Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Возрастные изменения селезенки человека и экспериментальных животных в контексте общего иммунологического старения организма 10
1.1. Микроморфология сходств и различий в строении селезенки человека и экспериментальных животных 11
1.2. Онтогенетические аспекты гистофизиологии селезенки и ее компартментов 16
1.2.1' Особенности гистофизиологии селезенки в молодом возрасте 19
1.2.1.1 Гистофизиологии селезенки в перинатальном периоде 20
1.2.2 Онтогенетические аспекты стромально-паренхиматозных взаимоотношений в селезенке человека и экспериментальных животных 25
1.2.2.1 Морфо-функциональная характеристика стромальных клеток селезенки 29
1.1.2.1 Морфо-функциональная характеристика лимфоидных клеток селезенки 34
1.1.2.2 Становление и поддержание стромально-паренхиматозных взаимоотношений в В-зонах селезенки 41
1.3 Иммунологическое старение и роль селезенки в поддержании иммунного статуса организма с возрастом 44
1.4 Клиническая микроскопическая анатомия селезенки 53
Глава 2: Материал и методы исследования 63
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1. Органометрические параметры селезенки крыс в различные возрастные периоды 71
3.2. Микроархитектоника селезенки крыс разных возрастных групп в постнатальном онтогенезе 73
3.3. Иммуноархитектоника селезенки крыс в возрасте от рождения до 1 года жизни 85
3.4 Количественная иммуногистохимическая характеристика селезенки крыс периода грудного вскармливания, инфантного, ювенильного, молодого и среднего возраста 108
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 115
ВЫВОДЫ 123
Список литературы
- Микроморфология сходств и различий в строении селезенки человека и экспериментальных животных
- Особенности гистофизиологии селезенки в молодом возрасте
- Органометрические параметры селезенки крыс в различные возрастные периоды
- Иммуноархитектоника селезенки крыс в возрасте от рождения до 1 года жизни
Введение к работе
Актуальность исследования. Иммунная система отличается очень динамичным развитием как в пренатальном, так и в постнатальном онтогенезе. Несмотря на относительно раннее достижение функциональной зрелости иммунной системой по сравнению с другими системами организма, она достаточно долго остается чрезвычайно чувствительной к действию инфекций и довольно быстро начинает претерпевать возрастную инволюцию, которая отрицательно сказывается на качестве иммунного ответа. Среди иммунных органов тимус первым претерпевает возрастную-инволюцию, которая достаточно подробно описана в литературе как у человека, так и у экспериментальных животных [М.Р.Сапиш и« Б.Ю.Никитюк, 2000; МІЮ.Капитонова и С.Л.Кузнецов, 2007; A.Shanker, 2004; T.T.Marinova, 2005; X.Zhu et al., 2007]. Возрастная инволюция тимуса резко меняет условия функционирования» периферических лимфоидных органов: селезенки и лимфатических узлов, которые для обеспечения эффективного иммунного ответа вынуждены приспосабливаться к ослаблению функциональной роли вилочковой железы. Это обстоятельство приводит к развитию сложных перестроек морфологии периферических иммунных органов, не нашедших достаточного отражения в литературе. Вместе с тем, четкое понимание гистофизиологических особенностей периферических иммунных органов и, прежде всего, селезенки как крупнейшего из них, позволит разработать методы эффективного контроля иммунного ответа при развитии инфекций, неоплазм, при стрессе или необходимости трансплантаций органов и тканей в каждый конкретный возрастной период, характеризующийся четко ограниченными морфо-функциональными параметрами различных структур лимфоидных органов, до сих пор не достаточно освещенными в литературе, а с применением современных методов количественной иммуногистохимии - практически не изученными [О.В.Федорова, 2005; J.F.Sheridan et al., 1998; I.G. Luzina et
al., 2001; A.R.Resendes, et al., 2004; P.M. Daramers et al., 2005; M. Faldyna et al., 2005; T.Karaca et al., 2006].
Селезенка как самый крупный вторичный орган иммуногенеза ответственна за эффективность клеточного и гуморального иммунного ответа, как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Она отличается очень сложной зональностью и высокой специфичностью каждой своей зоны, определяющейся уникальным взаимодействием лимфоидных клеток и клеток стромы, создающих особое микроокружение на территории каждой из зон селезенки и обеспечивающих формирование адекватного иммунного ответа. Недостаток исследований иммуноархитектоники лимфоидных органов затрудняет понимание закономерностей эволюции иммунного ответа в постнатальном онтогенезе [К.А.Гарунова и др., 2004; А.А. Нестерова, 2007; BlSteiniger et al., 2001; P.Korkusuz et al., 2002; T. Tada et al., 2006].
