК-проб, используемых в различных вариантах хромосомного пэйнтинга, широко используется термин пэйнтинг-пробы.
Варианты хромосомного пэйнтинга
Сравнительный хромосомный пэйнтинг - гетерологичная гибридизация, при которой в качестве зонда используются пэйнтинг-пробы хромосом другого вида. В качестве примера можно привести гибридизацию пэйнтинг-проб хромосом человека на метафазные хромосомы гиббона (Jauch et al. 1992). Вариант пэйнтинга с вовлечением различных видов животных был назван межвидовой пэйнтинг или Zoo-FISH (Scherthan et al. 1994). Можно также различать Zoo-FISH между близкими видами (например, принадлежащими к одному роду или семейству) и так называемый отдаленный пэйнтинг - между таксономически далекими видами (например, принадлежащих разным отрядам).
Однонаправленный хромосомный пэйнтинг представляет собой вариант гетерологичного пэйнтинга, когда пробы хромосом от одного вида используются для исследования кариотипов других видов. Такой вариант позволяет получить общую картину преобразований кариотипа, без учета тонких перестроек (O Brien et al. 1999).
Реципрокный пэйнтинг подразумевает наличие сортированных хромосом двух исследуемых видов и проведение гетерологичной гибридизации в двух направлениях (прямой и обратный пэйнтинг). Это позволяет получить больше информации о количестве перестроек, детально описать и четко обозначить их границы. Такой вариант пэйнтинга обеспечивает еще и эффективный перенос данных генетического картирования между геномами исследуемых видов (Guilly etal. 2001).
Характеристика подсемейства
Подсемейство полевковых АгуюоНпае является самым многочисленным в составе семейства хомяковых (СпсШёае) (Мшэег, СагЫоп 2005). Оно включает в себя полевок и леммингов. Изначально степень филогенетических отношений между разными видами оценивалась по их морфологическому сходству. Данные сравнительной цитогенетики и постзиготической репродуктивной изоляции поставили под сомнение систематическое положение некоторых форм полевок, установленное только на основании традиционного морфологического анализа (Оо1ешз1к11еу, МаПкоу 2006). Систематика Карлетона и Массера (МиББег, СагЫоп 2005) основана на совокупности морфологических, цитогенетических и молекулярных данных, и наиболее детально отражает таксономию полевковых. Внутри подсемейства авторы выделяют 12 триб, 28 родов, 151 вид (Мизэег, СагЫоп 2005, Табл. 1). В 1987 году Модай суммировал данные цитогенетических исследований 22 видов полевковых Arvicolinae и при помощи сравнительного анализа показал, что среди позвоночных животных межвидовое кариотипическое разнообразие полевок - одно из самых высоких. (Modi 1987а, Ь). Автор выделил 5 типов основных кариотипических характеристик, по которым полевки отличаются на внутривидовом и межвидовом уровне: диплоидные числа, морфология аутосом, морфология половых хромосом, позиция центромеры, рисунок интерстициальных бэндов.
В настоящее время по результатам многочисленных цитогенетических исследований стало очевидным, что виды подсемейства Arvicolinae имеют один из самых перестроенных и быстро эволюционирующих геномов. Для представителей этого семейства характерен, пожалуй, весь спектр кариотипического разнообразия, описанный для млекопитающих в целом. Широкий разброс значений диплоидных чисел, наличие сверхчисленных хромосом (В-хромосом), возникновение крупных блоков конститутивного гетерохроматина в аутосомах и в половых хромосомах, морфологическая вариабельность гомеологичных хромосом, включая X- хромосомы, нестандартные системы определения пола - вот далеко не полный перечень кариологических особенностей полевковых.
Род Microtus
Серые полевки (род Microtus) - самый многочисленный по видовому составу род в подсемействе Arvicolinae. В состав рода включено более 60 видов, которые подразделяются на подроды и группы видов (Musser, Carleton 2005). Группа видов не является таксономической единицей, но объединяет наиболее родственные виды, близкие по морфологическим и кариологическим характеристикам. Серые полевки начали дивергировать относительно недавно, и морфологические различия видов выражены недостаточно ярко. Однако за короткий эволюционный период у них произошла значительная перестройка хромосомного набора (Modi 1987; Мейер и др. 1996). На основе сравнительного анализа хромосом 18 представителей из различных родов отряда грызунов (Rodentia) Маруяма и Имей (Maruyama, Imai 1981) сделали заключение, что среди грызунов наибольшее количество межвидовых кариотипичееких отличий характерно именно для серых полевок (род Microtus). Даже одна из базовых кариотипичееких характеристик - диплоидное число хромосом — варьирует у представителей серых полевок в широких пределах: от 17 у М. oregoni до 64 у М longicaudus (Modi 1987а). Одной из основных особенностей рода является значительное межвидовое и даже внутривидовое кариотипическое разнообразие, которое далеко не всегда отражается на морфологическом уровне. В связи с этим для выяснения филогенетических взаимоотношений видов рода Microtus большое значение имеет сравнительный цитогенетический анализ.
