Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о физиолого-биохимических механизмах функционирования костной ткани 9
1.1. Морфо-функциональная характеристика костной ткани 9
1.2. Общая характеристика неорганических компонентов костной ткани 12
1.3. Общая характеристика органического компонента и его роль в формировании костной ткани 19
1.4. Эндокринная регуляция обмена костной ткани 26
1.5. Особенности действия низкоинтенсивных магнитных полей на организм млекопитающих и на метаболизм костной ткани 33
Глава 2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Объект исследований и условия постановки эксперимента 39
2.2. Методы исследований 43
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
3.1. Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия 46
3.2. Влияние инъекций гидрокортизона на обменные процессы в организме крыс 51
3.3. Изменения процессов костной резорбции при многократном воздействии ПМП 56
3.4. Комбинированное влияние инъекций ГАП и ПМП на организм животных на фоне теплового воздействия 63
3.5. Биологические эффекты хронического действия ПМП на состояние костной резорбции 69
3.6. Комбинированное влияние инъекций ГАП и хронического действия ПМП на организм животных при тепловом воздействии 73
Глава 4. Обсуждение результатов 81
Выводы 98
Список использованных источников литературы 100
Приложения
- Морфо-функциональная характеристика костной ткани
- Общая характеристика органического компонента и его роль в формировании костной ткани
- Объект исследований и условия постановки эксперимента
- Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время возросло количество различных заболеваний опорно-двигательного аппарата, расширился контингент лиц, страдающих нарушениями регуляции обмена костной ткани. Часто причинами подобных нарушений могут быть неблагоприятная экологическая обстановка, заболевания внутренних органов, постоянные стрессы. Как известно, в стрессовых ситуациях активизируется гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система, в результате чего повышается выработка стероидных гормонов, усиливающих процессы резорбции костей (Дедов И.И. и соавт., 2002).
С целью борьбы с потерей костной ткани в медицинской практике широко используют целый ряд препаратов, регулирующих обмен кальция и фосфора в организме. Весьма перспективным в этом отношении нам представляется ал-логенный гидроксиапатит (Волова Л.Т., Подковкин В.Г., 2000). Он получается из натуральной кости и кроме кальция и фосфора содержит микроэлементы в тех же количествах, в которых они имеются в костной ткани. Поэтому его применение способствует более эффективному протеканию процессов регенерации костной ткани (Власов М.Ю., 2002; Волова Л.Т. и соавт., 2003). Однако для теоретического обоснования применения аллогенного гидроксиапатита с целью предотвращения потери костной массы необходимо более детальное изучение механизмов его воздействия на регуляцию метаболических процессов.
Хорошо известно, что магнитные поля обладают большой биологической активностью. Они способны изменять функциональное состояние нервной и эндокринной систем и, таким образом, оказывать свое влияние на различные стороны метаболизма (Холодов Ю.А., 1998). Имеются сведения и о воздействии этого физического фактора на обмен костной ткани и кальция. Это находит применение в медицинской практике. Был разработан способ стимуляции ос-теогенеза с помощью магнитного поля, успешно применяемый для ускорения срастания переломов костей (Савельев В.Н., Муравьев М.Ф., 1976).
Недостатком этого способа лечения является применение магнитного поля высокой напряженности - 500 Э. В настоящее время имеются данные о не-
5 благоприятном влиянии на организм человека магнитньгх полей высокой интенсивности. При этом известно, что поля, сравнимые по своей величине с геомагнитным полем, также обладают высокой биологической активностью (Пре-сман А.С., 1968). Однако их использование в медицинской практике к настоящему времени еще не нашло широкого распространения в связи с недостаточной изученностью физиологических и биохимических механизмов влияния на живой организм.
Цель исследования. Произвести в эксперименте комплексную оценку реакции организма на влияние ПМП различной продолжительности действия при эктопическом введении аллогенного ГАП в условиях искусственно вызванного усиления костной резорбции.
Основные задачи исследования.
Проанализировать в эксперименте влияние повышенной температуры воздуха на морфо-функциональное состояние костной ткани, функцию коры надпочечников и биохимические показатели крови, характеризующие метаболизм костной ткани у животных.
Выявить особенности многократного периодического воздействия низкоинтенсивного постоянного магнитного поля на морфо-функциональное состояние костной ткани, функцию коры надпочечников и показатели метаболизма костной ткани у животных в условиях влияния высокой температуры воздуха.
3. Исследовать влияние хронического действия магнитного поля на
функциональное состояние коры надпочечников, процессы перекисного окис
ления липидов и антиоксидантной защиты на фоне повышенной температуры.
