Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 8
1.1 Современные представления об организации иммунной системы рыб. 8
1.1.1 Гуморальные и клеточные факторы иммунитета 8
1.1.2 Строение и функционирование гемопоэтических органов 13
1.2 Физиолого-иммунологическое состояние осетровых рыб в современных условиях 16
1.3 Заболевания осетровых рыб при искусственном выращивании 21
1.4 Способы, средства профилактики и лечения рыб 21
1.5 Интерлейкин-2 - строение, функционирование, область применения.. 29
ГЛАВА 2 Результаты собственных исследований 33
2.1 Материал и методы исследований 33
2.1.1 Схемы проведения экспериментальных работ 33
2.1.1.1 Экспериментальная работа с двухгодовиками гибрида белуга стерлядь (бестер) 34
2.1.1.2. Экспериментальная работа с производителями стерляди 36
2.1.1.3. Экспериментальная работа с молодью гибрида русско-сибирского осетра (РО х СО) ранних сроков получения 38
2.1.1.4 Экспериментальная работа с молодью белуги 39
2.2.2 Методы гематологических и физиолого-иммунологических исследований 40
2.2 Результаты исследований 45
2.2.1 Влияние rIL-2 на физиологические и биологические показатели средних возрастных категорий гибрида белуга х стерлядь (бестер) после
лапаротомии с биопсией гонад 45
2.2.1.1 Результаты ихтиопатологического осмотра бестеров 45
2.2.1.2 Биологические показатели бестеров 46
2.2.1.3 Гематологические показатели бестеров 48
2.2.1.4 Биохимические показатели сыворотки крови бестеров 51
2.2.1.5 Показатели клеток белой крови и ЛКТ бестеров 52
2.2.2 Влияние rIL-2 на физиологические и биологические показатели самок стерляди после операции прижизненного получения половых про дуктов 57
2.2.2.1 Результаты ихтиопатологического обследования самок стерляди... 57
2.2.2.2 Биологические показатели самок стерляди 58
2.2.2.3 Гематологические показатели самок стерляди 61
2.2.2.4 Биохимические показатели сыворотки крови самок стерляди 63
2.2.2.5 Показатели клеток белой крови и ЛКТ самок стерляди 64
2.2.3 Влияние rIL-2 на физиологические и биологические показатели мо лоди гибрида русско-сибирского осетра в период неблагоприятного тем пературного режима 70
2.2.3 Л Результаты ихтиопатологического состояния молоди РО х СО 70
2.2.3.2 Биологические показатели молоди РО х СО 70
2.2.3.3 Гематологические показатели молоди РО х СО 72
2.2.3.4 Биохимические показатели сыворотки крови молоди РО х СО 75
2.2.3.5 Показатели клеток белой крови и ЛКТ молоди РО х СО 76
2.2.4 Влияние rIL-2 на физиологические и биологические показатели мо лоди белуги при использовании препарата в качестве антистрессанта 81
2.2.4.1 Биологические показатели молоди белуги 81
2.2.4.2 Гематологические показатели молоди белуги 83
2.2.4.3 Биохимические показатели сыворотки крови молоди белуги 85
2.2.4.4 Показатели клеток белой крови и ЖТ молоди белуги 87
ГЛАВА 3 Обсуждение результатов исследований 92
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
Список сокращений 137
Приложение 138
- Современные представления об организации иммунной системы рыб.
- Физиолого-иммунологическое состояние осетровых рыб в современных условиях
- Методы гематологических и физиолого-иммунологических исследований
- Биологические показатели молоди белуги
Введение к работе
Актуальность. При огромном видовом разнообразии рыб, обитающих в водоемах России, осетровые всегда играли и продолжают играть особенную роль. Однако, в большинстве районов обитания естественные популяции этих рыб находятся в депрессивном состоянии (Абросимова, Васильева, 1999; Зыкова и др., 2000; Власенко и др., 2002; Корниенко и др., 2005; Кокоза, 2007), а некоторые виды - на грани исчезновения. На фоне неуклонного снижения численности всех видов осетровых, поднимающихся на нерестилища, падают и масштабы заводского воспроизводства ввиду дефицита качественных производителей. Поэтому единственным выходом из создавшейся ситуации является формирование продукционных стад на осетровых рыбоводных заводах (Васильева, 2006).
