Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Особенности питания пресноводных костистых рыб разных экологических групп 12
1.1.1. Типы питания рыб 12
1.1.2. Спектр питания и биохимический состав пищи рыб разных экологических групп 14
1.2. Структурные и функциональные основы пищеварения у рыб разных экологических групп 22
1.2.1. Особенности строения пищеварительного тракта рыб, различающихся по типу питания 22
1.2.2. Механизмы начальных этапов ассимиляции пищи 26
1.2.3. Ферменты, обеспечивающие различные типы пищеварения 30
1.2.4. Вклад ферментов жертвы в процессы пищеварения рыб 36
1.3. Влияние биотических и абиотических факторов на ферментные системы рыб и беспозвоночных животных 39
1.3.1. Возраст и характер питания 39
1.3.2. Сезон года 46
1.3.3. Температура и рН 49
1.3.4. Ионы тяжелых металлов (Си, Zn, Cd, Hg) 55
1.4. Заключение 69
Глава 2. Материал и методы исследования 71
2.1. Исследуемые виды рыб и беспозвоночных животных 71
2.2. Методы исследования 73
2.3. Постановка экспериментов 77
2.4. Статистическая обработка данных 80
Глава 3 . Влияние температуры, рн и ионов тяжелых металлов (си, zn, cd) на гидролиз углеводов у рыб, различающихся по типу питания, в экспериментах in vitro 81
3.1. Активность карбогидраз в пищеварительном тракте рыб при стандартных условиях (20С, рН 7,4) 81
3.2. Раздельное и комплексное влияние температуры и рН 84
3.3. Раздельное влияние ионов Си, Zn ИЛИ Cd 87
3.4. Комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, 95 Zn ИЛИ Cd)
3.5. Заключение 102
Глава 4 . Влияние температуры, рн и тяжелых металлов (cd, hg) на гидролиз углеводов у рыб в условиях in vivo 104
4.1. Влияние скорости повышения температуры воды на активность и температурные характеристики карбогидраз кишечника рыб 104
4.2. Влияние ацидификации водоема на скорость гидролиза углеводов в кишечнике окуня 120
4.3. Влияние длительного действия ионов Cd in vivo на скорость гидролиза углеводов в кишечнике тиляпии 125
4.4. Активность карбогидраз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике рыб с различным содержанием Hg в организме 130
4.4.1. Влияние поступающей с кормом Hg на активность карбогидраз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике рыб в различных экспериментальных условиях 131
4.4.2. Активность карбогидраз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике окуня из природных водоемов с нейтральным значением рН воды 13 9
4.4.3. Активность карбогидраз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике окуня из природных водоемов с кислым значением рН воды 141
4.5. Заключение 143
Глава 5 . Влияние биотических и абиотических факторов на чувствительность пищеварительных карбогидраз рыб к действию ионов тяжелых металлов (Си, Zn, Cd) IN VITRO 145
5.1. Возраст и физиологическое состояние рыб 145
5.2. Сезон года 148
5.3. Температура 150
5.4. Значения рН 156
5.5. Содержание Hg в пище рыб 157
5.6. Заключение 160
Глава 6. Влияние температуры, рн и ионов тяжелых металлов (си, zn, cd) на гидролиз углеводов в организме водных беспозвоночных животных и молоди рыб в экспериментах IN VITRO 162
6.1. Активность карбогидраз в организме беспозвоночных животных и молоди рыб при стандартных условиях (20 С, рН 7.4) 162
6.2. Раздельное и комплексное влияние температуры и рН 164
6.3. Раздельное влияние ионов тяжелых металлов (Си, Zn и Cd) 167
6.4. Комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, ZmumCd) 173
6.5. Заключение 180
Глава 7. Оценка потенциального вклада карбогидраз объектов питания в процессы пищеварения рыб 183
7.1. Методы оценки вклада экзоферментов в процессы пищеварения рыб 184
7.2. Соотношение активности карбогидраз в пищевом комке и слизистой оболочке кишечника планктофагов и бентофагов при различных значениях температуры и рН. 187
7.3. Соотношение активности карбогидраз в пищевом комке и слизистой оболочке желудка и кишечника ихтиофагов при различных значениях температуры и рН. 191
7.4 Заключение 198
Общее заключение 201
Выводы 213
Список цитируемой литературы 214
- Спектр питания и биохимический состав пищи рыб разных экологических групп
- Возраст и характер питания
- Комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, 95 Zn ИЛИ Cd)
- Влияние скорости повышения температуры воды на активность и температурные характеристики карбогидраз кишечника рыб
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение гидролиза углеводов, играющих важную роль в энергетическом и пластическом обмене гетеротрофных организмов, относится к фундаментальной проблеме ассимиляции пищи в организме животных. Рыбы, благодаря исключительному разнообразию видового состава, среды обитания, особенностей питания и структурной организации пищеварительной системы, традиционно являются классическим объектом исследования процессов пищеварения в рамках сравнительной, эволюционной и экологической физиологии. Согласно современной концепции питания начальные этапы ассимиляции пищи у рыб происходят с помощью трех основных (полостное, мембранное и внутриклеточное) и двух дополнительных (симбионтное и аутолитическое) типов пищеварения (Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005). Общие закономерности мембранного пищеварения, которое наряду с внутриклеточным и полостным пищеварением осуществляется собственными ферментами организма-ассимилятора, в настоящее время детально проанализированы (Уголев, Кузьмина, 1993). Однако в условиях глобального антропогенного загрязнения все более актуальным становится изучение раздельного и комплексного влияния природных и антропогенных факторов на ферменты, расщепляющие углеводы у пресноводных костистых рыб и организмов, составляющих их естественную кормовую базу.