Основным проявлением модулированных возрастом сдвигов в иммунных органах, в частности в селезенке как наиболее ' сложно -компартментализованном, является модификация ее зональности и изменение клеточности каждой из зон, среди причин которой указывают возрастное изменение миграции иммуноцитов, изменение масштабов и скорости гибели и пролиферации лимфоидных клеток, а также нарушение сигнальных взаимодействий между ними. Известно, что значение каждого из перечисленных механизмов иммуномодуляции имеет различное значение в разные возрастные периоды. Однако до последнего времени возрастная иммуномодуляция в лимфоидных органах, включая селезенку, изучалась преимущественно с использованием методов культуры клеток или иммунологических методов, не учитывающих особенностей микроиммуноархитектоники различных зон на территории селезенки. Особую актуальность данная проблема приобретает в связи с совершенствованием технологий трансплантации органов и тканей, что вызывает необходимость модулирования иммунного ответа не только со
знаком плюс, но и со знаком минус, поскольку трансплантационный иммунитет может препятствовать приживлению пересаженных органов, что заставляет проводить иммуносупрессивное лечение, выбор которого, включая спленэктомию, необходимо проводить с учетом возрастных иммуномодуляционных изменений в лимфоидных органах, и, прежде всего -в селезенке [Н.А.Мураева, 2006;. T.Fukumoto et al., 2006; H.Stepanova et al., 2007].
С учетом выше сказанного нами была предпринята попытка выяснить
характер, выраженность и направленность возрастных
иммуномодуляционных изменений в селезенке по данным иммуноцитохимических методов исследования, позволяющих оценить их иммуномикроархитектонику и гистофизиологию.
Целью настоящего исследования является изучение закономерностей возрастной динамики морфо-функциональных особенностей селезенки экспериментальных животных в различные возрастные периоды постнатального онтогенеза.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить структурные и иммуноцитохимические изменения, развивающиеся в селезенке до наступления половой зрелости, в молодом и среднем возрасте.
Определить соотношение паренхиматозных и стромальных элементов селезенки в Т- и В-клеточных зонах на разных этапах постнатального онтогенеза.
Установить динамику различных популяций лимфоидных клеток селезенки в период развития и возрастной инволюции лимфоидной ткани селезенки.
Материалы и методы исследования.
Объектом исследования послужили 88 белых крыс-самцов породы Sprague Dawley в возрасте от рождения до 1 года, относящиеся к следующим возрастным периодам: препубертатный период, период полового созревания, период молодого и среднего возраста [T.B.Poole, 1987]. Для количественных исследований использовалось 72 животных трех возрастных групп, по 24 особи в каждой: 1-я группа - грудного возраста (подгруппы в возрасте 0,10, 20 дней), 2-я группа - молодого возраста (подгруппы в возрасте 30, 60, 90 дней) и 3-я группа - среднего возраста (подгруппы в возрасте 180, 270, 360 дней), в каждой возрастной подгруппе было по 8 животных. Кроме того, для качественных гистологических исследований использовались находящиеся на грудном вскармливании животные в возрасте 2,4,7,9,12,14,19 дней, а также животные инфантного периода в возрасте 25 дней от роду - по 2 крысы на каждый возраст.
Гистологические срезы селезенки окрашивались рутинными гистологическими методами и иммуногистохимически на маркеры лимфоидных и стромальных клеток, а также маркеры пролиферации и апоптоза. Количественный анализ иммуногистохимически окрашенных срезов с использованием имидж-анализа. Статистическая обработка полученных цифровых данных включала расчет средней арифметической, среднеквадратического отклонения, ошибки репрезентативности, коэффициента корреляции, необходимого числа объектов наблюдения, t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Проведенное исследование позволило выявить основные периоды в постнатальном развитии селезенки: период качественных эволютивных изменений (от рождения до конца периода перехода на самостоятельное питание), количественных эволютивных изменений (молодой возраст) и период количественных инволютивных изменений (средний возраст). С
применением иммуногистохимических методов исследования была охарактеризована возрастная динамика популяций стромальных (ОХ-62, белок S100, С068-иммунореактивных клеток) и лимфоидных клеток (CD3, CD8, CD20, CD45RC, CD90). С помощью окрашивания на PCNA и каспазу-3 охарактеризованы механизмы развития и инволюции Т- и В-зон селезенки в различные возрастные периоды постнатального онтогенеза.