Известны несколько способов формирования репродуктивных стад осетровых - путем выращивания производителей от икры и одомашнивание диких самок и самцов (Подушка, 1999а; Васильева, 2000). При этом успех данных мероприятий во многом зависит от физиологического состояния рыб (Телеуж и др., 2001).
Не менее важной представляется проблема отбора в ремонтные группы особей по половому признаку в первые годы выращивания с целью более ранней отбраковки из стада рыб с затянутым половым развитием, что существенно снижает затраты на их содержание. При этом применяют два метода ранней диагностики пола - ультразвуковое сканирование (Астафьева и др., 2006а; 20066) и визуальная оценка гонад при лапаротомии (Дегтярева, Лозовский, 2002; 2003; 2004а; 20046). Кроме того, в последние годы ввиду нехватки производителей применяют метод прижизненного получения икры (Подушка, 1986). Это осуществляется путем оперативного вмешательства (подрезание яйцеводов). Все эти методы и технологические решения при выращивании и воспроизводстве осетровых требуют высокой стрессоустойчивости и удовлетворительного физиологического состояния рыбопосадочного материала и производителей. Однако, в дельте Волги сохраняется достаточно высокий уровень загрязнения воды раз личными химическими соединениями. В отличие от предыдущих десятилетий, когда основными загрязняющими веществами были хлороганические соединения и их производные, в настоящее время основными полютантами являются нефтяные углеводороды и некоторые тяжелые металлы (Катунин и др., 1998; 1999; 2001; 2004; Егоров и др., 2004). Стремительный рост антропогенных нагрузок и загрязнение водоемов отрицательно сказывается на физиологическом состоянии гидробионтов (Лукъяненко, Кулик, 1994; Гераскин и др., 1998; 2004), степени их устойчивости, а также оказывает иммуносупрессивное действие (Ва-ледская и др., 2000; Микряков и др.; 2001), приводящее к появлению в популяции рыб с уродствами и иммунодефицитом (Решетников и др., 1999; Моисеенко, Лукин, 1999; Кашулин и др., 1999; Васильев, 2003; Валедская, 2005). Причем, в большей степени страдает клеточное звено иммунитета, в частности отмечается лимфопения. Устойчивость организма к действию некоторых биологических, химических, физических факторов обусловлена деятельностью иммунной и других физиологических систем (Вихман, 1996). При промышленном разведении объектов аквакультуры большое значение для получения товарной продукции приобретает контроль и регулирование резистентности (Микряков, 1989; Вихман, 1996; Касаева, Судакова, 2005, Касаева и др., 2006а). Поэтому особую актуальность приобретают исследования физиологического состояния осетровых в условиях аквакультуры и поиск новых экологически безопасных препаратов, повышающих иммунореактивность и резистентность рыб. Причем значительная роль в этих исследованиях должна отводиться поиску биологически активных веществ с конкретно направленным действием на стимуляцию пролиферации клеток иммунного надзора - лимфоцитов.
Цель и задачи. Целью исследований являлось изучение влияния рекомби-нантного интерлейкина-2 (rIL-2- Ронколейкин) на физиолого-иммунологические и биологические показатели осетровых рыб после лапаротомии с целью оценки развития гонад и подрезания яйцеводов при получении половых продуктов, а также при экстремальных условиях рыбоводного процесса, таким как неблагоприятный температурный режим и хендлинг.
Основные задачи работы:
1. Изучить действие rIL-2 (Ронколейкина) на организм осетровых рыб средних ремонтных групп после лапаротомии с биопсией гонад и разработать методы введения препарата, определив оптимальные терапевтические дозы.