В последние годы активно исследуются симбионтное пищеварение, реализуемое ферментами кишечной микрофлоры (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Кузьмина, Скворцова, 2002; Скворцова, 2002; Извекова, 2005), и индуцированный аутолиз, реализуемый лизосомальными ферментами объектов питания (Уголев, Кузьмина, 1988,1993; Кузьмина, 1993,2000а, 2005). Несмотря на то, что попытки оценить роль ферментов жертвы в пищеварении рыб на протяжении последних 30 лет предпринимались неоднократно, до последнего времени не удавалось выявить значительный вклад экзоферментов в процессы пищеварения консументов (Dabrowski, Glogowski, 1977a,b; Munilla-Moran et al., 1990; Oozeky, Bailey, 1995; Cahu et al., 1995; Kolkovski et al., 1997; Kurokawa et al, 1998). Вместе с тем доказательство участия механизма индуцированного аутолиза в пищеварении рыб представляет значительный интерес для анализа трофических взаимоотношений гидробионтов. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с тем, что аутодеградация жертвы может способствовать уменьшению энергетических затрат консументов на синтез собственных ферментов. Последнее и обусловило необходимость поиска новых методических подходов к решению вопроса о роли экзоферментов в пищеварении консументов.
Среди антропогенных факторов, влияющих на функционирование водных экосистем, важнейшее место принадлежит загрязнению тяжелыми металлами, многие из которых обладают биологической активностью и, в отличие от органических соединений, не подвергаются трансформации в организме гидробионтов, крайне медленно покидая биологический цикл. Си и Zn, в малых количествах являющиеся жизненно необходимыми, наряду с Hg и Cd рассматриваются в ряду самых опасных в экотоксикологическом отношении элементов (Мур, Рамамурти, 1987; Spry, Wiener 1991). Гидробионты способны аккумулировать ионы тяжелых металлов до концентраций в сотни и тысячи раз превосходящие их содержание в окружающей водной среде. Биологические последствия проявляются, прежде всего, в прямом токсическом действии на организм, вызывая изменение различных биохимических, физиологических и морфологических показателей (Rehwoldt et al., 1972; Barata et al, 2002; Khangarot, Rathore, 2003; Немова, 2005). Использование биохимических методов часто позволяет наблюдать изменения в обмене веществ, наступающие, как правило, до появления видимых отклонений от нормы, и дают возможность определять границы адаптационных возможностей организма (Немова, Высоцкая, 2004).
В настоящее время действие ионов тяжелых металлов на пищеварительные ферменты рыб (Sastry, Gupta, 1980; Gupta, Sastry, 1981; Gill et al., 1991; Kuzmina et al., 1999; Туктаров, 2002; Неваленный, Бедняков, 2004; Кузьмина и др., 2005) и одноименные ферменты беспозвоночных животных (Mizrahy, Arhituv, 1989; Yan et al., 1996) изучено недостаточно полно. Практически отсутствуют данные о влиянии Hg, особенно её более токсичной метилированной формы, на пищеварительные гидролазы рыб, входящих в состав ихтиофауны пресноводных водоемов России. Влияние таких экологических факторов как ацидификация водоема, уровень тепловой нагрузки, накопление Hg в организме на активность и чувствительность пищеварительных ферментов рыб к действию ионов Си, Zn и Cd ранее подробно не исследовалось. Несмотря на многочисленные данные, свидетельствующие о влиянии температуры и рН на гидролазы рыб и беспозвоночных животных (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 1999а; Dabrowski, Glogowski, 1977a,b), изучение комплексного действия температуры, рН и ионов тяжелых металлов на активность карбогидраз рыб и объектов их питания до последнего времени не проводилось.
Цель работы - сравнительное изучение раздельного и комплексного влияния температуры, рН и тяжелых металлов (Си, Zn, Cd, Hg) на гидролиз углеводов в пищеварительном тракте пресноводных костистых рыб, различающихся по типу питания, и в организме беспозвоночных животных и молоди рыб, входящих в состав их кормовой базы, а также оценка потенциального вклада карбогидраз жертвы в процессы пищеварения рыб.
s Задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
В идентичных методических условиях определить активность карбогидраз в пищеварительном тракте ряда видов пресноводных костистых рыб, различающихся по типу питания, и организме объектов их питания - беспозвоночных животных и молоди рыб.
Исследовать in vitro раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, Zn и Cd) на гидролиз углеводов в пищеварительном тракте рыб и организме объектов их питания.
Изучить в условиях in vivo влияние уровня тепловой нагрузки, ацидификации водоема, хронического действия Cd и Hg на активность карбогидраз рыб и выявить механизмы адаптации ферментов к условиям функционирования.
Оценить влияние некоторых биотических (возраст, физиологическое состояние) и абиотических факторов (сезон года, уровень тепловой нагрузки, ацидификация водоема, накопление Hg в организме) на чувствительность карбогидраз кишечника рыб к действию ионов Си, Zn и Cd in vitro.
Разработать методические подходы и оценить потенциальный вклад карбогидраз жертвы в процессы пищеварения рыб, различающихся по типу питания.
Научная новизна. Впервые в идентичных методических условиях проведен сравнительный анализ активности карбогидраз в пищеварительном тракте пресноводных костистых рыб, различающихся по типу питания, и организме потенциальных жертв (беспозвоночных животных и молоди рыб) в широком диапазоне температуры и рН. Показано, что в расчете на 1 г сырой массы ткани активность карбогидраз у беспозвоночных животных в диапазоне температуры и рН, характерных для естественных процессов пищеварения у рыб, сопоставима с таковой в слизистой оболочке кишечника планкто- и бентофагов, а в тканях молоди рыб значительно превышает активность карбогидраз слизистой оболочки желудка и кишечника питающихся ими ихтиофагов.