Выявить влияние внутримышечного введения аллогенного гидроксиа-патита на морфо-функциональное состояние костной ткани.
Проанализировать реакцию коры надпочечников и показатели метаболизма костной ткани на введение гидроксиапатита на фоне термического воздействия.
6. Выявить особенности реакции коры надпочечников, состояние антиоксидантних систем и изменения показателей обмена костной ткани в условиях комбинированного воздействия теплового фактора, магнитного поля и введения гидроксиапатита.
Научная новизна.
В проведенном исследовании впервые дана комплексная оценка реакции организма животных на влияние низкоинтенсивного магнитного поля с различной продолжительностью действия и эктопического введения аллогенного ГАП на ряд жизненно важных систем у животных, у которых было воспроизведено усиление костной резорбции. Выявлены изменения биохимических показателей метаболизма костной ткани, свидетельствующие о стимулирующем влиянии исследованных факторов на остеогенез и уменьшении морфологических признаков резорбции.
Впервые проанализированы изменения гормональных показателей, характеризующих состояние симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем в условиях низкоинтенсивного магнитного поля. Выявлено уменьшение реакции коры надпочечников на термическое воздействие под влиянием данного физического фактора.
Обнаружена слабовыраженная реакция коры надпочечников, не носящая характер стрессовой, на фоне активизации антиоксидантных систем в условиях комбинированного воздействия теплового фактора, постоянного магнитного поля и введения ГАП.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенной работы дополняют современные представления о реакции организма на низкоинтенсивные ПМП в условиях усиления костной резорбции.
Впервые произведено моделирование процесса усиления резорбции костной ткани у крыс с помощью воздействия повышенной температуры окружающей среды.
Разработан способ стимуляции остеогенеза с помощью действия ПМП низкой интенсивности, величина которого значительно ниже предельно допустимого уровня.
Установлено, что реакция организма на ПМП в условиях эктопического введения аллогенного ГАП и усиления костной резорбции имеет комплексный характер и включает физиологические изменения ряда систем: метаболизм костной ткани, функциональное состояние САС, ГТНС, перекисное окисление липидов в печени.
Получено экспериментальное обоснование эффективности применения комбинированного воздействия низкоинтенсивного ПМП и однократного введения аллогенного гидроксиапатита, полученного из костной ткани, состав которого близок к минеральному компоненту кости, для профилактики развития остеопороза. Установлено, что эктопическое введение ГАП не вызывает отрицательных сдвигов в состоянии исследованных показателей метаболизма костной ткани, перекисного окисления липидов, САС и ГГНС.
Основные положения, выносимые на защиту.
Воздействие повышенной температуры воздуха (70 С 10 минут) ежедневно в течение 2 недель вызывает усиление костной резорбции у крыс.
В результате ежедневного кратковременного воздействия низкоинтенсивного ПМП происходит ослабление морфологических признаков резорбции костной ткани, а также характерных для него изменений биохимических показателей метаболизма костной ткани и функционального состояния коры надпочечников.
Внутримышечное введение суспензии аллогенного гидроксиапатита вызывает уменьшение проявлений резорбции костной ткани и биохимических показателей метаболизма костной ткани.
Апробация работы. Апробация работы проведена на кафедрах биохимии и физиологии Самарского государственного университета. Материалы диссертации доложены на II всероссийском симпозиуме с международным участием по проблемам тканевых банков "Клинические и фундаментальные аспекты тка-
8 невой терапии. Теория и практика клеточных технологий" (Самара, 2004); на итоговых научных конференциях Самарского государственного университета и Самарского военно-медицинского института (Самара, 2004, 2005), а также на четвертом всемирном конгрессе по проблемам тканевых банков (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, получено положительное решение на выдачу патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов, результатов собственных исследований, анализа и обсуждения полученных данных, выводов, списка цитированной литературы и приложений. Работа содержит 30 рисунков и 11 приложений. Список литературы включает 191 источник, в том числе 68 зарубежных.
Эксперименты на животных выполнены на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Самарского государственного медицинского университета. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории за оказанную всестороннюю помощь в работе.
Морфо-функциональная характеристика костной ткани
Кость - это активно изменяющаяся и одновременно стабильная ткань в организме. В костной ткани выделяют два типа клеток с определенной морфологией, которые ее формируют и резорбируют: остеобласты и остеокласты. Эти клетки являются производными разных линий: остеокласты - производные ге-мопоэтических клеток, а остеобласты - мезенхимальных. Оба типа клеток интенсивно изучались в культурах. Был получен большой объем информации о происхождении, структуре, функциях, дифференцировке, регуляции и их реакции на влияние различных гормонов и факторов роста (Rodan G.A., Rodan S.B., 2005).