2. Исследовать физиолого-иммунологический статус производителей осетровых рыб после подрезания яйцеводов при получении половых продуктов, применяя в качестве иммунокорректора Ронколейкин.
3. Определить действие Ронколейкина в различных дозах на организм молоди осетровых при его использовании в качестве профилактического средства при неблагоприятном температурном режиме, действии хендлинга.
Научная новизна. Впервые получены данные по физиолого-иммунологическому статусу молоди осетровых рыб и их гибридов на первом году жизни при экстремальных воздействиях (неблагоприятный температурный режим, хендлинг) в условиях аквакультуры Нижнего Поволжья. Впервые разработаны основные этапы иммунокоррекции рекомбинантным интерлейкином-2 осетровых рыб. Впервые изучено влияние rIL-2 в различных дозах на регенерацию тканей, физиолого-иммунологические, биологические показатели и выживаемость средних ремонтных групп, производителей осетровых рыб и их гибридов после хирургического вмешательства.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований и полученных данных разработаны рекомендации по применению рекомбинант-ного интерлейкина-2 для реабилитации осетровых рыб разных возрастных групп после оперативного вмешательства, профилактики заболеваний и стресса у молоди осетровых.
Апробация работы. В диссертации подведены итоги исследований, выполненных автором в 2005-2007 гг. Материалы работы обсуждались на IV Международной научно-практической конференции «Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы» (Астрахань, 13-15 марта 2006г), Международном симпозиуме «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водо емов аридного климата» (Астрахань, 16-18 апреля 2007г), Международной конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов -2» (п. Борок, ИБВВ им. И.Д. Папанина РАН, 17-20 июля 2007 г). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, имеется заявка на выдачу патента на изобретения № 2007117985, приоритет от 28 апреля 2007.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материала и методов исследования, собственных данных, обсуждения результатов исследований, выводов, рекомендаций и списка литературных источников, включающего 306 наименований, в том числе 68 зарубежных авторов. Текстовая часть изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрированного 26 таблицами и 16 рисунками.
Современные представления об организации иммунной системы рыб.
В последнее время физиолого-иммунологические исследования нашли широкое применение во многих фундаментальных и прикладных науках (Хаитов и др., 2000). Традиционно они используются в клинико-диагностических исследованиях при различных заболеваниях теплокровных животных и человека. Однако современные научные данные свидетельствуют о том, что у всех исследованных организмов от человека до низших .-позвоночных животных иммунологические реакции во многом сходны (Фонталин, 1988; Lehrer et al, 1994; Roch, 1999; Кондратьева и др., 2001).
Для рыб описаны структурное и функциональное разнообразие активных молекул, обладающих свойствами антител и регуляторов клеточной активности (цитокинов); принадлежность антител к различным белковым фракциям и широкий диапазон их молекулярной массы; обнаружение секреторных антител и изотипов антител (Вихман, 1996; Hardie et al., 1998; Secombes et al, 1998; 1999; Najakshin et al., 1999; Laing et al., 1999, 2000 a, 6; Zou et al, 1999; 2000a 20006; Smith, 2000; Miracle et al, 2001; Engelsma et al, 2001; Kemenade, 2001; Mogxim et al., 2002; Галактионов, 2004; 2005). Причем у хрящевых рыб, например, интер-лейкин-1 (IL-1) по своему строению имеет много общего с IL-1 млекопитающих, в тоже время у форели отсутствуют в нем гомологичные участки (Dinarello, 1997; Dixon et al., 1999; Daniels et. al, 1999; Pleguezuelos et al, 2000; Bird et al., 2002). У акул обнаружены иммуглобулины двух молекулярных форм: с высокой (900 кДа) и низкой (189 кДа) молекулярной массой, относящихся к одному и тому же изотипу (табл. 1). Как и у млекопитающих, пентамерная форма иммуноглобулина хрящевых и хряще-костных рыб объединена в единую молекулу J-цепью. В классе костных рыб наблюдается некоторая гетерогенность иммуноглобулинов и некоторыми авторами был отмечен изотип IgD (Wilson et al., 1997). Однако доминирующими формами являются тетрамер и мономер, относящиеся к изотипу IgM (Yuzuru et al., 1990; Галактионов, 2004).