Впервые в идентичных условиях исследовано in vitro влияние ионов тяжелых металлов (Си, Zn и Cd) на активность карбогидраз в пищеварительном тракте рыб различных экологических групп и организме потенциальных объектов их питания - беспозвоночных животных и молоди рыб. Выявлены различия в чувствительности карбогидраз к действию тяжелых металлов не только между представителями различных таксонов, но и между планктонными и бентосными организмами. Показана высокая чувствительность карбогидраз беспозвоночных животных и рыб к действию ионов биогенных металлов (Си и Zn), и значительная устойчивость к действию Cd, не являющегося необходимым микроэлементом. Впервые исследовано комплексное действие температуры, рН и ионов Си, Zn или Cd на активность карбогидраз в пищеварительном тракте рыб, различающихся по типу питания, и
9 организме ряда видов беспозвоночных животных и молоди рыб. Установлено, что карбогидразы консументов и потенциальных жертв могут обладать разной устойчивостью к влиянию указанных факторов. Впервые изучено влияние накопления Hg в организме на активность карбогидраз у рыб из естественных водоемов и в экспериментальных условиях. Впервые установлены изменения кинетических характеристик гидролиза ди- и полисахаридов в кишечнике рыб при действии ртутьорганического соединения (метилртути) природного происхождения. Получены новые данные о механизмах адаптации пищеварительных карбогидраз рыб к функционированию в условиях действия антропогенных факторов (ацидификация водоема, уровень тепловой и ртутной нагрузки). Впервые установлено влияние биотических (возраст, физиологическое состояние рыб) и абиотических (сезон года, уровень тепловой нагрузки, ацидификация водоема, накопление Hg в организме) факторов на чувствительность карбогидраз кишечника рыб к действию ионов Си, Zn и Cd in vitro.
Разработаны новые методические подходы, позволяющие на основе данных по соотношению активности карбогидраз во всей массе слизистой оболочки и содержимого желудка или кишечника консументов с учетом видового состава и массы пищевого комка провести оценку возможного вклада карбогидраз объектов питания в процессы пищеварения рыб. Впервые выявлен значительный вклад карбогидраз жертвы на начальных стадиях пищеварения у ихтиофагов, а также типичных и факультативных планкто- и бентофагов в широком диапазоне температуры и рН.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленные закономерности позволяют глубже понять основы трофических взаимоотношений гидробионтов. Данные о различной устойчивости ферментов, гидролизующих углеводы у рыб, относящихся по типу питания к группе планкто-, бенто- и ихтиофагов, и ряда различающихся по таксономии видов беспозвоночных животных (типы Artropoda и Mollusca) к действию температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, Zn и Cd) расширяют представления о механизмах адаптации процессов пищеварения рыб к действию природных и антропогенных факторов среды. Разработка и использование новых методических подходов с учетом реального пула карбогидраз в содержимом и слизистой оболочке различных отделов пищеварительного тракта в условиях рН и температур, характерных для естественных процессов пищеварения у рыб, позволила приблизиться к оценке реального вклада экзоферментов в процессы пищеварения консументов и выявить особенности, обусловленные экологией гидробионтов. Полученные результаты способствуют лучшему пониманию эволюционно сложившихся пищевых предпочтений у рыб и подтверждают представления о возможности участия ферментов жертвы в процессах пищеварения консументов, что имеет принципиальное
10 значение для трофологии, экологии, а также общей, эволюционной и сравнительной физиологии. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по экологии, биохимии и физиологии рыб, в аквакультуре при разработке искусственных кормов для рыб, и послужить основой для разработки методов оценки эффективности функционирования трофических сетей в биогидроценозах. Практическая реализация полученных результатов может быть осуществлена через отраслевые институты. Положения, выносимые на защиту
Активность карбогидраз в слизистой оболочке кишечника рыб планкто- и бентофагов и организме беспозвоночных животных в расчете на 1 г сырой массы ткани сопоставима в широком диапазоне температуры и рН, в слизистой оболочке желудка и кишечника ихтиофагов значительно ниже, чем в организме объектов их питания. При расчете на всю массу пищевого комка активность карбогидраз жертвы превышает активность ферментов во всей массе слизистой оболочки желудка или кишечника консументов.
Скорость гидролиза углеводов у рыб и объектов их питания изменяется при раздельном и комплексном действии температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, Zn, Cd), при этом величина эффекта зависит от таксономического положения и экологии вида.
Различные биотические (возраст, физиологическое состояние рыб) и абиотические (сезон года, уровень тепловой нагрузки, ацидификация водоема, хроническое действие Cd и Hg) факторы изменяют активность и чувствительность карбогидраз кишечника рыб к действию ионов Си, Zn и Cd in vitro.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: VIII и IX Всерос. конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992; Ярославль, 2000); VIII Congress of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Oviedo, Spain, 1994); I, II, III и IV Междунар. конференциях «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 1995, 1999; Сыктывкар, 2003; Вологда, 2005); Междунар. конференции «Современные проблемы гидроэкологии» (С.-Петербург, 1995); I Конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997); 3-м Всерос. симпозиуме «Физиологические механизмы природных адаптации» (Иваново, 1999); Междунар. конференции «Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова Восточной Фенноскандии» (Петрозаводск, 1999); Конференции «Биологические ресурсы, их состояние и использование в бассейне Верхней Волги» (Ярославль, 1999); II Междунар. симпозиуме «Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре» (Краснодар, 1999); International Conference «Mercury as a global pollutant» (Rio de Janeiro, Brazil, 1999); Научно-практической конференции «Проблемы охраны здоровья
рыб в аквакультуре» (Москва, 2000); Междунар. конференции «Проблемы гидроэкологии на рубеже веков» (С.-Петербург, 2000); II Междунар., III и IV Всерос. конференциях «Механизмы функционирования висцеральных систем» (С.-Петербург, 2001, 2003, 2005); Всерос. конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); Всерос. конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Москва, 2003); Междунар. конференции «Трофические связи в водных сообществах и экосистемах» (Борок, 2003); The regional workshop on Fisheries, Aquaculture and Environment (Lattakia, Syria, 2003); Междунар. конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004); II Междунар, симпозиуме «Чужеродные виды в Голарктике (Борок-2)» (Борок, 2005); Междунар. конференции «Водная экология на заре XXI века» (С.-Петербург, 2005).
