Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Особенности организации генома птиц 10
1.2. Генетические и физические карты хромосом птиц 16
1.3. Отношения гомологии (ортологии и паралогии) нуклеотидных последовательностей и хромосомных районов
1.4. Композиционная гетерогенность ДНК и функциональная специализация геномных фракций
2 Материал и методы
2.1. Материал
2.2. Трансформация клеток Е. coli и выделение эписомной ДНК
2.3. Приготовление препаратов митотических хромосом птиц
2.3.1. Приготовление препаратов митотических хромосом из 96 (72)-часовых эмбрионов
2.3.2. Приготовление препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов
2.4. Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ (FISH) 73
2.4.1. Мечение ДНК-зондов при помощи ник-трансляции с использованием нерадиоактивных дезоксинуклеотидтрифосфатов
2.4.2. Преципитация ДНК-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации
2.4.3. Гибридизация меченых ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом птиц, Детекция гибридизационных сигналов с использованием флуоресцентных красителей
2.4.5. Анализ результатов гибридизации
3.1 Результаты 80
3.1. Прямое физическое картирование генов ALB, ANX5, EDNRA, MGF, MGP и TYR на митотических хромосомах домашней курицы
3.2. Композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела
4.0 Обсуждение
4. 1. Эволюционный консерватизм районов хромосом домашней курицы и человека
4.1.1. Ортология GGA Ip21-ql2 и HSA 12pl3-q23
4.1.2. Ортология GGA Iq23-q44 и HSA 1 Ipl5-q22
4.1.3. Ортология GGA 4ql l-q24 и HSA 4pl6-q28
4.2. Сравнительное композиционное картирование хромосом домашней курицы и японского перепела. Функциональная компартментализация генома птиц
Выводы 438
Список литературы
- Генетические и физические карты хромосом птиц
- Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ (FISH)
- Композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела
- Сравнительное композиционное картирование хромосом домашней курицы и японского перепела. Функциональная компартментализация генома птиц
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди позвоночных животных класс Aves отличается наибольшей консервативностью величины геномов: для изученных в этом отношении видов птиц содержание ДЬЖ на клеточное ядро варьирует от 1.7 до 3.5 пг. Гаплоидный геном птиц в среднем состоит из 1.2 х 109 пар нуклеотидов, что в 2.75 раза меньше, чем у млекопитающих (Kadi et al., 1993). Сравнительно низкое содержание ДНК в геномах птиц объясняют "необходимостью полета", а высокий эволюционный консерватизм этого показателя - монофилетическим происхождением класса Aves (Kadi et al., 1993). Главной отличительной особенностью кариотипов птиц является многочисленность и гетерогенность входящих в их состав хромосом. Ввиду того, что хромосомы в классе Aves различаются по размеру, их принято условно делить на 2 группы: группу макрохромосом, состоящую из шести -восьми пар относительно крупных по размеру (3-8 мкм) хромосом и группу микрохромосом - мелких трудноидентифицируемых хромосом (0.3 - 3 мкм) (Schmid et al., 2000).
Несмотря на то, что представитель класса Aves - домашняя курица -стала первым объектом генетики животных (Bateson and Sounders, 1902), ограниченное число молекулярно-цитогенетических работ на момент начала исследований в рамках представленной работы (1990) было проведено на небольшом числе видов птиц. Несмотря на то, что геном домашней курицы в настоящее время полностью секвенирован, генетические и физические карты хромосом птиц, являющиеся своего рода путеводителем по геному, остаются сравнительно малонасыщенными по причине недостаточного количества полиморфных ДНК-маркеров (www.thearkdb.org; Hillier et al, 2004; Wallis et al., 2004).
Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus gallus, что обусловлено как хозяйственным значением этого вида, так и удобством ее использования в качестве модельного лабораторного объекта. Способность к размножению круглый год и сравнительно быстрая смена поколений существенно упрощает эксперименты по гибридологическому анализу. Детальная информация по биологии развития этого вида позволяет обсуждать генетические данные в общебиологическом контексте (Stern, 2004; Burt, 2004; Stern, 2005).