Некоторыми авторами (Кольман и др., 2000) было отмечено, что при проведении иммунизации вакциной из О-антиген Aeromonas salmonicida и инактиви-рованных бактерий происходила стимуляция гуморальных факторов иммунитета сибирских осетров в возрасте двух месяцев (Acipenser baerii Brand). Это свидетельствует о зрелости их защитных реакций.
Имеются литературные данные о морфологическом и функциональном разнообразии клеток, участвующих в иммуногенезе и принадлежащих к лимфоид-ному и плазматическому ряду, а также моноцитарно-макрофагальной системе; образовании антител и сенсибилизированных клеток в результате клеточных коопераций и влияния микроокружения (рис. 1), наличие Т и В иммунных систем (табл. 1) и соответственно двух популяций лимфоцитов Т- и В- типов и их субпопуляций (Kaatari, Irwin, 1985; Ланге, Зотова, 1985; Hamaguchi, Kasuda, 1988; Stet, Egberts, 1991; Зотова и др., 1988, Головина, Тромбицкий, 1989; Песто-ва, Четверных, 1990; Yoshida et al., 1995).
Причем эти специализированные клетки, различающиеся по месту своего рождения, морфологически не различимы (Житенева и др., 2004).
К иммунокомпетентным клеткам рыб относятся все клетки лимфомакрофа-гальной системы. Это лимфоциты, плазмоциты, гранулоциты макрофаги, эндо-телиоциты, клетки Купфера, естественные киллеры и т.д. Клеточные компоненты иммунной системы рыб составляют две популяции: плазматические и клетки, обеспечивающие клеточный иммунный ответ (Esteban et al.,1988; Zuasti, Ferrer, 1988; Junko, Takaji, 2002). Основными клетками, определяющими работу иммунной системы рыб, являются лейкоциты во всем многообразии их популяций и субпопуляций (рис. 1). У осетровых рыб к таковым относятся лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы (Молдавская и др., 2003; Валедская, 2005; Балабанова, 2006). Лейкоциты рыб, в отличие от лейкоцитов высших позвоночных, в основном представлены лимфоцитами, на долю которых приходится 45-99% от общего числа лейкоцитов. На долю гранулоцитов приходится значительно меньшее число клеток (1-45%)) (Головина, Тромбицкий, 1989; Головина 1999; Иванова, 1995; Микряков, 2001; Ложниченко и др., 2002).
Количество белых клеток в крови рыб очень велико и динамично. Например, оно подвержено сезонным колебаниям в пределах физиологической нормы (Федосеева, Астафьева, 2006) и составляет 360-25000 шт./мм , в среднем 5400 шт./мм3 (Житенева и др., 1997). Интересно, что у рыб в те или иные периоды жизни буквально происходит смена состава лейкоцитов. Это связано с меняющимся функциональным состоянием организма, а также косвенно подтверждает не только различные функции, но и разную по интенсивности деятельности роль отдельных лейкоцитов. Большое количество иммунокомпетентных клеток в периферической крови рыб, а также довольно частая смена их состава свидетельствуют о большей защищенности водных организмов по сравнению с наземными позвоночными, от различных патогенов, которых на единицу объема воды приходится гораздо больше, чем на ту же единицу объема воздуха (Житенева и др., 2004). Между различными типами лейкоцитов происходят сложные взаимодействия, направленные на реализацию основных функций.
Физиолого-иммунологическое состояние осетровых рыб в современных условиях
Иммунологические феномены в условиях нормы и отклонений у осетровых рыб весьма разнообразны, что связано с характером взаимодействия антител и активных клеток с антигенами. Это взаимодействие может иметь различные последствия: инактивацию патогенов, развитие гиперчувствительности замедленного типа, формирование иммунологической памяти (Jorgernsen, 1989; Компа-неци др., 1990).