Личный вклад автора. Автором обоснована тема, поставлена цель и определены
задачи, выполнена вся биохимическая часть работы, обработка, обобщение и интерпретация
результатов, сформированы научные положения и выводы. Сбор полевого материала и
эксперименты по влиянию уровня тепловой нагрузки и хронического действия тяжелых
металлов, а также разработка новых методических подходов к оценке роли экзоферментов в
пищеварении рыб проведены совместно с коллегами - авторами совместных публикаций,
которым автор выражает глубокую благодарность. -
Публикации. По теме диссертации опубликованы 52 печатные работы (из них 20 статей в рецензируемых журналах и 30 тезисов докладов).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 256 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 240 отечественных и 328 иностранных источников. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 26 рисунками.
Спектр питания и биохимический состав пищи рыб разных экологических групп
Основной пищей пресноводных рыб являются животные организмы, населяющие толщу воды, придонные и донные участки водоема, - ракообразные, личинки насекомых, черви, моллюски, мелкая рыба, молодь рыб. Наличие животной высокобелковой пищи характерно для молоди рыб и подавляющего большинства рыб старших возрастных групп (Остроумова, 2001).
Вместе с тем в содержимом кишечника рыб нередко встречаются водоросли, детрит, остатки высшей растительности. Растительноядные рыбы используют в пищу преимущественно высшую водную растительность и другие крупные растительные объекты, либо питаются фитопланктоном. При этом в составе пищи фитофагагов часто в небольшом количестве находят зоопланктонные организмы, попадающие вместе с основной пищей. В раннем онтогенезе практически все виды, в том числе и растительноядные, используют в качестве корма мелкие формы зоопланктона.
Поскольку многие аспекты физиологии питания наиболее подробно исследованы на примере пресноводных рыб бореальной зоны, наибольший интерес представляют сведения о спектре их питания. Так, при исследовании питания рыб, обитающих в водохранилищах Волжского каскада, в спектре питания планктофага синца отмечено 33 вида ветвистоусых, веслоногих рачков и коловраток, а также личинки хирономид и ручейников, моллюски, олигохеты, водоросли и обрывки макрофитов. Пища представителей этой же трофической группы - ряпушки и тюльки - включала 50 видов животных и растений, в том числе 22 вида планктонных рачков и небольшое количество фитопланктона (Иванова и др., 1978). Важно отметить, что трофическая структура водных экосистем достаточно динамична. На примере верхневолжских водохранилищ показано, что возможна инвазия и массовое развитие видов -вселенцев (байкальский бокоплав Gmelinoides fasciatus, полиморфная дрейсена Dreissena polymorpha и бугская дрейсена D. bugensis, полихета гипания Hypania invalida), способствующих существенному увеличению продуктивности популяции планкто- и бентофагов (Ривьер, Щербина, 2001).
В состав пищи бентофага леща входит до 70 видов гидробионтов (олигохеты, личинки хирономид, моллюски, гаммариды, мизиды, равноногие, ракушковые, веслоногие и ветвистоусые рачки, личинки ручейников, водоросли, макрофиты, а также детрит и грунт), плотвы - более 40 видов беспозвоночных (ветвистоусые и веслоногие рачки, личинки хирономид и ручейников, моллюски и макрофиты, а также водоросли, высшая водная растительность и молодь рыб), густеры - более 80 видов беспозвоночных животных, водоросли, высшая водная растительность, детрит, икра и молодь рыб (Поддубный, 1971; Иванова и др., 1978). В состав пищи ихтиофагов (табл. 1) входит до 20 видов рыб, причем в большинстве случаев доминирует окунь, плотва и ерш (Фортунатова, Попова, 1973; Иванова и др., 1978). В настоящее время из спектра питания ихтиофагов практически исчез ерш, но значительную роль в ряде водохранилищ средней и верхней Волги стали играть такие виды-вселенцы, как бычок Neogobius iljini и N. melanostomus и тюлька (Яковлев и др., 2001). Биохимический состав естественной пищи рыб. Белки, жиры и углеводы являются основными пластическими и энергетическим компонентами пищи гетеротрофных организмов, в том числе и рыб. Несмотря на то, что для некоторых видов рыб основной пищей являются одноклеточные водоросли, водные макрофиты и детрит, большинство видов питается преимущественно животными организмами, богатыми белком, который отличается полноценным аминокислотным составом и высокой доступностью. При этом количество белка в сухом веществе пресноводных беспозвоночных и рыб в зависимости от их вида, условий кормности, абиотических факторов колеблется в пределах 56-70% (Остроумова, 2001; Пономарев, Пономарева, 2003). Исключение составляют лишь моллюски и гаммариды, у которых значительная часть сухого вещества представлена
Высоким содержанием белка (в среднем 40-60% сухого вещества) характеризуются одноклеточные и колониальные микроводоросли, служащие пищей водным беспозвоночным и встречающиеся в пище некоторых растительноядных видов рыб. Высшие водные растения отличаются низким содержанием белка (6-19% сухого вещества), но доступность его понижена из-за трудноперевариваемой клетчатки, свойственной макрофитам (Остроумова, 2001). Определенное количество белка (от 5 до 32% сухого вещества) животного, растительного или бактериального происхождения может содержать детрит, состоящий из отмерших водных организмов.
