Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы активно исследуются реакции различных биологических объектов на такой физический фактор, как низкоинтенсивное импульсное излучение различной природы (Adey W.R., 1981; Budowsky E.I. et a!., 1986; Venugopalan V. et al„ 1995; Даренская Н.Г. с соавт., 1997; Humphreys T.R., 199S; Ульяненко C.E., 2000; Чернов З.С. с соавт., 1989; Riesz P. and Kondo Т., 1992; Большаков М.А. с соавт., 2000; Feril L.B. et al., 2003; Dromi S. et al., 2007), вследствие широкого распространения источников такого излучения в промышленности, медицине и в быту (Григорьев Ю.Г. с соавт., 1999).
К настоящему времени установлено, что практически все известные типы клеток реагируют на такое воздействие, при этом ответная реакция может быть зарегистрирована на всех уровнях организации — от молекулярного до организменного (Adey W.R., 1980; Антипов В.В., 1980; Григорьев Ю.Г. с соавт, 1999; Узденский А.Б., 2000; Степанян Р.С., 2000; Гапеев А.Б. и Чемерис Н.К., 1994; 2000). Наиболее выраженный биологический ответ на импульсное излучение отмечается у биообъектов, характеризующихся достаточно высокой пролиферативной активностью (Humphreys T.R., 1998; Sicard-Rosenbaum L. с соавт., 1998).
Для всех типов экспериментальных моделей общей закономерностью является тот факт, что биологические эффекты в ответ на импульсное воздействие существенно отличаются от эффектов, наблюдаемых при воздействии того же вида излучения в непрерывном режиме (Чернов З.С. с соавт., 1989; Fang H.Y. et al., 2007). Так, Sicard-Rosenbaum L. с соавторами показали, что использование ультразвукового излучения в импульсном режиме приводит к торможению роста опухоли при отсутствии такого эффекта после воздействия непрерывного излучения при сопоставимых интенсивностях (Sicard-Rosenbaum L. et al., 1998). Более того, реакция клетки на импульсное воздействие напрямую зависит от частоты повторения импульсов излучения, т.е. формирование биологического ответа происходит лишь при определенном наборе импульсов в единицу времени (Adey W.R., 1980, 1981; Большаков М.А. с соавт., 2000; Карташев А.Г. и Большаков М.А., 2005). Кроме того, выявлено, что реакция клеток на воздействие импульсных излучений низких интенсивностей связана не с повышением температуры (что характерно для высокоинтенсивных излучений), а с модуляцией внутриклеточных процессов, которые проявляются в изменении конформации биологических молекул и надмолекулярных структур, нарушении физико-химических свойств мембран и активности каналообразующих белков, каталитических свойств ферментов и др. (Карташев А.Г. и Большаков М.А., 2005).
Однако к настоящему моменту выявить какие-либо общие механизмы действия импульсных излучений на живые объекты не представляется возможным. Это связано с тремя основными недостатками исследований такого рода: 1) использование несопоставимых по физиологическим характеристикам биологических объектов (от бактерий и дрожжей до целостного организма); 2)
использование различного диапазона частот повторения импульсов; 3) использование различных по интенсивности воздействий. Для устранения этих недостатков необходимо, во-первых, использовать биологические объекты, обладающие сходными свойствами. В качестве таких модельных объектов могут выступать клетки, характеризующиеся высокой скоростью пролиферации, поскольку способность к росту является самой универсальной функцией всех биологических объектов. В этой связи удобным модельным объектом являются клетки костного мозга и селезенки вследствие их высокой чувствительности к действию различных излучений, а также из-за их непосредственного участия в качестве регуляторов и эффекторов важнейших физиологических функций всего организма. Кроме того, удобной биологической моделью являются опухолевые клетки различного происхождения вследствие крайней степени их иммортализованности, т.е. способности к неограниченному делению. Во-вторых, необходимо использовать одинаковый диапазон частот повторения импульсов для различных излучений. Так, еще в 80-х годах прошлого века был определен диапазон частот, при использовании которого реакция биологических объектов значительно усиливается - это диапазон от 0 до 40 Гц (Adey W.R., 1980, 1981). В-третьих, дозовые нагрузки должны находится в области «малых» значений, характерных для данного вида излучений.
Следует отметить, что все вышеизложенное касалось работ, посвященных исследованию реакций биологических объектов на импульсное электромагнитное и ультразвуковое излучения. Это связано с тем, что источники, позволяющие генерировать аналогичное (импульсное излучение при низких значениях дозы) ионизирующее излучение, появились недавно (Артемов К.П. с соавт., 2004). По этой причине в литературе практически отсутствуют какие-либо данные по исследованию их биологического действия. Однако следует отметить, что использование ионизирующего излучения при малых значениях дозы уже само по себе будет видоизменять биологический эффект в облучаемом объекте, независимо от уровня его организации (Luckey T.D., 1998; Chen S.L. et al., 2000), а исходя из литературных данных по исследованию других типов излучений, работающих в импульсном режиме (Humphreys T.R., 1998; Даренская Н.Г. с соавт., 1997; Большаков с соавт., 2000), можно предположить, что ответные реакции биообъектов, индуцированные воздействием рентгеновского излучения в импульсном режиме, будут видоизменяться еще в большей степени.
Таким образом, научная сторона работы в фундаментальном и прикладном аспектах предполагает сравнительное исследование биологического ответа быстро-пролиферирующих типов клеток различного происхождения на воздействие импульсно-периодических излучений. При этом неотъемлемой частью таких исследований является изучение зависимости биологических эффектов от частоты повторения импульсов.