Так, например, в группе обыкновенных полевок ("arvalis") наряду с видами, хорошо дифференцированными на морфологическом уровне, представлены симпатрические виды-двойники М. rossiaemeridionalis и М. arvalis, которые весьма существенно отличаются по кариологическим характеристикам. У первого вида 2п = 54 и все хромосомы акроцентрические, за исключением одной мелкой метацентрической пары аутосом. У второго диплоидное число значительно меньше (2п = 46) и большая часть хромосом, включая Х-хромосому, мета- или субметацентрические. Кроме того, для вида М. arvalis описаны две хромосомные формы, которые при одинаковом числе хромосом в кариотипах отличаются между собой положением центромер в нескольких парах мелких аутосом и поэтому имеют разное число хромосомных плеч и разное число акроцентрических хромосом (Орлов, Малыгин, 1969, Мейер и др. 1972).
В 1996 году Мейер с соавторами (Мейер и др. 1996) опубликовали монографию, в которой провели многосторонний анализ кариологических, морфологических и зоологических характеристик более 10 видов полевок подрода Microtus. На основе анализа G-окрашенных хромосом, проведенного С.И. Раджабли и О.В. Саблиной, показана гомология крупных хромосомных районов и целых хромосом у разных видов, построена сравнительная карта хромосом для 11 видов полевок, описаны типы структурных перестроек хромосом, приведших к межвидовому, а в некоторых случаях и внутривидовому кариотипическому разнообразию.
Получение и культивирование первичных фибробласгов
Получение культур без ферментативных обработок тканей. Кусочки наружных органов и тканей животных тщательно ополаскивали 70% этанолом, затем освобождали от волос и загрязнений. Очищенные кусочки тканей помещали в стерильные чашки Петри и несколько раз тщательно ополаскивали раствором Хэнкса или буферным раствором DPBS, содержащими высокие концентрации антибиотиков: пенициллин - 300-500 мкг/мл, стрептомицин - 300-500 мкг/мл и амфотерицин В - 5-10 мкг/мл. Кусочки внутренних органов вырезали из грудной клетки животного стерильно и ополаскивали растворами Хэнкса или DPBS, затем переносили в сухую стерильную чашку Петри и тщательно измельчали с помощью стерильных инструментов. Размельченную тканевую массу переносили л на дно сухого культурального пластикового флакона (25 см ) и равномерно распределяли по всей поверхности дна. Флаконы переворачивали вверх дном, наливали небольшое количество ростовой среды (2 мл), плотно закрывали и оставляли в таком виде на сутки при 37С. Затем культуральный сосуд переворачивали в нормальное положение, крышку флакона приоткрывали и оставляли в СОг-инкубаторе для последующего культивирования. В дальнейшем проводили смену ростовой среды с интервалом в 2-4 дня и вели наблюдение под микроскопом за выходом фибробластов в монослойную культуру.
Получение культур с обработкой трипсином. Метод использовали только для тканей легкого. Мелко измельченную ткань легкого помещали в теплый 0.25% раствор трипсина с добавлением ЭДТА в конечной концентрации 0.3 млг/мл и помещали в термостат (37С). Смесь периодически взбалтывали. Для увеличения выхода фибробластов обработку трипсином кусочков легкого и забор суспензии клеток проводили в 2 приема. Время первой обработки составляло 3060 мин., в зависимости от возраста животного (чем моложе, тем короче обработка). При повторной трипсинизации время уменьшали в 2-3 раза. После обработки трипсином суспензию клеток переносили в пластиковую пробирку, и центрифугировали 5 мин. при 1000 об/мин. К осадку клеток добавляли 2 мл ростовой среды, суспендировали и переносили в культуральный сосуд с л площадью дна 25 см . Через 24-48 ч ростовую среду заменяли на свежую (4-5 мл), а после достижения монослоя проводили первый пересев.