Содержание жира в сухом веществе колеблется у беспозвоночных от 6 у представителей зоопланктона до 32% у личинок хирономид, у молоди рыб - от 9 до 31%, у одноклеточных водорослей - от 7до 14%, у макрофитов - от 1.8 до 3.4%, в детрите - от 0.3 до 11.2% (Остроумова, 2001). Значительные колебания содержания липидов по данным разных авторов в значительной мере связаны с возможностями используемых методов. В частности, при определении содержания жира при помощи метода Соксклета выявляются преимущественно триглицериды, при использовании метода Фолча и его модификаций -практически все липиды, в том числе и входящие в состав мембран. При втором методе, цифры, характеризующие содержания жира у гидробионтов, получаются выше.
Количество углеводов в сухом веществе у беспозвоночных животных варьирует в пределах 2-18%, у молоди рыб - 0.6-8%, у водорослей - 16-41%, в детрите - 7-58%, у макрофитов - 53-74%, причем от 16 до 32% углеводов у последних представлено клетчаткой (Остроумова, 2001). В расчете на влажный вес ткани содержание углеводов в мышцах рыб совсем незначительно - 0.2-0.6% (Кузьмина и др., 1979). В то же время у представителей бентоса содержание углеводов может составлять около половины массы органического вещества (Кузьмина, 2005).
Несмотря на значительные колебания содержания углеводов в пище, они играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене рыб. Углеводный обмен у рыб складывается из следующих этапов: гидролиз поступивших с кормом ди- и полисахаридов до уровня моносахаридов и всасывание их в кровь; образование и отложение в печени гликогена; расщепление гликогена в печени до глюкозы, образование в печени глюкозы из метаболитов жирового (глицерина) и белкового (аминокислот) обмена и поступление их в кровь; расщепление в клетках глюкозы до молочной (анаэробный этап) и пировиноградной кислоты (аэробный этап); выделение продуктов распада. За счет низкого продуцирования инсулина углеводный обмен у многих видов рыб, особенно у хищников, носит характер диабетического и если рыба получает избыток углеводов, развивается симптом перегрузки печени гликогеном, водянка брюшной полости, увеличение смертности. Основная масса углеводов содержится в растительных компонентах, в сухом веществе которых они достигают 80-90%. В животном организме углеводы резервируются в небольших (несколько % сухого вещества) количествах в виде гликогена, преимущественно в печени и мышцах.
Крахмал, широко распространенный резервный полисахарид растений, является наиболее важным углеводным компонентом пищевого рациона. При продолжительном кипячении примерно 15-25% крахмала переходит в раствор в виде коллоида. Этот "растворимый крахмал" носит название амилоза, которая состоит из неразветвленных цепей, включающих 200-300 остатков глюкозы, связанных в положении сс(1-»4). Остальная часть, амилопектин, не растворяется даже при очень длительном кипячении. Амилопектин имеет разветвленную структуру, в среднем 1 из 20-25 остатков глюкозы содержит боковую цепь, присоединенную в положении сс(1-»6). Молекула амилопектина может включать сотни тысяч остатков глюкозы и иметь молекулярную массу порядка 10 Да (Кольман, Рем, 2000).
Возраст и характер питания
Наиболее подробно исследованы нутритивные адаптации, связанные с изменением активности ферментов в ответ на изменение концентрации соответствующих пищевых субстратов (Barrington, 1957; Fange, Grove, 1979; Kapoor et al., 1975; Уголев, Кузьмина, 1993). Большинство сведений касается генетически закрепленных адаптации ферментных систем пищеварительного тракта (большей активности протеиназ у зоофагов, особенно у типичных ихтиофагов, карбогидраз - у фитофагов), а также значительной изменчивости ферментных систем у видов с широким спектром питания, которая проявляется на всех этапах онтогенеза (Govoni et al. 1986; Ильина, Турецкий, 1987; Кузьмина, Гельман, 1998).
Онтогенез рыб подразделяется на периоды: предличиночный (эндогенное питание за счет желточного мешка), личиночный (переход на экзогенное питание) и мальковый (переход на дефинитивное питание) периоды. В пределах каждого периода выделены этапы развития, продолжительность которых зависит от вида рыб, температуры воды, наличия адекватной для каждого этапа развития пищи (Govoni et al., 1986; Ильина, Турецкий, 1987). Пищеварительный тракт у большинства видов рыб в период эмбриогенеза только закладывается, основные процессы морфогенеза и становления гидролитического аппарата происходят на этапах постэмбрионалыюго развития.
Питание большинства эмбрионов и предличинок рыб осуществляется за счет питательных веществ, запасенных в икре, главным образом, за счет гликогена и липидов (Ильина, Турецкий, 1987). Наиболее значительные изменения в характере питания рыб происходят при переходе от эмбрионального к предличиночному и личиночному периоду, когда эндогенное питание заменяется экзогенным. На ранних этапах личинки нуждаются в небольших по размеру кормовых организмах (бактерии, мелкие формы фито- и зоопланктона), содержащих большое количество легкоусвояемых низкомолекулярных соединений. Затем личинки начинают потреблять более крупные формы зоопланктона, зообентос, а хищные виды и личинок других рыб. Причем отсутствие в пище личинок рыб более крупных кормовых объектов приводит к приостановке их роста (Govoni et al. 1986). Смена объектов питания обусловлена не только размерами, но и различиями биохимического состава жертвы. Входящие в состав рачкового планктона растворимые белковые компоненты состоят в основном из низкомолекулярных (до 1 кД) пептидов и аминокислот; у бентических форм, составляющих кормовую базу мальков и взрослых рыб бентофагов, доминируют полипептиды и низкомолекулярные белки (до 180 кД); у рыб, которыми питаются взрослые хищники, - крупномолекулярные (до 300-450 кД) белки (Ильина, 1986; Кузьмина и др., 1990).