Своеобразие организации кариотипов птиц - структурная компартментализация генома (наличие микро- и макрохромосом) - давно привлекает внимание цитогенетиков в отношении изучения возможной функциональной специализации хромосом. В последнее время показана высокая генетическая активность микрохромосом, плотная насыщенность их кодирующими последовательностями ДНК, в первую очередь генами «домашнего хозяйства» и онкогенами (McQueen et al., 1998; Burt, 2002/
В настоящее время известно более ста ортологичных районов курицы и человека (Schmid et al., 2000; Burt, 2002). С точки зрения сравнительного картирования, ортологии хромосомных районов, домашняя курица оказалась более близкой к человеку, чем даже домовая мышь (Burt et al., 1999). Это, с одной стороны, позволяет экстраполировать данные полного секвенирования генома человека на значительное число хромосомных районов птиц, с другой стороны определяет ценность данных геномики курицы для генетики человека и медицинской генетики.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение ортологии хромосом птиц и млекопитающих и характеристика молекулярной гетерогенности генома птиц. Сформулированы следующие задачи:
- локализация на хромосомах маркеров первого типа (кодирующих последовательностей ДНК)
- «заякоривание» маркеров первого типа на сравнительных генетических и физических картах хромосом человека и выявление ортологии хромосомных районов
- композиционное картирование хромосом курицы и перепела
- характеристика функциональной специализации микро- и макрохромосом. Научная новизна работы. Впервые установлена локализация гена EDNRA на хромосомах домашней курицы. С использованием протяженных ДНК-зондов подтверждена ранее установленная другими авторами локализация генов ALB, ANX5, MGF, MGP и TYR. Впервые проведено композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела и продемонстрирована структурно-функциональная компартментализация генома птиц.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом курицы и сравнительным картам человека, мыши и курицы (www.thearkdb.org) и банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университете в рамках магистерской программы «Эволюционная цитогенетика». Поскольку домашняя курица и японский перепел являются ценными сельскохозяйственными видами, данные по картированию нуклеотидных последовательностей на хромосомах этих видов могут быть использованы в работах по позиционному клонированию хозяйственно ценных признаков и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker-assisted selection).
Данные по эволюционному консерватизму районов хромосом человека и домашней курицы могут быть использованы для моделирования хромосомных болезней человека.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 1-ой международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994), 1-ом съезде Российского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Саратов, 1995), международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2001), Пой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), Ш-ем Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), а также за рубежом HaXVII-ом Международном съезде генетиков (Бирмингем, Великобритания, 1993), Х1-ой Европейской Птицеводческой конференции (Айр, Великобритания, 1994), XI-ом Североамериканском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию домашних животных (Техас, США, 1995), XlV-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию животных (Брно, Чешская Республика, 2000), XI-ой Европейской цитогенетической конференции (Болонья, Италия, 2001), 12 Североамериканской конференции по цитогенетике и генному картированию (Беркли, США, 2001); XV-OM Европейском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию животных (Неаполь, Италия, 2002); Европейской конференции по молекулярной эволюции (Сорренто-Неаполь, Италия, 2002); Х-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2002); 4-ой Европейской цитогенетической конференции (Болонья, Италия, 2004); 16-ой Европейской конференции по цитогенетике животных и генному картированию (Жойе ен Жосас, Франция,2004); ХП-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2004; ХШ-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2005). Результаты периодически докладывались на семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ.
Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации, были опубликованы в научных журналах "Animal Genetics", "Chromosome Research", «Генетика». Всего по теме работы опубликована 21 печатная работа, из них 7 статей и 14 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц, 30 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Литература». Список цитированной литературы насчитывает 5 русских и 173 иностранных названия.
Генетические и физические карты хромосом птиц
Инструментом анализа генотипической структуры вида и своеобразным путеводителем по геному являются генетические и физические карты хромосом.
Несмотря на то, что представитель класса Aves - домашняя курица -стала первым объектом генетики животных (Bateson and Sounders, 1902), ограниченное число молекулярно-цитогенетических работ на момент начала исследований в рамках представленной работы (1990) было проведено на небольшом числе видов птиц. Генетические и физические карты хромосом птиц, являющиеся своего рода путеводителем по геному, остаются сравнительно малонасыщенными и по настоящее время (www.thearkdb.ото). Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus gallus, что определяется как хозяйственным значением этого вида, так и удобством ее использования в качестве модельного лабораторного объекта (Brown et al., 2003). Способность к размножению круглый год и сравнительно быстрая смена поколений существенно упрощает эксперименты по гибридологическому анализу. Детальная информация по биологии развития этого вида позволяет обсуждать генетические данные в общебиологическом контексте.