Научная новизна исследования. Впервые с применением панели иммуногистохимических методов исследования и имидж-анализа определена возрастная перестройка стромально-паренхиматозных взаимоотношений-в различных компартментах селезенки экспериментальных животных (крыс) от рождения до позднего среднего возраста и возрастная-динамика важнейших клеточных популяций в Т- и В-зонах органа.
Теоретическое значение работы заключается в выяснении механизмов иммуномодуляционных изменений в периферическом звене иммунной системы в различные возрастные периода постнатального онтогенеза.
Практическая значимость работы в выделении возрастных периодов наиболее существенных качественных и количественных перестроек в периферической иммунной системе, которые определяют иммунный статус организма и его чувствительность к действию патологических иммуномодулирующих факторов.
Внедрение в практику: полученные научные данные используются в курсах анатомии человека и иммунологии и аллергологии на соответствующих кафедрах ВолГМУ.
Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», о.Пхукет (Таиланд), декабрь 2007 года; заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов,
декабрь, 2007; VII научной международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология», Хургада (Египет), февраль 2008 года; V научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайа (Таиланд), февраль 2008' года, а также включены в повестку 8-го Конгресса международной ассоциации морфологов (Бухара, май 2008 года).
Основные положения, выносимые на защиту:
Иммуномодуляционные сдвиги гемопоэтического и стромального генеза в селезенке у крыс имеют различные соотношения в^ разные возрастные периоды экспериментальных животных.
Возрастная динамика клеточных популяций иммуноцитов в различных зонах селезенки у крыс характеризуется различными показателями и механизмами на разных этапах постнатального онтогенеза, соответствующих периоду качественных иммуномодуляционных изменений (период грудного вскармливания), количественных эволютивных изменений (преювенильный, ювенильный и молодой возраст) и количественных инволютивных изменений (средний возраст).
Практические рекомендации
І.Для дифференцировки физиологических (возрастных) и патологических иммуномодуляционных сдвигов в периферическом звене иммунной системы наиболее пригодными являются иммуногистохимические реакции на EDI, CD8+, CD90+, белок S100+, CD20+, выявляющие различные популяции лимфоидных и стромальных клеток.
2.Показатель удельной площади иммунореактивных лимфоидных клеток в имидж - анализе является наиболее чувствительным и воспроизводимым параметром иммуномодуляционных сдвигов в селезенке в силу особенностей ее клеточного состава.
Микроморфология сходств и различий в строении селезенки человека и экспериментальных животных
Нормальная микроскопическая картина селезенки человека описана в многочисленных исследованиях по гистофизиологии и иммунопатологии кроветворных органов, однако до сих пор в работах как по нормальной, так и по патоморфологии, представления о микроструктуре и гистофизиологии-селезенки остаются чрезвычайно противоречивыми [B.Steiniger et al., 2001]. Несмотря на многочисленность иммуногистохимических исследований селезенки [S.-M.Hsu et al., 1983; T.M.Grogan et al., 1983,1984; W.Timens et al., 1985; W.Van Ewijk et al., 1985; P.J.Buckley et al., 1987, 1991; C.Bunce et al., 1997; B.Steiniger et al., 2001], собравших обширную информацию об иммуноархитектонике органа, до сих пор исследователи не пришли к консенсусу по вопросам гистофизиологии компартментов, составляющих белую пульпу селезенки или о закономерностях ветвления сосудов ее микроциркуляторного русла. Существующие противоречия во многом были вызваны тем обстоятельством, что изначально представления о микроархитектонике селезенки лабораторных животных экстраполировались на селезенку человека [A.J.Veerman et аК, 1975; N.Van Rooijen,1979; CD. Dijkstra et al., 1985; G.Kraal, 1992; M.Hargreaves et al., 1997]. Глубокое понимание микроанатомии селезенки очень важно не только для теоретической, но и для практической медицины, поскольку селезенка является важнейшим органом рециркуляции лимфоцитов у человека. Более того, селезенка снабжена уникальной системой циркуляции, которая позволяет лимфоцитам покидать кровь в условиях отсутствия венул с высоким эндотелием, характерных для других лимфоидных органов.
У млекопитающих белая пульпа селезенки состоит из трех компартментов: ПАЛВ, лимфоидных фолликулов и маргинальной зоны. ПАЛВ - это Т-клеточный компартмент, который непосредственно окружает так называемые центральные артерии, которые в лимфоидных узелках расположены эксцентрично и которые фактически являются не артериями, а артериолами. Лимфоидные фолликулы и маргинальная зона представляют собой преимущественно В-зоны. Только клетки маргинальной зоны могут запустить иммунный ответ на неопсонизированный антиген.