Активность ферментов, способных гидролизовать различные субстраты, выявляется на самых ранних этапах эмбрионального развития рыб. Динамика активности одноименных гидролаз зависит от вида рыб и условий среды обитания, главным образом, спектра питания и температуры (Коновалов, 1986; Ильина, Турецкий, 1987; Кузьмина, Гельман, 1998). У большинства видов рыб в период раннего эмбриогенеза большое значение имеют кислые протеиназы (Немова, Высоцкая, 2004). У предличинок осетровых рыб активность кислых протеиназ ("пепсина" по терминологии ряда авторов), появляющаяся в возрасте 11-17 суток постепенно возрастает, особенно при переходе личинок на внешнее питание (Плотников, Прокуряков, 1984; Тимейко, Бондаренко, 1986; Пономарев, Пономарева, 2003). Увеличение активности кислых протеиназ в пищеварительном тракте сиговых совпадает с формированием желудка и началом работы пищеварительных желез (Ильина, 1986; Пономарев, Пономарева, 2003). У костистых рыб также обнаружена активность "пепсина" (Kawai, Ikeda., 1973a,b; Vu, 1983). В большинстве указанных работ активность кислых протеиназ регистрировалась в течение первых 30-130 сут после вылупления. Важно отметить, что пепсин, секретируемый гастроцитами желудочных рыб, появляется лишь во время перехода в мальковый период (Kawai, Ikeda., 1973a,b; Alliot et al., 1980; Vu, 1983; Govoni et al., 1986), а активность кислых протеиназ на ранних этапах развития, по всей вероятности, обусловлена активностью катепсинов, обеспечивающих процессы внутриклеточного гидролиза белка. Активность кислых протеиназ (катепсинов) в кишечнике мальков и взрослых рыб остается на относительно низком уровне, в то время как активность пепсина значительно возрастает в течение первых 3-х месяцев жизни молоди (Кузьмина, Гельман, 1998).
Крайне низкая активность "нейтральных" протеиназ на всем протяжении личиночного развития отмечена у растительноядных рыб сем. карповых, наибольшая ферментативная активность в теле личинок наблюдается на 7-21 сут после вылупления (Волкова, Неваленный, 1996). При этом у белого амура Ctenopharyngodon idella максимальная активность ферментов отмечена в возрасте 2+, у белого толстолобика Hypophthalmichthys molitrix - 5+ (Волкова, 1999). Видовые различия возрастной динамики протеаз, функционирующих при нейтральных значениях рН, по-видимому, обусловлены разным соотношением активности тканевых нейтральных протеиназ, остаточной активностью сериновых протеиназ, а также активностью протеиназ энтералыюй микробиоты.
Слабая активность щелочных (преимущественно сериновых) протеиназ у предличинок осетровых регистрируется лишь на 6 сут после вылупления и значительно увеличивается после перехода личинок на экзогенное питание (Тимейко, Бондаренко, 1986; Пономарев, Пономарева, 2003). У костистых рыб в период эмбриогенеза активность сериновых протеиназ также крайне низка (Ильина, Турецкий, 1987). При этом у карпа и форели активность трипсина зарегистрирована сразу после вылупления личинок, у атлантического палтуса на стадии желточного мешка, у сига и лаврака - на стадии начала экзогенного питания, у щуки - в возрасте 18 сут (Кузьмина, Гельман, 1998). Чрезвычайно низкий уровень активности щелочных протеиназ был обнаружен в течение первого месяца жизни у ряда карповых (карп, плотва, лещ, синец) видов рыб, а также у окуня и щуки (Уголев, Кузьмина, 1993). У рыб семейства карповых активность трипсино- и химотрипсиноподобных пептидгидролаз в процессе развития личинок увеличивается (Коновалов, 1986; Ильина, Турецкий, 1987; Волкова, Неваленый, 1996). У старших возрастных групп эврифагов и ихтиофагов активность щелочных протеиназ, как правило, значительно выше, чем у личинок (Уголев, Кузьмина, 1993). Активность протеиназ в различных отделах пищеварительного тракта половозрелых рыб варьирует в зависимости от типа питания, и в кишечнике безжелудочных бенто- и планктофагов может быть выше, чем у ихтиофагов (Кузьмина, Кузьмина, 1990; Кузьмина, Скворцова, 2001).
Комплексное влияние температуры, рН и ионов тяжелых металлов (Си, 95 Zn ИЛИ Cd)
Уровень ОАА при рН 7.4 прямо пропорционально зависел от температуры у всех трех видов рыб. Скорость гидролиза крахмала при увеличении температуры от 0 до 20С возрастала у леща в 3.8 раза, у судака и окуня - лишь в 1.8 раза. Эти результаты хорошо согласуются с данными по влиянию температуры на активность а-амилазы у тех же видов рыб (Кузьмина, 1985). Интересно отметить, что у окуня и судака ферменты, гидролизующие белковые компоненты пищи, более чувствительны к повышению температуры, чем карбогидразы. Так, общая протеолитическая активность при рН 7.4 увеличивалась в 2.1,3.3 и 4.0 раза у леща, окуня и судака с ростом температуры от 0 до 20С (Кузьмина, 1997). Эта закономерность справедлива для большинства типичных и факультативных хищников, которые продолжают питаться при температуре близкой к 0С, в то время как бентофаги прекращают питание при температуре 7С (Уголев, Кузьмина, 1993). Степень увеличения ОАА с ростом температуры варьирует в зависимости от рН инкубационной среды.
Максимальные значения ОАА у леща отмечены при рН 7.4, у окуня и судака при рН 8.3. У всех трех видов рыб снижение рН до 5.0 уменьшает уровень ОАА при всех температурах, но в большей степени при температуре 20С: у леща в 3, у окуня и судака в 2 раза. Максимальное снижение ОАА отмечено при совместном действии температуры 0С и рН 5.0 у леща в 7 раз, у окуня и судака в 3-4 раза по сравнению рН 7.4 и 20С. При этом совместный эффект температуры и рН превышает арифметическую сумму эффектов отдельных факторов. Аналогичные эффекты совместного влияния температуры и рН показаны и при исследовании активности протеиназ у тех же видов рыб (Кузьмина, 1997).