Первая работа по сцеплению гена BARR с признаком пола была опубликована Спиллманом в 1908 году (Spillman, 1908), а в 1928 году было установлено сцепление двух аутосомных маркеров R (rose comb) и СР (creeper) (Serebrovsky and Petrov, 1928). Систематические исследования по картированию хромосом курицы начались на подмосковной станции Аниково под руководством Александра Сергеевича Серебровского в 1919 году. Как первое обобщение данных по сцеплению генов домашней курицы были опубликованы генетические карты, включающие двенадцать маркеров, распределенных по четырем группам сцепления и четыре маркера, проявляющих независимое наследование (Serebrovsky and Petrov, 1930) (Рисунок 1). И только через шесть лет появилась аналогичная публикация зарубежных авторов (Hurt, 1936) (Рисунок 2). Следует отметить, что незаслуженно забытые на Западе генетические карты группы А.С.Серебровского оказались более точными. Так локус NA (naked neck), отнесенный Хаттом к группе сцепления III (GGA 1) (Hutt, 1936), в то время А.С.Серебровский и С.Г.Петров отмечали независимое с маркерами третьей группы сцепления (хромосома 1) наследование этого гена (Serebrovsky and Petrov, 1930). В 2000 году была установлена локализация гена NA в GGA 3 (Pitel et al., 2000). К сожалению, Хатт не ссылается на карты А.С.Серебровского и С.Г.Петрова и цитирует их данные по сцеплению генов домашней курицы в общем перечне использованной литературы (Hurt, 1936).
Последняя по времени публикация классических (основанных на морфологических, биохимических и цитогенетических - точках разрыва хромосом при транслокациях - маркерах) генетических карт домашней курицы относится к 1993 году (Bitgood and Somes, 1993). Она включает 136 локусов, из которых 49 картированы внутри семи аутосомных групп сцепления и на половой Z-хромосоме (Рисунок 3). Кроме того, 71 локус на этих картах отнесен к какой-либо хромосоме (включая 18 микрохромосомных локусов) и для 16 локусов показано попарное сцепление (Bitgood and Somes, 1993).
К началу 90-х годов из 40 возможных групп сцепления (38 аутосом и 2 половые хромосомы) было известно лишь 10, причем только для 6 из них была определена хромосомная локализация. Не были соотнесены с соответствующими хромосомами группы сцепления I, II, IV и VI, не были известны группы сцепления, соответствующие макрохромосомам 2, 3, 4, 5 (Bitgood et al., 1990).
Качественно новый этап развития генетических карт домашней курицы начался с появлением молекулярных маркеров - микросателлитных последовательностей ДНК, полиморфных рестрикционных фрагментов (ПДРФ), фрагментов амплификационного полиморфизма (RAPD) и сателлита CR1. Применение полиморфных ДНК-маркеров позволило построить три новые генетические карты хромосом курицы, включавшие в общей сложности 50 групп сцепления (Rothschild, 1994).
Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ (FISH)
Процедуры мечения ДНК зондов для гибридизации in situ проводили при помощи наборов для ник-трансляции ("Ферментас", Вильнюс, Литва) с использованием biotin-11-dUTP. В пробирку фирмы Эппендорф емкостью 1.5 мл помещали на льду: - 10-кратный буфер - 5 мкл -100 мМ р-меркаптоэтанол - 5 мкл - смесь dNTP (dCTP, dGTP, dTTP 0,5 мМ, dATP 0,1 мМ)- 5 мкл -biotin-ll-dUTP-2MiGi - ДНК-зонд - 0,5 - 1 мкг - ДНКаза I (1 мкг/мл) - 5 мкл - ДНК-полимераза I (10 ед. /мкл) - 1 мкл - бидистилированная вода - до 50 мкл Смесь инкубировали в водяной бане при 16 С в течение двух часов. Размер полученных фрагментов оценивали методом электрофоретического разделения в агарозном геле и регулировали его повторным инкубированием при температуре 16С в присутствии ДНКазы I. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0.5 М ЭДТА, когда размер фрагментов был в пределах 200 - 700 п.н. Проверку эффективности мечения ДНК-зонда проводили по следующей схеме: исходный раствор меченого ДНК-зонда разводили до концентраций 100 пг/мкл, 10 пг/мкл и 1 пг/мкл и наносили на нейлоновый фильтр фирмы «Sigma» по 1 мкл из каждого разведения. Фильтр подсушивали и облучали на транс-иллюминаторе ультрафиолетовым светом в течение 2 минут. Затем нейлоновый фильтр инкубировали в 3 % блокирующем растворе фирмы «Boehringer Mannheim», приготовленном на 0.1 % Tween20 в 4 х SSC, в течение 30 минут при 37 С. После этого добавляли 1 мкл коньюгата авидин-щелочной фосфатазы к 2 мл блокирующего раствора и инкубировали в течение 40 минут при 37 С. Отмывки проводили в трех сменах 0.1%Tween-20 в 4 х SSC по 5 минут каждая. Затем помещали нейлоновый фильтр в буфер для детекции (0.1 М трис-НСІ, рН- 9.5; 0.1 М хлористый натрий, 50 мМ MgCl2) и добавляли 9 мкл нитроблютетразола и 7 мкл бром-4-хлор-4-индолил-фосфата. Фильтры инкубировали в полученной смеси в течение одного часа при комнатной температуре. Если на нейлоновом фильтре проявлялся положительный сигнал для разведения 1 пг/мкл, такой зонд использовали для дальнейшей работы.
Преципитацию ДНК-зондов проводили путем переосаждения этанолом в присутствии конкурирующей ДНК в целях супрессии неспецифической гибридизации. К смеси после ник-трансляции добавляли: - ДНК-сельди (конкурирующая ДНК) 1 мкг/мл - 8 мкл - З М ацетат натрия - 8 мкл - 96 % этиловый спирт - 300 мкл Смесь помещали на один час в морозильную камеру на -20С. После чего осаждали центрифугированием при 10000 об./мин. в течение 30 минут. Затем супернатант сливали, к осадку добавляли 300 мкл 70 % этилового спирта и центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 30 минут. Супернатант сливали, а осадок высушивали на воздухе и растворяли в 40 мкл гибридизационной смеси (50% формамида, 10% декстрантсульфата, 2 х SSC).
Гибридизацию ДНК/ДНК in situ проводили по стандартной методике (Lichter et al., 1991) с некоторыми модификациями. Предварительно препараты проходили тепловую обработку в течение двух часов при 55 С в вакуумной печи. Препараты митотических хромосом обрабатывали раствором рибонуклеазы А 100 мкг/мл фирмы «Sigma» при температуре 37 С в течение 30 минут. Затем препараты отмывали в трех сменах 2 х SSC. После этого препараты обрабатывали раствором протеинкиназы К фирмы «Serva» (96 мл Н20, 2мл 1М Трис-HCl, рН 7,5, 2мл 100 мМ СаС12, 1 мкг протеинкиназы К) в течение 10 минут при 37 С. Затем препараты отмывали в одной смене 1 х PBS и одной смене 2 х SSC по 5 минут при комнатной температуре. Далее препараты подвергали обработке 4% параформальдегидом (рН 7.0) в течение 10 минут при комнатной температуре и отмывали в трех сменах 2 х SSC по 5 минут при комнатной температуре. После этого препараты обезвоживали проведением через серию холодных спиртов возрастающей концентрации и высушивали на воздухе. Денатурацию ДНК митотических хромосом проводили инкубированием препаратов в 70% растворе формамида в 2 х SSC (рН-6.8) в течение 2 минут при температуре 70С. Затем препараты быстро охлаждали, обезвоживали проведением через серию холодных спиртов возрастающей концентрации и высушивали на воздухе. Денатурацию меченых ДНК-зондов проводили нагреванием на водяной бане при температуре 95С в течение 10 минут гибридизационной смеси следующего состава: - формамид - 50% - декстрансульфат «Sigma» -10% - ДНК спермы сельди «Sigma» -200 мкг - ДНК-зонд - 200 нг - 2 х SSC.