Цель исследования: изучение общих закономерностей и механизмов действия импульсно-периодического рентгеновского, микроволнового и ультразвукового излучений на нормальные и опухолевые клетки.
Задачи исследования:
Исследовать функциональные показатели клеток костного мозга и селезенки при тотальном облучении здоровых мышей низкодозовым импульсно-периодическим рентгеновским излучением.
Исследовать влияние низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения на рост опухоли при тотальном облучении мышей, а также на уровень пролиферативной активности опухолевых клеток in vitro.
Оценить способность низкодозового импульсно-периодического рентгеновского излучения индуцировать процесс апоптоза в опухолевых клетках.
Исследовать изменение уровня пролиферативной активности и апоптоза нормальных и опухолевых клеток в ответ на воздействие низкоинтенсивного импульсно-периодического микроволнового излучения in vitro.
Исследовать выживаемость и механизм гибели опухолевых клеток in vitro после воздействия низкоинтенсивного импульсно-периодического ультразвукового излучения.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние импульсно-периодического рентгеновского, микроволнового и ультразвукового излучений на различные типы нормальных (клетки селезенки и костного мозга) и опухолевых клеток (мастоцитома Р-815, карцинома Эрлиха, рак шейки матки He-La, лейкемия человека U 937), т.е. клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью. Впервые показано, что реакция нормальных и опухолевых клеток в ответ на импульсно-периодическое воздействие различна: выявлено снижение уровня пролиферации опухолевых клеток, при отсутствии повреждений нормальных клеток. При этом показано, что механизм гибели опухолевых клеток связан с индукцией в них процесса апоптотической гибели, сопровождающегося увеличением продукции активных форм кислорода, экспрессии гена р53, выходом цитохрома С в цитоплазму и активацией каспазы-3.
Установлено, что при использовании низкоинтенсивного или низкодозового импульсно-периодических излучений характер биологического ответа зависит от частоты повторения импульсов, при этом такая зависимость является нелинейной — наибольший эффект наблюдается при использовании следующих частот повторения импульсов: 10,13 и 16 Гц.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о закономерностях биологических эффектов, индуцируемых импульсно-периодическим рентгеновским, микроволновым и ультразвуковым излучениями, при условии, что дозовые нагрузки за сеанс облучения остаются в области «малых» значений, характерных для данного вида излучения. Для этих условий установлены общие закономерности и механизмы биологического ответа клеток, характеризующихся высокой скоростью пролиферации, на воздействие импульсно-периодических излучений.
Показанный в работе высокий эффект ингибирования пролиферативной
активности на различных экспериментальных моделях опухолевого роста при отсутствии повреждающего действия на нормальные клетки, указывает на перспективность разработки методов низкодозовой лучевой терапии злокачественных новообразований с использованием источников импульсно-периодических ионизирующих и неионизирующих излучений. Положения, выносимые на защиту.
Биологические эффекты, индуцирующиеся в клетках с высокой пролиферативиой активностью воздействием низкодозового или низкоинтенсивного импульсно-периодического излучения, зависят от частоты повторения импульсов, причем такая зависимость является нелинейной. Биологическая реакция клеток наблюдается лишь на определенных «эффективных» частотах 3, 10, 13 и 16 Гц и существенно отличается от биологического ответа клеток на воздействие в непрерывном режиме.
Общее количество нормальных клеток при тотальном облучении здоровых мышей низкодозовым импульсно-периодическим рентгеновским излучением, в зависимости от использованной частоты повторения импульсов, не изменяется, либо снижается, но при этом активируются процессы репарации за счет усиления клеточной пролиферации. Такое же воздействие на опухолевые клетки приводит к значительному торможению их роста.
Механизм гибели опухолевых клеток после воздействия низкодозового или низкоинтенсивного импульсно-периодического излучения связан с индукцией в них процесса апоптотической гибели, инициатором которой является усиленная продукция в клетках активных форм кислорода. Апробация работы. Результаты научно-исследовательской деятельности
доложены и обсуждены на Третьей международной конференции «Электромагнитные поля и здоровье человека» (2002 г., Москва - Санкт-Петербург); XLI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2003 г., Новосибирск); на конференции молодых ученых ТГУ «Старт в науку» (2004 г., Томск); на конференции молодых ученых ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (2004 г., Томск); на 47-м Съезде радиационных исследований Японии (2004 г., Нагасаки, Япония); на 12-м Международном съезде по повышению эффективности терапии рака (2006 г., Тоямя, Япония); на 2-ом Европейском симпозиумоме по изучению импульсных источников излучения (2004 г., Гамбург, Германия); на V Конгрессе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2004 г., Томск); на конференции молодых ученых ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (2005 г., Томск); на VI Конгрессе молодых ученых и специалистов СибГМУ (2005 г., Томск); на X Всероссийском онкологическом конгрессе (2006 г., Москва); на Всероссийской конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (2006 г., Москва); на IV Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (2007 г., Москва); на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы
клинической и экспериментальной онкологии» (2007 г., Москва); на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (2007 г., Москва); на обществе онкологов ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (2007 г., Томск); на конференции «Старт в науку», аккредитованной по программе «У.М.Н.И.К.» (2008 г., Томск).
По теме диссертационной работы имеется 25 публикации, из которых 3 статьи входят в перечень журналов, рекомендованных ВАК, 3 статьи в зарубежных журналах, 17 тезисов в материалах конференций, в том числе 3 в тезисах зарубежных конференций и один патент на изобретение.
Объем н структура работы. Работа изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственно результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего 261 источников, в том числе 136 иностранных. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 9 таблицами.