Представления1 о микроанатомии белой пульпы базируются в основном на результатах изучения селезенки крыс. У этого рода животных маргинальная зона окружает и ПАЛВ, и фолликулы. Маргинальная зона представляет собой достаточно толстый клеточный слой, который состоит из особого типа В-клеток памяти, экспрессирующих IgM и не экспрессирующих или экспрессирующих малое количество IgD. Первичные фолликулы представляют собой скопления малых, сильно IgD-позитивных рециркулирующих В-лимфоцитов, которые прикреплены к ПАЛВ с регулярным интервалом. Сильная экспрессия IgD служит маркером рециркулирующих В-клеток [D.Gray et al., 1982]. Первичные фолликулы имеют однородную внутреннюю структуру, в то время как вторичные фолликулы состоят из бледного внутреннего герминативного центра с центробластами и центроцитами. Окружающая их корона или мантийная зона представляет собой остатки первичного фолликула и служит «местом пристанища» рециркулирующих В-лимфоцитов.
У крыс на границе между белой пульпой и маргинальной- зоной присутствует ветвящийся сосуд микроциркуляторного русла с высокой проницаемостью - маргинальный синус, который, как полагают, обеспечивает выход лимфоцитов из крови в белую пульпу. Маргинальный синус образует видимую границу между ПАЛВ и фолликулами с одной стороны и маргинальной зоной с другой. Он хорошо заметен, поскольку его сопровождают бледно окрашенные маргинальные металлофильные макрофаги. В дополнение, маргинальная зона содержит популяции макрофагов, которые так и называются - макрофаги маргинальной зоны, рассеянные по всему компартменту. Оба типа макрофагов экспрессируют сиалоадгезин [Т.К.Van den Berg et al., 1992].
У крыс и человека имеет место уникальный кровоток через селезенку, так как он сочетает открытое и закрытое кровообращение. Красная пульпа селезенки образована фибробластами и ретикулярными волокнами, которые формируют открытую часть селезеночного кровотока, лишенную эндотелия и получающую кровь от. терминальных артериол. Закрытая часть кровообращения в селезенке образована оставшейся частью сосудистого дерева, включающую также синусы красной пульпы. Несмотря на это, синусы имеют необычную прерывистую эндотелиальную выстилку и прерывистую базальную мембрану, которая позволяет эритроцитам попадать из открытой циркуляции в окружающие селезеночные тяжи [D.Drenckhahn et al., 1986; I.C.MacDonald et aL, 1987]. Наличие маргинального синуса в селезенке человека описано с использованием коррозионных препаратов [E.E.Schmidtetal.,1997].
Особенности гистофизиологии селезенки в молодом возрасте
Микроскопическое исследование селезенки крыс в первые часы после рождения- показало, что в это время она представлена лишь незрелой гемопоэтической тканью с очагами миелопоэза, без выраженной зональности (рис.5), покрытую тонкой соединительнотканной, капсулой. Синусоиды присутствуют, но выглядят практически пустыми.
На 3-ий день после рождения многочисленные очаги миелопоэза, главным образом тромбоцитопоэза, сохраняются. Синусоиды заполняются эритроцитами, так что паренхима органа начинает напоминать красную пульпу, (рис.6). С этого времени вокруг некоторых мелких артериальных сосудов начинают намечаться концентрические лимфоидные скопления -примитивные ПАЛВ, содержащие преимущественно средние и малые лимфоциты.
В возрасте 7 дней контуры ПАЛВ в селезенке становятся более четкими (рис.8), что позволяет на этом сроке отчетливо разграничить красную и белую пульпу, однако в последней еще отсутствует В-клеточный компартмент, формирование которого значительно отстает от развития Т-зон - ПАЛВ. Маргинальная зона также еще не определяется.
В возрасте 9 дней белая пульпа начинает отделяться от красной пульпы ободками маргинальной зоны, которая пока остается тонкой и прерывистой (рис.9). В 10-дневном возрасте на границе между белой пульпой, которая в это время представлена только ПАЛВ, определяется маргинальный синус, заполненный кровью. В 12-дневном возрасте ПАЛВ заметно увеличиваются в размерах, шире становится и маргинальная зона между ними, которая содержит лимфоидные клетки и единичные макрофаги. В 14-дневном возрасте в крупных ПАЛВ четко начинают различаться внутренняя и наружная зоны (рис.10).