Получение культур с обработкой коллагеназой и гиалуронидазой. Метод позволяет получать хороший выход клеток в культуру даже из очень маленьких кусочков ткани. В этом случае кусочки биопсии очищали, ополаскивали и измельчали так же, как и при получении культур без ферментативных обработок. Измельченную массу помещали в культуральный сосуд на 50мл, добавляли 2 мл среды следующего состава: 90% аМЕМ, 10% эмбриональной сыворотки, 50 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина, 2.5 мкг/мл амфотерицина В, ферменты: 100 мг/мл коллагеназы и 100 мг/мл гиалуронидазы. Перемешивали и ставили сосуд вертикально с неплотно закрытой крышкой в С02-инкубатор на 24- 72 часа. Периодически смесь взбалтывали. Время обработки считали достаточным, когда не оставалось плотных комочков ткани, и можно было легко получить суспензию клеток с помощью пипетки на 5 мл. Суспензию клеток переносили в пробирку на 15 мл, центрифугировали, сливали надосадочную жидкость. К клеткам добавляли 5 мл ростовой среды, суспендировали и переносили в новый культуральный сосуд (25 см2) и ставили (горизонтально) в С02-инкубатор. После образования плотного монослоя клетки пересевали.
Культивирование клеток проводили в С02-инкубаторе с температурой 37С и содержанием С02 5% .
Состав ростовой среды при поддержании культур зависел от условий получения и ростовых свойств конкретной линии клеток. Наиболее часто использовали культуральную среду аМЕМ или смесь аМЕМ/БМЕМ (1:1) с добавлением 10-12% эмбриональной бычьей сыворотки и два варианта комбинаций антибиотиков: гентамицин (50 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл) или канамицин(100 мкг/мл) и пенициллин(100 мкг/мл).
В случае очень медленно растущих культур для стимулирования пролиферации фибробластов в ростовую среду добавляли 5-10% культуральной среды АтпюМах.
Пересев культур производили после формирования плотного клеточного монослоя. Обычно 2-3 раза в неделю с кратностью рассева 1/2-1/4. Частота и кратность рассева зависели от индивидуальных ростовых характеристик линии клеток. Процедура пересева проводилась следующими образом: ростовую среду сливали, клетки дважды ополаскивали раствором ЭРВБ и добавляли 0.2-0.5 мл смеси трипсина и ЭДТА (трипсин - 2.5 млг/мл, ЭДТА - 0.3 млг/мл). Клетки оставляли на 5-10 мин. при комнатной температуре или при 37С для дезинтеграции монослоя. Затем добавляли 5 мл среды, суспендировали и переносили в соответствующие по объему чистые культуральные флаконы с достаточным количеством ростовой среды для дальнейшего культивирования.
Для криоконсервации (замораживания), как правило, использовали клетки в стадии активного роста. Перед замораживанием с клетками поступали как при обычном пересеве, но в конце суспензию клеток помещали в пробирку на 15 мл и центрифугировали 5 мин. при 1000 об/мин. К осадку добавляли среду следующего состава: 50% культуральной среды (аМЕМ или DMEM), 40% сыворотки (смесь эмбриональной сыворотки и сыворотки новорожденных телят в отношении 1:1) и 10% DMSO. Суспензию клеток разливали в пластиковые криопробирки, помещали в специальные пенопластовые контейнеры и оставляли при -70С не меньше, чем на 48 ч. Затем ампулы переносили в жидкий азот на длительное хранение.
Локализация пэйнтинг-проб половых хромосом М. agrestis на хромосомы исследуемых видов подсемейства Arvicolinae
По результатам локализации хромосомных проб М agrestis на хромосомы Dicrostonyx torquatus (2n - 41+В) установили, что хромосомные пробы метет 2 мелких акроцентрика, которые ранее относили к B-хромосомам. Таким образом, диплоидное число хромосом равно 2n = 45+В, пары хромосом 21 и 22 представлены мелкими акроцентриками, соразмерными с B-хромосомами (Рис. 25). Удалось подтвердить, что в ходе формирования кариотипа копытного лемминга произошла транслокация Х-хромосомы и мелкого акроцентрика, гомологичного MAG 18, на пару хромосом гомологичную MAG12/MAG6. Результатом транслокации стало образование крупной субметацентрической хромосомы, гомологичной комбинации хромосом MAG X/MAG12/MAG6 и среднего субметацентрика, соответствующего комбинации хромосом MAG18/MAGI2/MAG6. Y-хромосома не была выявлена. 18 хромосомных проб М. agrestis выявляют по 1 хромосомному элементу каждая, 5 проб (MAG4, MAG8, MAG9, MAG 17 и MAG24) по 2 элемента, три хромосомных элемента выявляются при гибридизации с MAG1 (Табл. 6). В состав набора сортированных хромосом пашенной полевки входили гигантские половые хромосомы. Известно, что X и Y-хромосомы М. agrestis являются самыми крупными хромосомами среди всех видов рода Microtus. Из-за наличия больших блоков гетерохроматина половые хромосомы этого вида составляют около 20% генома (Marchai et al. 2004). Молекулярными и цито генетическим и методами было установлено, что гетерохроматин половых хромосом полевок очень разнообразен по своему составу. У разных видов подсемейства Arvicolinae состав повторенных последовательностей, входящих в состав полового гетерохроматина, сильно отличается (Modi 1993).