Способность к иммунному ответу появляется у рыб на определенных стадиях развития (Вихман, 1996). Функциональная активность иммунной системы зависит от двух групп факторов, включающих организменные (внутренние) и внешние регуляторные воздействия. При изменении условий среды обитания, возникновении заболеваний или антигенного воздействия наблюдаются изменения в составе и численности иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, макро-фагоподобных клеток и др.) и, как следствие, появление в полостных жидкостях цитотоксических белков и антимикробных пептидов (Хаитов и др., 1995; Кондратьева и др., 2001).
Деятельность иммунной системы регулируется общими физиологическими системами, причем ведущая роль принадлежит нейроэндокринной системе и метаболическим тканевым механизмам (Баранникова и др., 1983; Вихман, 1996; Junko, Takaji, 1998). Как правило, в относительно постоянных условиях гемостаз поддерживается физиолого-биохимическими системами организма на определенном, относительно стабильном уровне (Житенева и др., 2004).
Эволюция дала животным организмам, в основном, острые защитные адаптивные реакции, проверенные в неотложных ситуациях конкуренции, бегства, борьбы и т.п. По необходимости, эти острые адаптивные реакции применяются и при хронических условиях, приводя к рассогласованию стереотипа и реально сти, что делает эти ценные реакции высокопатогенными. Если острый стресс переходит в хронический, то наступают обусловленные им расстройства, которые прежде всего касаются инсулинозависимых органов и тканей. При хроническом стрессе нарушаются функции иммунитета за счет увеличения концентрации гормона кортизола, что приводит к атрофии лимфоидной ткани, повреждению лимфоцитов и других структур иммунной системы. Гидрокортизон подавляет антителообразующую функцию и функцию клеточного звена иммунной системы рыб. При этом снижается и хемотоксическая активность иммунокомпе-тентных клеток (Микряков, Микряков, 2002; Бойко, 2005; Бойко, Рудницкая, 2005; Бойко и др., 2005; Бойко, Корниенко, 2005). Нейрогормональная регуляция иммунологической реактивности подтверждается снижением в условиях стресса бактерицидной способности сыворотки, гемммаглютининов и относительной массы лимфоидных органов (Schaperclaus и. а., 1990). Токсичные продукты метаболизма, накапливающиеся в крови при стрессе, вызывая гемолиз эритроцитов и лизис лейкоцитов.
Адаптационные возможности осетровых рыб велики, но не безграничны. Так, у самок загрязнение окружающей среды токсикантами вызывает нарушение гормонального статуса, тем самым, изменяя миграционное поведение нерестового стада осетра, и приводит к резорбции половых продуктов (Лукьяненко, Дубинин, 1990). Это наблюдали у части самок осетра в Азовском море в 1995 г. При этом отмечали снижение уровня тестостерона в крови. Характерно то, что значительную долю таких рыб составляли особи заводского происхождения с морфологическими нарушениями, а годом позже уже у 23% самок осетра была зарегистрирована тотальная резорбция икры (Корниенко и др., 1997; Дудкин и др., 2000; Бугаев и др., 2001; 2002; 2003). У самцов осетров при неблагополучной токсикологической остановке также происходят патологические изменения в организме, однако, несколько другого рода. Токсиканты аккумулируются в печени, вызывая частичную дистрофию органа (Рудницкая, 1990; Рудницкая и др., 1998; Рудницкая, Клименченко, 1999; 2000; Рудницкая, Бугаев, 2001а, б).
Многолетние морфофизиологические исследования функционального состояния тканей, органов осетровых показали, что во многих из них отмечены значительные патологические нарушения: гиперплазия респираторного эпителия, деформация жабр, дистрофические изменения в мышцах, локальный гломерулонефрит туловищных почек, жировая дистрофия и гидропическая дистрофия печени, отсутствие границ между красной и белой пульпой в селезенке, патологические изменения в клетках крови, дегенеративные изменения в генеративной системе (Рудницкая, Клименченко, 1999; 2000; Акимова, Рубан, 2000; Дубовская, 2000; Ковальчук, Загртденова, 2000; Кобегенова, Жимбей, 2000; Крючков и др., 2000; Лепилина, 2000; Лепилина, Романов, 2004; Митрофанов, 2000; Гераскин и др., 1998; 1999; 2000; 2001; 2004).