В 19-дневном возрасте в красной пульпе сохраняется значительное число мегакариоцитов. В 20-дневном возрасте (возраст перехода на самостоятельное питание) [T.B.Poole, 1987] в белой пульпе наряду с ПАЛВ по их ходу начинают определяться первичные лимфоидные узелки, также окруженные маргинальной зоной. В красной пульпе хорошо различимы селезеночные тяжи. Капсула органа становится заметно толще (рис.11).
Таким образом, по данным рутинного гистологического исследования, у животных 1-ой возрастной группы, соответствующей периоду грудного вскармливания, начиная с первого дня жизни и заканчивая концом 3-ей недели, который соответствует переходу животного на самостоятельное питание, разворачиваются качественные изменения, заканчивающиеся появлением первичных лимфоидных узелков. Каждая возрастная- подгруппа качественно отличалась от предыдущей, что свидетельствует об очень динамичном развитии органа на ранних стадиях постнатального онтогенеза, что согласуется с данными Рис.7. Селезенка крысы в 5-ый день после рождения. На фоне красной пульпы (1) появляются скопления лимфоидной ткани (головки стрелок), однако контуры структур белой пульпы еще не определяются, капсула (2) -очень тонкая, нежная соединительная ткань. Окраска гематоксилин-эозином. Исходное увеличение хЮО
В 25-дневном возрасте, который соответствует инфантному периоду препубертатного возраста, у отдельных животных наряду с первичными лимфоидными узелками начинают определяться единичные вторичные узелки, с центрами размножения. Они отличаются более крупными размерами и более широкой маргинальной зоной.
К 30-дневному возрасту никаких качественных изменений не происходит, можно лишь отметить, что объем белой пульпы заметно увеличивается, так же как и маргинальной зоны. Очаги миелопоэза в красной пульпе не определяются, изредка встречаются единичные мегакариоциты. В красной пульпе видно много макрофагов.
В последующем возрастная динамика определяется количественными изменениями, связанными с увеличением доли белой ігульпьі и маргинальной зоны, дифференцировкой внутренней и наружной зон ПАЛВ, изменением клеточного состава зон селезенки.
К 60-дневному возрасту (возраст полового созревания) в белой пульпе лимфоидные узелки начинают преобладать над ПАЛВ. К этому времени микроархитектоника селезенки приобретает замысловатый рисунок, с разветвленными ПАЛВ, к которым с определенной периодичностью «прикрепляются» лимфоидные узелки (рис.12). В узелках могут присутствовать макрофаги с неокрашенной цитоплазмой, заполненные апоптозными тельцами. Все структуры белой-пульпы имеют четкие контуры и правильную форму. К этому возрасту межиндивидуальные различия в рисунке микроархитектонике определяются заметнее всего. Рис. 11. Селезенка крысы в возрасте 20 дней. Белая пульпа представлена ПАЛВ (1) и ЛУ (2), маргинальная зона вокруг них широкая (3); 4 - центральная артериола, 5 - капсула. Окраска гематоксилин-эозином. Исходное увеличение х40
К 3-х месячному возрасту у молодых половозрелых животных от капсулы вглубь органа отходят заметные соединительнотканные перегородки. В лимфоидных узелках заметно увеличивается число макрофагов с неокрашенной цитоплазмой, заполненной апоптозными тельцами. В лимфоидных узелках, а также в красной пульпе определяются плазматические клетки.
Таким образом, у животных 2-ой возрастной группы, которая включала в себя возрастной период 1 месяца (преювенильный период), 2-х месяцев (период половой зрелости), 3-х месяцев (молодой возраст) качественных изменений микроархитектоники селезенки не определялось, а количественные изменения включала в себя изменение соотношения белой и красной пульпы, дальнейшее развитие и созревание Т- и В-зон белой-пульпы (ПАЛВ и лимфоидных узелков соответственно)- и маргинальной зоны, изменение клеточного состава зон селезенки, которые, однако, достаточно сложно характеризовать в силу высокой клеточной плотности компартментов селезенки; в- связи с чем эта задача оценки динамики клеточных популяций-решалась с применением иммуногистохимических методов исследования.