Х-хромосома M agrestis содержит большой блок конститутивного гетерохроматина. Он занимает все длинное плечо хромосомы, центромеру и проксимальную часть короткого плеча. Y-хромосома содержит длинное плечо, которое полностью состоит из гетерохроматина и очень короткое эу хромата новое плечо.
В результате локализации пробы, содержащей Х-хромосому пашенной полевки, на хромосомы всех исследуемых видов, гомология генетического материала была установлена во всех случаях. В то же время, проба Y-хромосомы выявляла сигнал только при гомологичной гибридизации.
В кариотипах самок и самцов Е. lutescens (Х0) проба MAG X давала сигнал только на Х-хромосоме, как самок, так и самцов Е. lutescens (Рис. 27).
В кариотипе самцов и самок Е. talpinus (XX) было выявлено две Х- хромосомы в кариотипах обоих полов (Рис. 27). Дополнительных сигналов на аутосомах обнаружено не было, Y-хромосома М. agrestis не давала сигналов на хромосомах слепушонок. Полученный результат соответствует литературным данным (Just et al 1995,2002).
В 2006 году Ли с соавторами представили первую работу, посвященную сравнительному пэйнтингу видов подсемейства полевковых Arvicolinae (Li et al. 2006). С помощью Zoo-FISH они сравнили 2 вида из рода китайских полевок Eothenomys (Е. miletus, Е. proditor) и 1 вид из рода серых полевок Microtus (М clarkei). Пэйнтинг-пробы Е. proditor (2гг=32) были локализованы на хромосомы Е. miletus (2п=56) и М. clarkei (2п=52).
Проведено сопоставление рисунка GTG-окрашенных хромосом китайских полевок с метафазными хромосомами М. agrestis. Это позволило включить их в общую схему кариотипических преобразований полевковых Arvicolinae, выявить хромосомные ассоциации (Табл. 6). Соответствия хромосом М. agrestis (MAG), М. clarkei (MCL), Е. proditor (EPR) и E. miletus (EMI) приведены в таблице 5.
На основании данных, полученных при сравнительном хромосомном анализе, была составлена итоговая таблица (Табл. 6). В ней отражены все ассоциации и разрывы хромосомных элементов М. agrestis, характерные для кариотипов исследованных видов. Для каждого вида в верхней правой строке приведены ассоциации, в нижней правой строке - разрывы хромосомных элементов М. agrestis (MAG). В таблице также отражена принадлежность видов к определенному роду.
Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что кариотипы современных полевковых чаще формировались за счет слияния базовых элементов в разных комбинациях. При этом кариотипы некоторых видов (Е). ЮгдиаШз, В. afghanus, М. ьоЫаИз) сформировались за счет разрывов элементов, гомологичных районам хромосом и хромосомам М. а гезИз. Показано, что самое большое количество слияний и разрывов элементов, гомологичных районам хромосом М. agrestis, характерно для Е. Ыеясепя. Этот вид является примером "кариотипической революции". В то же время некоторые виды, относящиеся к разным подродам рода МшгоШя, характеризуются одинаковыми ассоциациями и разрывами элементов, гомологичных хромосомам М. agrestis . М. daghestanicus, М. guentheri, М. го581аетепйюпаШ. Отличия кариотипов этих видов выявляются при дополнительном исследовании ОТО-исчерченности хромосом.
На основании результатов сравнительного хромосомного пэйнтинга и литературных данных, установлена гомология хромосом для 21 вида подсемейства полевковых АтсоПпае. На рисунке 28 представлена хромосомная карта объединяющая сравнение гомологичных метафазных хромосом 15 видов этого подсемейства. Все ряды начинаются с хромосом М. оесопотт и заканчиваются хромосомами М. agrestis (базовые виды). Из-за пространственных ограничений не удалось включить в карту все исследованные вид