На основании многочисленных исследований, связанных с патологическими изменениями в организме, установлено, что при различных инфекционных, инвазионных и токсических воздействиях в крови рыб отмечаются те или иные дестабилизационные процессы. При этом в первую очередь происходят нарушения в соотношении различных форм лейкоцитов, выполняющих разнообразные физиологические и иммунологические функции (Житенева и др., 1998; Головина, 1996; Моисеенко, 1998а; 19986; Касаева и др., 2006). Значительное число патологических изменений в организмах осетров наблюдали после Чернобыльской аварии в Азово-Черноморском регионе. Так, у 520 производителей осетров выявлен рост численности заболеваний функционально важных органов. Наиболее часто встречали нарушения в печени (85%), примерно у трети из числа обследованных особей отмечали соединительнотканные разрастания и деструкцию коллагена. У 46% рыб была выявлена анемия, у 16% - умеренный лейкоцитоз ней-трофильного характера и лейкоцитопения у 14% особей. В лейкоцитарной формуле 17% обследованных осетров был зарегистрирован сдвиг влево, 19% - эози-нофилия, 20% -моноцитоз (Корниенко, Рудницкая, 2000).
Методы гематологических и физиолого-иммунологических исследований
Ихтиопатологические исследования у рыб во всех сериях опытов проводили по общепринятым методикам (Быховская-Павловская, 1985). При осмотре бестера оценивали состояние операционного шва, меток, жабр, кожных покровов, характер слизеотделения. У производителей стерляди вместо операционного шва оценивали состояние генитального отверстия. Кроме того, учитывали наличие или отсутствие аппетита у рыб, характер поведенческих реакций.
Мазки крови фиксировали раствором Майн-Грюнвальда и докрашивали азур-эозином по Романовскому. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили по методике Ивановой (1983), форменных элементов крови проводили унифицированным методом в счетной камере Горяева, СОЭ - по методу Панченкова (Ли-манский и др., 1984).
Уровень гемоглобина в крови определяли фотометрическим гемоглобин-цианидным методом (метод Drabkin), используя набор реагентов ООО «Агат-Мед» (г. Москва). Концентрацию гемоглобина рассчитывали по формуле: С=(Ео/Ек) 120, где Е0- оптическая плотность опытной пробы; а Ек- оптическая плотность калибровочной пробы; 120- концентрация гемоглобина в калибровочном растворе г/л.
Содержание общего белка в сыворотке крови исследовали биуретовым методом (Меншиков, 1973), фотометрически, используя набор реагентов 000 «Агат-Мед». Определение проводили стандартным методом с регистрацией окрашивания при длине волны 540 нм. Интенсивность окрашивания, пропорциональной концентрации белка рассчитывали по формуле: С (г/л)= (Епр/Ес) 60, где Епр- экстинкция опытной пробы; а Ек- экстинкция калибровочной пробы; 60-концентрация общего белка в стандарте г/л.
Содержание альбумина в сыворотке крови определяли фотометрически по реакции с бромкрезоловым зеленым (Лукичева, Синтебова, 1974) при длине волны 625 нм, используя диагностические наборы реагентов 000 «Агат-Мед». Расчет альбумина производили по формуле: С(г/л)= (Епр/Ес) 25, где Епр- экстинкция опытной пробы; а Ек- ЭКСТИНКЦИЯ калибровочной пробы; 25- концентрация альбумина в калибровочном растворе г/л. Определяли соотношение между уровнем альбуминов и глобулинов (Лиманский и др. 1984).
Уровень иммуноглобулинов определяли по унифицированной методике Воловенко М.А. (1975) фотометрическим способом после реакции с сульфатом цинка при длине волны 540 нм. Концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови рассчитывают по формуле: С=(Е0-Ек) К, где Е0- экстинкция опытной пробы, Ек- ЭКСТИНКЦИЯ контрольной пробы, К- коэффициент пересчета по стандарту мутности.