Органометрические параметры селезенки крыс в различные возрастные периоды
Окрашивание на ОХ-62, выявляющее дендритные интердигитирующие клетки [K.W.TinsIey et al., 2003], обнаруживало сразу после рождения единичные иммунореактивные клетки по берегам мелких артериальных сосудов. Уже у 2-х дневных животных они образовывали вокруг сосудов мелкие скопления. Количество этих клеток в зоне формирующихся ПАЛВ неуклонно увеличивалось в течение 1-го месяца жизни (рис.26,27). Далее в молодом возрасте доля этих клеток продолжала нарастать, хотя и менее динамично, вплоть до 3-месячного возраста. У стареющих животных она начинала незначительно уменьшаться, оставаясь примерно на одном уровне до конца изучаемого периода жизни экспериментальных животных. л
Иммуногистохимическая реакция на CD90, окрашивающая популяцию-недавних тимусных иммигрантов, выявляла иммунореактивные клетки, начиная с 1-го дня жизни. Они, так же как ОХ-62-иммунореактивные клетки, концентрируются вокруг артериальных сосудов, единичные клетки встречаются также в красной пульпе. К 10-му дню жизни доля их значительно возрастала (рис.28), к концу 1-го месяца она становилась еще больше (рис.29). В последующем нарастание доли иммунореактивных клеток происходило менее интенсивно, и в стареющем организме она начинала снижаться (рис.30), продолжая уменьшаться вплоть до 12-месячного возраста.
При окрашивании на CD8 - маркер Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров - было установлено, что сразу после рождения иммунореактивные клетки были распространены по всей
Селезенка крысы в возрасте 6 мес. В лимфоидном узелке (1), не более половины клеток иммунореактивны, в маргинальной зоне (2) иммунореактивные клетки немногочисленны и бледно окрашены; 3 — маргинальный синус. Окраска на CD20, докраска гематоксилином. Исходное увеличение хЮО. паренхиме органа, однако именно вокруг артериальных сосудов они образовывали самые густые скопления (рис.31). Уже через 2 дня после рождения доля иммунореактивных клеток в формирующихся- ПАЛВ" возрастала пропорционально увеличению в них количество ОХ-62+клеток (рис.32). В 7-дневном возрасте, когда на границе между красной и белой пульпой появлялась маргинальная зона, становилось очень заметным, что доля иммунореактивных клеток увеличивалась в формирующихся ПАЛВ и в красной пульпе, хотя маргинальная-зона оставалась практически полностью свободной от иммунореактивных клеток (рис.33). В 20-дневном возрасте доля иммунореактивных клеток и в красной пульпе, и в ПАЛВ заметно увеличивалась, в то время как в маргинальной- зоне и лимфоидных узелках иммунопозитивные клетки практически не определялись, что придавало иммуноархитектонике-органа приданном виде окраски очень специфический вид (рис.34). В последующем доля иммунореактивных клеток в ПАЛВ и красной пульпе продолжала возрастать менее значительно и по достижении среднего возраста этот прирост практически прекращался, и даже намечалась тенденция к ее снижению.
При- окрашивании на CD3 - маркер Т-клеточных рецепторов - было установлено, что уже в первые часы после рождения в селезенке присутствовали единичные иммунореактивные клетки, которые поодиночке были рассеяны в паренхиме органа. Однако обращало на себя внимание очень слабое окрашивание мембран клеток в этой возрастной подгруппе и практически во всех возрастных группах до 12-дневного возраста. В-возрастных подгруппах, соответствующих возрасту 2,4,7,10,12 дней, иммунореактивные клетки постепенно начинали концентрироваться вокруг артериальных сосудов в области формирующихся Т-зон. Начиная с 14-дневного возраста, часть клеток приобретала среднее по интенсивности окрашивание, а с 20-дневного возраста - яркое окрашивание. После этого, в возрасте 25, 30, 60 и 90 дней количество иммунореактивных клеток в Т-зонах возрастало (рис.35), после чего оно стабилизировалось и сохранялось
Селезенка крысы в 3-ий день жизни; формирование ПАЛВ (1) вокруг артериолы (2), 3 - красная пульпа. Окраска на CD8, докраска гематоксилином. Исходное увеличение х200.
Селезенка крысы в возрасте 14 дней; в ПАЛВ (1) много иммунореактивных клеток, в лимфоидном узелке (2) они отсутствуют; в красной пульпе (3) и маргинальной зоне (4) они единичны. Окраска на CD8, докраска гематоксилином. Исходное увеличение х100.