Затем гибридизационную смесь быстро охлаждали и наносили на препараты митотических хромосом (предварительно нагретых до 37 С) из расчета 200 нг меченого ДНК-зонда под одно покровное стекло. После чего препараты инкубировали в суховоздушном термостате в течение 16 часов при температуре 37 С во влажной камере.
Препараты отмывали в трех сменах 2 х SSC при температуре 37 С. Отмывки продолжали при комнатной температуре в трех сменах 2 х SSC по 5 минут в каждой и в трех сменах 0.1 х SSC при тех же условиях. Препараты инкубировали в 3% растворе блокирующего реагента фирмы «Boehringer Mannheim» в 0.1%Tween20, 4 х SSC при 37 С в течение 30 минут. После чего препараты отмывали в трех сменах 2 х SSC по 5 минут в каждой при 37 С.
Композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела
Самая тяжелая, наиболее ГЦ-богатая фракция генома курицы Fr 7, которая содержит почти исключительно изохоры семейства Н4, распределена по хромосомам следующим образом (рисунки 13 и 14): - как у курицы, так и у перепела большое число микрохромосом, преимущественно самых коротких, почти полностью покрыты гибридизационными сигналами - несколько меньшее число микрохромосом обоих видов птиц частично покрыты сигналами, преимущественно в теломерной области - теломеры большинства макрохромосом курицы и перепела выявлены как позитивные районы гибридизации - у курицы большой светящийся блок находится в районе расположения конститутивного ГЦ-богатого гетерохроматина в длинном плече Z хромосомы. При этом у перепела интенсивность флуоресценции в этом районе существенно ниже. Вторая по плавучей плотности фракция ДНК - Fr 6, содержащая изохоры семейств НЗ и Н4, характеризуется у обоих исследованных в данной работе видов птиц наличием всех вышеперечисленных районов локализации и, дополнительно, слабым мечением интерстициальных районов макрохромосом (рисунки 15, 16 и 17). Фракция 5, представленная изохорами семейств НЗ и Н2, локализована у курицы и перепела практически в тех же районах что и фракция 6 (рисунки 18,19 и 20). Фракции 3 и 4 содержат изохоры семейств L2, HI и HI, Н2 соответственно. ДНК этих фракций локализуется большей частью в микрохромосомах. Микрохромосомы маленького и среднего размера полностью покрыты гибридизационными сигналами. На крупных микрохромосомах сигналы расположены преимущественно в теломерных областях. На макрохромосомах перепела и курицы имеются сайты гибридизации в теломерных и некоторых интерстициальных районах (рисунки 21, 22, 23 и 24). Наконец, фракции 2 и 1, содержащие преимущественно легкие изохоры семейств L1 и L2, не выявляются ни в микрохромосомах, ни в теломерных районах макрохромосом курицы и перепела, а распределены по длине макрохромосом с более или менее выраженной приуроченностью к G-дискам (рисунки 25, 26, 27 и 28). Количества проанализированных метафазных пластинок в каждом эксперименте представлены в таблице 3. каждого гибридизационного сигнала и с помощью критерия х2 оценено распределение изохор по R-дискам карт дифференциально окрашенных хромосом домашней курицы (таблицы 4 и 5).
Сравнительное композиционное картирование хромосом домашней курицы и японского перепела. Функциональная компартментализация генома птиц
Композиционное картирование - это изучение распределения по длине хромосом протяженных (свыше 300 т.п.н.) гомогенных по нуклеотидному составу фракций ДНК, называемых изохорами (Bernardi, 2000). Особый интерес представляет соотнесение композиционных и цитогенетических карт хромосом, выявление приуроченности фракций изохор к морфологическим (центромер, теломер) и цитохимическим (G/R-блоки) маркерам.