Наибольшая чувствительность карбогидраз к действию ионов Cd отмечена у бентофагов в области нейтральных значений рН, у типичных и факультативных хищников -в области щелочных значений. Достоверное снижение ОАА в присутствии ионов Cd отмечено у леща на 23% (рН 7.4, 10С), у окуня на 11% (рН 8.3 и 20С), у судака на 25% (рН 8.3, 20С). Однако взаимодействие двух факторов - температуры и ионов Cd, а также рН и ионов Cd было статистически значимым лишь у окуня (р 0.02). Несмотря на то, что максимальное торможение ОАА установлено при комплексном действии температуры 0С, рН 5.0 и ионов Cd у всех исследованных видов рыб, статистически достоверное взаимодействие трех факторов не выявлено, а снижение ферментативной активности в подавляющем большинстве случаев полностью обусловлено комплексным действием температуры и рН.
В идентичных экспериментальных условиях установлено, что активность протеиназ в присутствии ионов Cd (50 мг/л) достоверно снижалась лишь у окуня - на 39% от контроля при 20С, рН 8.3 (Кузьмина, 1997). Полученные данные об усилении токсичности ионов Cd с увеличением температуры хорошо согласуются с результатами Эйслера (Eisler, 1971), показавшего, что токсичность ионов Cd для фундулюса Fundulus heteroclitus в 1.7-3 раза выше при температуре 20С, чем при температуре 5С. Совместный эффект ионов Cd и низких значений рН практически не отличается от такового при действии только рН, т.е. токсичность ионов Cd снижается при увеличении кислотности среды. Аналогичная закономерность была отмечена ранее у фундулюса (Gardner, Yevich, 1969) и личинок медаки Oryzias latipes (Nakagava, Ishio, 1989).
Анализ механизмов наблюдаемых изменений уровня ОАА слизистой оболочки кишечника рыб затруднен, поскольку этот показатель является интегративной характеристикой. Как известно, гидролиз углеводов на структурах слизистой оболочки кишечника реализуется двумя группами ферментов: адсорбированными из полости кишечника гидролазами панкреатического происхождения (а-амилаза) и трансмембранными ферментами апикальной мембраны энтероцитов (глюкоамилаза и мальтаза). Скорость всего процесса зависит от активности каждого из указанных ферментов.
Раздельное и комплексное влияние температуры, рН и ионов Cd на активность сахаразы исследовано на примере леща и судака (табл. 10). Активность сахаразы в кишечнике леща более чем в 3 раза превышает таковую у судака при стандартных условиях (рН 7.4, 20С). Максимум сахаразной активности у леща отмечен при нейтральных значениях рН, у судака -при щелочных. Снижение температуры до 0С или сдвиг рН в кислую сторону уменьшает ферментативную активность в 1.5-2 раза у обоих вид рыб (р 0.0001). Активность сахаразы в присутствии ионов Cd достоверно снижается у леща на 15% (рН 8.3, 20С) и 18-20% (рН 7.4,10С и 20С), у судака на 28% (рН 8.3,20С).
Совместное действие температуры 0С и рН 5.0 снижает активность сахаразы у обоих видов рыб в 2.7 раза по сравнению максимальным уровнем, но статистически достоверное усиление эффекта по сравнению с действием отдельных факторов отмечено лишь у леща (р 0.05). Сочетание температуры 0С и ионов Cd снижает ферментативную активность у леща в 2 раза, у судака - в 1.5 раза при всех исследованных значениях рН. Активность сахаразы у леща снижается в 1.6 раза при совместном действии щелочных или кислых рН и ионов Cd, у судака снижается в 2 раза при сочетании рН 5.0 и ионов Cd. При этом достоверное усиление эффекта установлено лишь при действии рН и ионов Cd у леща (р 0.0025).
Влияние скорости повышения температуры воды на активность и температурные характеристики карбогидраз кишечника рыб
Принято считать, что температурные и трофические условия среды в наибольшей степени определяют условия роста, накопления биомассы и, в конечном счете, продуктивность популяций рыб, обитающих в пресноводных водоемах (Бретт, 1983). В последние десятилетия наблюдается процесс глобального потепления климата, вызванный как естественными, так и антропогенными факторами (Изменения ...., 2002). В северной части умеренной климатической зоны зимы стали более теплыми, а в летнее время наблюдаются периоды экстремально высоких температур, нередко достигающих в прибрежной части водоемов 30-32С (Попова, 2003).
Температура является одним из основных абиотических факторов среды, определяющих основные параметры жизнедеятельности рыб в водоеме. Некоторые виды рыб вьщерживают колебания в несколько десятков градусов (эвритермные виды), другие приспособлены жить в более узком температурном диапазоне (стенотермные). Для видов, обитающих в умеренных широтах России, этот диапазон составляет приблизительно от 0 до 38С (Проссер, 1977; Шмидт-Ниельсен, 1982; Голованов и др., 1997). Изменение температуры среды приводит к значительным изменениям скорости протекания метаболических процессов, темпа роста, интенсивности питания, скорости переваривания пищи, а также кинетических характеристик различных ферментов (Шмидт-Ниельсен, 1982; Алабастер, Ллойд, 1984; Уголев, Кузьмина, 1993). Даже кратковременное изменение температуры воды до значений, лежащих за границами метаболического оптимума, может привести к нарушению равновесия обмена веществ, инактивации и денатурации ферментов, и, как следствие, к гибели организма (Кангур, Кирсипуу, 1976; Константинов, 1979; Бигон и др., 1989).