Лизосомально-катионный тест (ЛКТ) проводили по методу Пигаревского В.Е., Мазинга Ю.А. (1981) с применением окраски мазков зеленым прочным. Мазки фиксировали смесью абсолютного спирта и формалина (19 мл спирта на 1 мл 37% р-р формалина). Результат учитывали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). СЦК=(За+2б+1,5в+1г+0,5д+0е)/100, где 0-3 степень окрашивания цитоплазмы, а-е количество клеток с определенной степенью окрашивания, 100- общее число просмотренных клеток.
В качестве основных биологических показателей были приняты: выживаемость, относительный среднесуточный прирост (CW, %), который рассчитывали по формуле: CW = [2 (Mt-M0)/(Mt-M0) t ] 100% (Винберг, 1959), где Mt - средняя масса конечная, Мо - средняя масса начальная, t- временной период.
Кроме того, рассчитывали коэффициент упитанности по Фультону - К (ф) = 1/М , где 1 - длина малая, до развилки, М - масса тела с внутренностями.
Мониторинг физико-химических условий водной среды (температура, кислород, рН, перманганатная окисляемость, содержание нитрит-ионов, нитрат-ионов, ионов аммония, свободной углекислоты) осуществляли по унифицированным методикам. При этом, ежедневно осуществляли измерения температурного и кислородного режимов. Один раз в неделю определяли содержание нитрат-, нитрит ионов, аммонийного азота, свободной углекислоты, активной реакции среды и перманганатной окисляемости (Руководство..., 1977).
Биохимические анализы выполняли на фотоколориметре КФК-3. для дозировки точных объемов жидкостей применяли одноканальные пипетки переменного объема «Колор» ( ЗАО «ТермоЛабсистемс» г. Санкт-Петербург) Разделение неоднородных жидких систем осуществляли с помощью центрифуги лабораторной медицинской ОГШ-Зм (АО ТНК Дастан, г. Бишкек). С целью поддержания стабильной температуры при проведении исследований использовали термостат электрический суховоздушный ТС-80к (ОАО Казанский завод меди цинской аппаратуры). Взвешивание рыбы осуществляли на электронных платформенных весах типа HL (A and D, Япония).
Полученные данные обрабатывали общепринятыми методами статистического анализа (Лакин, 1980) с использованием программы Microsoft Exel. Достоверность отличий сравниваемых признаков оценивали с помощью st-критерия Стьюдента и непараметрическими методами при допустимой вероятности ошибки р 0,05,р 0,001.
Визуальное наблюдение за поведенческими реакциями рыб проводили с первого дня после операции. В начале эксперимента каких-либо отклонений в состоянии рыбы не выявлено. Повторному осмотру рыба подверглась только на пятнадцатые сутки во избежание дополнительного стресса и травматизации оперированных особей. При этом у всех бестеров отмечено воспаление в области шва (табл. 3). Однако, у рыб из 1-й и 2-й групп зафиксирована картина, характерная для острой фазы воспалительного процесса в области разреза и наложения швов (значительная гиперемия, очаговый некроз покровных и подлежащих тканей, выделение кровянистого экссудата), снижение мышечного тонуса, вялость; в области брюшных жучек, хвостового стебля и меток - потертости и у некоторых особей - петехии.