Селезенка крысы в возрасте 20 дней; в ПАЛВ (1) много иммунореактивных клеток, в лимфоидном узелке (2) они отсутствуют; в красной пульпе (3) они многочисленны (стрелки); маргинальная зона (4) достаточно широкая; 5 - маргинальный синус. Окраска на CD8, докраска гематоксилином. Исходное увеличение хЮО. примерно на одном уровне до 9-месячного возраста. У 12-месячных животных доля иммунореактивных клеток была заметно снижена по сравнению с 9-месячной возрастной подгруппой, они определялись в основном по внутреннему контуру ПАЛВ При окрашивании на CD45RC, являющемся маркером В-лимфоцитов, CDS+лимфоцитов и наивных CD4+ Т-лимфоцитов, единичные иммунореактивные клетки были рассеяны в паренхиме органа, скапливаясь вдоль мелких артериальных сосудов (рис.36). Уже в 2-х дневном возрасте их доля в формирующихся Т-зонах резко увеличивалась, отчетливо контурируя их на фоне красной пульпы (рис.37). После этого доля иммунореактивных клеток резко увеличивалась в возрастных подгруппах, соответствующих 4-х, 7-й, 9-й, 12-ти и 14-ти дневному возрасту. В последней возрастной подгруппе иммунореактивные клетки также начинали концентрироваться- в формирующихся В-зонах - лимфоидных узелках, а также в маргинальной зоне. В последующих возрастных подгруппах, соответствующих возрасту 19,20,25 и 30 дней, доля иммунореактивных клеток в Т-зонах и маргинальной зоне продолжала увеличиваться, а в первичных лимфоидных узелках практически все клетки начинали ярко окрашиваться непрямой иммунопероксидазной реакцией (рис.38). В единичных вторичных лимфоидных узелках плотность окрашивания центров размножения была заметно ниже, чем в их мантии. В 2-х месячном возрасте яркое интенсивное окрашивание практически всех клеток лимфоидных узелков и большей части клеток маргинальных зон сохранялось, в то время- как в ПАЛВ плотность расположения иммунореактивных клеток начинала несколько уменьшаться (рис.39). В возрасте 3 месяца в селезенке крыс отмечалось интенсивное окрашивание маргинальных зон, лимфоидных узелков! (при наличии разреженности иммунореактивных клеток в герминативных центрах) и селезеночных тяжей в красной пульпе, что создает специфическую картину иммуноархитектоники органа при просмотре гистологических препаратов под малым увеличением (рис.40). В ПАЛВ не более половины клеток
Иммуноархитектоника селезенки крыс в возрасте от рождения до 1 года жизни
Широкий спектр изменений происходит в составе и функции лимфоидных клеток-предшественников, лимфоцитов и лимфоидной ткани на протяжении всей жизни. Эти изменения необходимо учитывать при разработке новых методов лечения, направленных на усиление иммунного ответа в пожилом возрасте, поскольку они несомненно имеют отношение к канцерогенезу и подверженности инфекционным заболеванием в стареющем организме. Нарушение функции иммунной системы с возрастом или иммунологическое старение вносит значительный вклад в показатели заболеваемости и смертности среди лиц старших возрастных групп [M.De la Fuente et ah, 2004; Y.Liang et al., 2005; A.Hasegawa et al., 2006]. Иммунологическое старение сопряжено с повышением риска осложнений и смерти от вирусных инфекций у пожилых людей. Развитие стратегий вакцинации, которые были бы эффективны для всех возрастных групп, особенно направленные против новых инфекций и возможных инфекционных агентов, распространяемых биотеррористами, должно быть ориентированы на наиболее уязвимый контингент - детей и пожилых людей. Как показали многочисленные исследования, больше всего при старении изменяется Т-клеточный компартмент иммунной системы, причем наиболее постоянным сдвигом является резкое уменьшение вплоть до полного исчезновения наивных Т-лимфоцитов и естественных киллеров [C.Coleman 2006]. Одновременно с возрастом в организме, в частности в селезенке, возрастает доля СВ8+лимфоцитов памяти [В. Vesosky et al;, 2006]. В литературе накоплено множество данных относительно возрастной динамики клеточных популяций иммуноцитов в организме, включая лимфоидные органы и, в частности, селезенку - периферическое звена иммунной системы. Однако подавляющее большинство исследований выполняется с применением иммунологических или культуральных методов исследования, которыми невозможно оценить микроархитектонику лимфоидных органов и изменения в многочисленных компартментах и зонах наиболее сложно
устроенного среди них — селезенки, которая как крупнейших орган иммунной защиты во многом определяет иммунный статус организма и, следовательно, эффективность иммунного ответа в нем.
Понимание механизмов развития возрастной атрофии лимфоидных органов позволит найти способы сделать этот процесс обратимым и восстановить выработку функционально способных иммуноцитов, позволит преодолеть возрастные дефекты иммунной функции [A.L.Gruver et al., 2007].