Среди нескольких видов птиц из разных таксонов показана в принципе однообразная композиция генома (Caccio et al., 1997). В отличие от млекопитающих у птиц есть семейство "сверхтяжелых" изохор Н4 (с=1,712) (Caccio et al., 1997). Кроме того, характерный для птиц и рептилий ГЦ 132 богатый сателлит обнаруживается во фракциях тяжелых изохор (Caccio et al., 1997). У млекопитающих было показано неоднородное распределение разных семейств изохор. Самые "тяжелые" изохоры НЗ расположены в Т-дисках, которые характеризуются наибольшей концентрацией генов, особенно генов "домашнего хозяйства" и онкогенов. Наблюдается общая тенденция приуроченности "легких" фракций к G-дискам, где значительно ниже концентрация генов, чем в R-дисках и расположены преимущественно тканеспецифические гены, а "тяжелых" изохор к R-дискам (Saccone et al., 1996; Saccone et al., 1999; Saccone et al., 2001; Saccone et al., 2004). Кариотипы птиц обладают некоторыми морфологическими особенностями, которые представляют особый интерес с точки зрения композиционного картирования. Около 30% генома птиц представлено микрохромосомами, которые не только существенно меньше по длине, чем макрохромосомы, но и обладают рядом цитологических и биохимических особенностей. Микрохромосомы являются R-положительными и ГЦ обогащенными (Schmid et al., 2000). Методом гибридизации ДНК/ ДНК in situ было показано, что CpG-островки сконцентрированы на микрохромосомах, в отличие от макрохромосом, что является косвенным доказательством обогащенности микрохромосом генами (McQueen et al., 1996). У курицы эта часть генома оказалась относительно обогащенной уже картированными генами (Smith and Burt, 1998). Другой отличительной чертой микрохромосом является меньшая степень метилирования пар 133 оснований ГЦ и более высокий уровень ацетилирования гистонов в сравнении с макрохромосомами, что также характерно для функционально активного хроматина (McQueen et al., 1998). Таким образом, отмечается структурная, а возможно и структурно-функциональная компартментализация геномов птиц. Поскольку композиционное картирование позволяет выявить функциональное назначение участков генома (Bernardi, 2000), вопрос о функциональной компартментализации генома птиц может быть прояснен при помощи этого подхода.
Специфическая для теплокровных организация геномов птиц -гетероморфность хромосом, своего рода компартментализация кариотипа -давно привлекает внимание исследователей. В разное время показаны основные структурно-функциональные черты микро - и макрохромосом. Для первых, характерна сравнительная обогащенность генами, раннее время репликации ДНК в ходе клеточного цикла, высокая концентрация CpG островков, низкий уровень метилирования ГЦ-пар оснований, высокая степень ацетилирования гистонов (McQueen et al., 1998; Smith and Burt, 1998; Smith et al., 2000). С точки зрения композиционного картирования, нами показана обогащенность микрохромосом тяжелыми изохорами (Рисунки 13 -16, 18 и 19). Эта закономерность наблюдается у обоих исследованных в данной работе видов птиц - курицы и перепела. Можно заключить, что микрохромосомы напоминают по этому критерию Т-дисковые участки хромосом млекопитающих. В рамках данного исследования можно говорить о микрохромосомах как об особом классе Т-дисков, в которых всегда отсутствуют легкие изохоры семейств L1 и L2 (Рисунки 25 - 28). Указанные особенности микрохромосом делают их сходными с теломерными участками макрохромосом. Полученные нами данные подтверждает предположение о функциональной специализации микрохромосом птиц. Нужно подчеркнуть, что многие принципиальные особенности микрохромосом такие как ГЦ обогащенность, повышенное содержание ЦрГ островков, относительно высокое содержание генов, многие особенности связанные с повышенной транскрипционной активностью были недавно подтверждены и обобщены в публикации международного консорциума по геному Gallus domesticus (Hillier et al., 2004).
Следует отметить принципиально противоположный характер распределения в геномах обоих исследуемых нами видах птиц самой легкой фракции Фракции 1 и самой тяжелой фракции Фракции 7 (Рисунки 13 - 14 и 27 - 28). Сильный гибридизационный сигнал с тяжелыми изохорами наблюдается в гетерохроматиновом районе Z хромосомы курицы (Рисунки 13-16, 18-19, 22 - 23), что может быть объяснено наличием ГЦ богатых сателлитных последовательностей ДНК в «тяжелых» фракциях изохор (Caccio et al., 1997), или, что менее вероятно, недостаточной степенью супрессии неспецифической гибридизации повторяющихся нуклеотидных последовательностей.