Биологические показатели молоди белуги
СЦК ЖБ достоверно снизился (р 0,05) и был оценен, как неудовлетворительный (2 балла). На 15-30 сутки в крови бестеров зарегистрировано увеличение числа незрелых форм гранулоцитов со сниженной способностью к фагоцитозу. Так, у рыб получавших Ронколейкин 1 тыс.ед./кг и 2 тыс.ед./кг при увеличении численности палочкоядерных нейтрофилов в 2,3 и 2,2 раза СЦК снизился в 1,9 и 2,3 раза. У бестеров, инъецированных антибиотиком, уровень палочкоядерных нейтрофилов (ПЯН) возрос в 1,8 раза, а СЦК ЛКБ уменьшился в 2,9 раза, что, вероятно, обусловлено не только оперативным вмешательством, как в первых двух случаях, но и дополнительным ингибированием окситетрациклином ней-тропоэза и его негативным воздействием на формирование гранулоцитов способных к фагоцитозу. Обнаружено, что при увеличении количества лимфоцитов в крови увеличивается и СЦК лизосомально-катионных белков нейтрофилов. Коэффициент корреляции между СЦК ЛКБ нейтрофилов и лимфоцитов в крови бестеров составил 0,72. На сорок пятые сутки зарегистрировано некоторое увеличение среднего цитохимического коэффициента у группы особей, инъецированных rIL-2 в дозе 2 тыс.ед./кг, до уровня 0,7, что соответствует по пятибалльной шкале - 4-м. Тогда как, у рыб из групп опыт -1 и контроль этого не зафиксировано. Значения СЦК у бестеров второй группы свидетельствуют о более раннем восстановлении организма после оперативного вмешательства, в том числе фагоцитарной функции гранулоцитов, по сравнению с рыбами первой и третьей групп.
Таким образом, в результате исследований физиологических показателей бестеров, подвергнутых операционному вмешательству зарегистрированы изменения в красной и белой крови, связанные с уменьшением гемоглобина, эритроцитов в крови, повышением числа лейкоцитов, СОЭ. После операции снижается уровень общего белка, альбуминов и повышается концентрация иммуноглобулинов в крови рыб.
Обнаружены некоторые отличия в динамике среднесуточного прироста между группами рыб, инъецированных rIL-2 и окситетрациклином, которые, ви димо, обусловлены более ранними репарационными процессами у бестеров, подвергнутых предоперационной иммунокоррекции.
Неравнозначность клинической картины воспалительной реакции у бестеров из разных групп в течение экспериментального периода косвенно может свидетельствовать о перераспределении функциональной активности групп лимфоцитов. Несмотря на то, что отсутствуют данные по количественному соотношению Т и В - популяций лимфоцитов в крови осетровых и по сравнению с лейкоцитарной формулой теплокровных имеются отличия, мы склонны считать, что схема действия rIL-2 идентична схеме присущей теплокровным организмам. Кроме того, активная регенерация тканей опытных рыб и более ранние сроки репарации, также могут быть определены терапевтическим эффектом rIL-2.
У оперированных бестеров, инъецированных Ронколейкином в дозе 2000 ед./кг массы тела, отмечено усиление эритропоэза, в то время как компенсация концентрации гемоглобина в крови других групп оперированных рыб проходила за счет увеличения уровня гемоглобина в одном эритроците. Это может свидетельствовать о стимуляции функциональной активности гемопоэтической ткани иммунокорректором.
В результате анализа концентраций основных белковых фракций сыворотки крови действие rIL-2 в испытуемых дозах на оперированных бестеров не выявлено.
В процессе исследований лейкограмм и лейкоцитарного профиля и содержания лизосомально-катионных белков в нейтрофилах экспериментальных рыб обнаружено позитивное влияние rIL-2 в обеих испытуемых дозах на активную пролиферацию лимфоцитов и в дозе 2000 ед/кг на восстановление фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов.
Таким образом, поученные данные демонстрируют явные преимущества рекомбинантного интерлейкина-2 в сравнении с окситетрациклином пролонгированного действия и, соответственно, цитокинотерапии перед антибиотикотера-пией.
Результаты ихтиопатологического обследования самок стерляди За десять дней то операции (-10 сутки), каких-либо отклонений в состоянии рыбы не выявлено. На нулевые сутки после подрезания яйцеводов и отбора половых продуктов у всех стерлядей отмечено ярко-выраженное воспаление генитального отверстия, выделение из него сукровицы и полостной жидкости с остатками недосцеженной икры (табл. 9).