В своем исследовании мы проследили изменения, которые разворачиваются в селезенке у экспериментальных животных с возрастом: с момента рождения до начала старения организма. При этом мы учитывали, что характеристика связанного с возрастом процесса иммунологического старения имеет клиническое значение, так как она может использоваться при разработке вакцин против опухолей и инфекционных заболеваний, к которым организм по мере старения становится очень чувствительным. Фундаментальное понимание сложных механизмов, с помощью которых старение способствует затуханию иммунных функций, позволит разработать новые лечебные тактики и создать вакцины, специфически направленные на преодоление этих дефектов в иммунной функции стареющего организма [AX.Gruver et al., 2007].
С применением окрашивания на различные популяции Т-лимфоцитов (CD90, CD3, CD8) и стромальных клеток Т-зон (интердигитирующие дендритные клетки и СБ68+макрофаги) мы продемонстрировали, чтоуже в 1-ый день жизни в селезенке присутствует не только красная пульпа, но и белая пульпа в виде четко контурируемых вокруг артериол ПАЛВ. Эти наблюдения свидетельствуют о более раннем начале становления Т-клеточного компартмента в селезенке крыс, чем это было продемонстрировано в классических исследованиях по возрастной иммуноморфологии органа [A.J.Veerman et al., 1975; P.Eikelenboom et al., lie 1979], на которых до настоящего времени основаны представления об иммуноархитектонике селезенки крыс. Нами также было продемонстрировано более раннее появление вокруг них маргинальной зоны - крупнейшего В-клеточного компартмента селезенки у крыс, с формированием которого связывают способность вырабатывать иммунный ответ против Т-независимых антигенов II типа определенных инкапсулированных бактерий [CKruschinski et al., 2004] и который определялся нами у всех 7-дневных крыс при окрашивании на CD20 и CD45RC, т.е. раньше, чем это описано у большинства исследователей с применением рутинных методов исследования [C.D.Dijkstra et al., 1983].
Нами было установлено, что в среднем возрасте наблюдается уменьшение траффика недавних тимусных иммигрантов, в селезенку, проявляющееся снижением доли CD90+ioieTOK в ее Т-зонах, сопровождающимся параллельным снижением в них CD45RC+ (наивных Т-лимфоцитов), а также снижением удельной площади CDS+клеток, которому также предшествует сокращение доли стромальных клеток ПАЛВ (фенотипа ОХ-62+).
Достаточно много в литературе противоречий относительно времени и механизма появления первичных лимфоидных узелков в белой пульпе селезенки экспериментальных животных. В соответствии с классическими представлениями, первичные лимфоидные узелки появляются в селезенке крыс на 20-ый день, а вторичные - на 25-30-ый день жизни [A.G.Veerman et al., 1975]. Другие исследователи показывают, что появление первичных фолликулов происходит на 3-ей неделе [P.Eikelenboom et al., 1979], или уже на 14-ый день [F.G.Kroese еЬ аГ., 1987]; именно тогда, когда в них появляются фолликулярные дендритные клетки, а спонтанное появление в них герминативных центров - к 21-ому дню [A.Weirsbowsky et al., 1982]: С применением иммуногистохимических методов исследования мы продемонстрировали, что появление первичных лимфоидных узелков определяется уже у 12-дневных крыс, а герминативных центров в них - у 19 117 дневных животных. Таким образом, в противоположность данным других исследователей, определившим, что после 28-го дня изменений в клеточной компартментализации уже не происходит [K.D.Ackerman et al., 1989], нам удалось показать, что качественно компартментализация завершается уже во время перехода на самостоятельное питание (подсосный период), после чего изменения ее носят количественный характер. Полученные нами новые данные о возрастной динамике иммуноархитектоники селезенки у крыс и ее механизмах имеют большое практическое значение, так как подавляющее большинство экспериментальных иммунологических исследований по испытанию новых иммуномодуляторов, канцерогенезу, иммунодефицитным состояниям выполнены именно на крысах, в строении селезенки которых отмечается много сходств с селезенкой человека, а имеющиеся различия, связанные со строением маргинальной зоны, соотношением Т- и В-клеточных зон, наличием маргинального синуса и парафолликулярной зоны, хорошо известны и учитываются при экстраполировании результатов экспериментальных исследований [A.Steiniger et al., 1997; 2001; P.Korkusuz et al., 2002], которое необходимо производить также с учетом особенностей возрастной иммуноморфологии органа на каждом этапе онтогенетического развития.