В настоящее время изучение температурной толерантности рыб становится все более актуальным в связи с проблемой антропогенного термического загрязнения водной среды сбросными подогретыми водами промышленных предприятий (Lutterschmidt, Hutchison, 1997; Beitinger et al., 2000; Голованова и др., 2005). Резкие нехарактерные для сезона изменения температуры воды в естественных водоемах в зонах сброса вод атомных и тепловых электростанций, часто используемых для рыборазведения, могут приводить к массовой гибели рыб (Голованов, 2001). Кроме того, наложение глобального потепления климата на локальное термическое загрязнение может привести к гибели гидробионтов даже при нормативном сбросе подогретой воды в естественные водоемы. При этом важным является не только выявление термоустойчивости разных видов гидробионтов, но и оценка воздействия критических температур на функционирование различных систем организма рыб, в том числе и на пищеварительную систему.
Для анализа механизмов температурных адаптации рыб к постоянно меняющимся условиям окружающей среды широко используется определение верхних и нижних летальных температур, характеризующих границы жизнедеятельности животных. В ряде работ исследовано влияние различных скоростей повышения температуры воды (от 0.01 до 120С/час) на уровень верхних летальных температур у рыб разных видов. При этом были показаны как видовые различия в значениях верхних летальных температур, так и зависимость величины этого показателя от возраста рыб, сезона, температуры предварительной акклимации и скорости изменения температуры окружающей среды (Becker, Genoway, 1979; Лапкин и др. 1981, 1990; Elliott, Elliott, 1995; Смирнов, Голованов, 2004аД 20056). Многие авторы отмечают существенное уменьшение уровня летальных температур зимой по сравнению с летом (Hlohowskyi, Wissing, 1985; Лапкин и др, 1990; Смирнов, Голованов, 2004а), что, по всей вероятности, может являться причиной массовой гибели рыб при сбросах теплой воды в водоемы в зимний период.
Влияние температуры на активность пищеварительных ферментов у многих видов морских и пресноводных рыб детально изучено как в условиях in vivo, так и в экспериментах in vitro (Gelman et al., 1992; Уголев, Кузьмина, 1993; Kuz mina et al., 2003; Коростелев, Неваленный, 2005). При этом установлено, что ферментные системы пищеварительного тракта рыб хорошо адаптированы к функционированию в широком диапазоне температур (Кузьмина, Голованова, 1983; Кузьмина, 1985, 19906; Уголев, Кузьмина, 1993). Однако действие высоких температур на активность пищеварительных гидролаз рыб в условиях in vivo изучено крайне слабо (Кузьмина, Поддубная, 1986), а аналогичные исследования в области сублетальных значений температур при различных скоростях повышения температуры воды отсутствуют. В то же время значительный интерес для экологической физиологии и современной аквакультуры представляет оценка влияния повышения температуры на переваривание пищи у рыб осенью и ранней зимой, когда повышение температуры среды противоречит сезонному ходу событий.
Изучение влияния различных скоростей повышения температуры воды in vivo на уровень ОАА, активности сс-амилазы и сахаразы слизистой оболочки кишечника рыб проводили в различные сезоны года, используя в качестве объектов исследования молодь серебряного карася, карпа и плотвы. Температуру воды в опытных аквариумах повышали с различной скоростью ( 0.1 - 50С/ч) до нарушения локомоторной функции рыб - поворота на бок, при этом в случае прекращения температурного воздействия рыба сохраняла жизнеспособность. Сублетальные значения температуры в конечной точке эксперимента соответствовали критическому термическому максимуму (КТМ). В случае продолжения нагрева воды рыбы погибали, при этом значения верхней летальной температуры на 1-1.5С превышали значения КТМ. Продолжительность опыта в зависимости от сезона составляла 13-30 сут при скорости нагрева воды 0.1С/ч и 5-0.3 ч при скоростях нагрева 4,10,16,32 и 50С/ч. Контрольных особей содержали при температуре акклимации.
У годовиков и двухлеток (1+) серебряного карася наиболее высокий уровень КТМ отмечен в летний период, наиболее низкий - в зимний период (Смирнов, Голованов, 2004а). При этом летом уровень КТМ при различных скоростях нагрева воды изменяется незначительно (39.2-38.1С), в то время как в другие сезоны значения этого показателя зависят от скорости повышения температуры воды. Так, при скорости 50С/ч уровень летальной температуры снижается зимой на 18, осенью и весной на 15, а летом - лишь на 1% от максимального уровня, отмеченного при минимальной скорости нагрева и принятого за 100%. Наиболее яркие сезонные различия этого показателя были обнаружены при скорости повышения температуры воды 4С/ч, когда значения КТМ составляли 38.7+0.1 летом, 35.3+0.1 весной, 31.8±0.2 осенью и 28.5±0.3С зимой.
Максимальным уровень ОАА у карасей контрольной группы был отмечен осенью 98.2±2.2, более низкий 64.0±2.0 летом и 43.7+0.7 весной, минимальный 17.1 ±0.5 мкмоль/г мин - зимой (рис. 6). При низкой скорости повышения температуры воды отмечено достоверное увеличение уровня ферментативной активности во все сезоны - в 2.5 раза зимой ив 1.1-1.3 раза в другие сезоны (р 0.05). Дальнейшее увеличение скорости нагрева воды вызывает последовательное повышение активности ферментов в летний период, последовательное снижение в весенний и зимний периоды до уровня, близкого таковому у контрольных рыб, и резкое снижение осенью. При этом в осенне-зимний период максимальные значения ОАА превышают минимальные в 3.6 раза (р 0.01).
![Влияние типов питания на иммунный статус коренных народов Ямала [Электронный ресурс]](/i/i/4464/205192.png "Влияние типов питания на иммунный статус коренных народов Ямала [Электронный ресурс] Береснева Любовь Алексеевна")