Для того, чтобы выполнять свои функции, костная ткань постоянно обновляется, т. е. ремоделируется. К факторам, которые изменяют обменные процессы в кости, относятся механические стимулы, например, иммобилизация, тренировки, похудение; гормональные изменения, например, дефицит половых гормонов, гиперсекреция тиреоидных гормонов, местные воспалительные процессы. Эти сигналы способны влиять на клетки костной ткани прямо или опосредованно, вызывая адаптивные или патологические изменения в кости (Dempster D.W., 1992; Martin T.J., Dempster D.W., 1998). Ремоделирование начинается с приема сигнала локальной группой клеток, скорее всего выстилающими клетками или остеоцитами, в результате чего стартует резорбция костной ткани остеокластами, которая продолжается 2-4 недели (Rodan G.A., Rodan S.B., 2005). Вслед за этим происходит образование кости остеобластами, для-щееся 3-4 месяца. Согласно теории Н.М. Frost (1994), ремоделирование скелета происходит разрозненно, в отдельных участках, где группы клеток последовательно удаляют и замещают часть внеклеточного матрикса. Эти группы клеток называются базисными многоклеточными единицами или костными ремодели-рующими единицами. В цикле костного ремоделирования выделяют следую 10 щие стадии: активация, резорбция, реверсия, формирование, покой. Во время активации поверхность кости переходит из состояния покоя, характеризующегося присутствием тонкого слоя выстилающих клеток, в другую фазу, когда циркулирующие мононуклеарные клетки гемопоэтического происхождения начинают образовывать скопления и сливаться друг с другом, формируя дифференцированные остеокласты (Tran Van Р. е.а., 1982). Условия, вызывающие активацию, до конца не исследованы.
За фазой активации следует резорбция, когда остеокласты растворяют минеральный компонент кости и разрушают органический матрикс, в результате чего в губчатой костной ткани образуются блюдцеобразные углубления, а в компактной костной ткани - конусовидные (Agerbaek М.О. е.а., 1991).
В конце фазы резорбции в лакунах резорбции появляются преостеобла-сты, что соответствует фазе реверсии - переходному периоду, в котором образование новой костной ткани сопряжено с резорбцией старой. Механизмы, лежащие в основе феномена сопряженности этих двух разнонаправленных процессов, остаются недостаточно изученными. Существует ряд предположений о том, что в фазе реверсии определенную роль играют локально вырабатываемые митогены остеобластов, таких, как инсулиноподобный фактор роста II и трансформирующий фактор роста b (Dempster D.W., 1992). Считается, что именно во время реверсии происходит образование цементирующей линии, которая соединит новую и старую кости.
Заключительной фазой в цикле ремоделирования является формирование костной ткани. Преостеобласты, находящиеся в лакуне реверсии, дифференцируются в продуцирующие коллаген остеобласты, которые начинают образовывать новую базисную структурную единицу, или остеон. Остеобласты синтезируют неминерализованный органический матрикс (остеоид). Спустя 25 дней в губчатой и 35 дней в кортикальной костной ткани остеоид начинает минерализоваться (Parfitt A.M., 1990). В губчатой костной ткани остеон имеет форму полумесяца, а в кортикальной кости он представляет собой цилиндр и носит название гаверсовой системы. Процесс ремоделирования наиболее активен у растущего организма, что отвечает потребностям данного периода жизни организма. С возрастом скорость костеобразования снижается, что, возможно, объясняется снижением синтеза и секреции гормонов, уменьшением числа клеток-предшественников остеобластов и снижением синтеза коллагеновых белков (Rodan G.A., Rodan S.B., 2005).
Как уже упоминалось ранее, в костной ткани выделяют два основных типа клеток: остеобласты и остеокласты. Зрелые остеобласты формируют плотный слой кубоидальных клеток, расположенных на крыше матрикса, который они сами и продуцируют. У них относительно большие овальные ядра с несколькими ядрышками, которые окрашиваются в синий цвет. Остеобласты четко поляризованы. Они скоординированно синтезируют и секретируют матрикс только на базальной стороне. Пласт продуцируемого остеоида значительно превосходит размеры одной клетки. Остеобласты образуют практически все компоненты костного матрикса, что и отличает их от фибробластов. Следует указать и на то, что остеобласты относятся к неделящимся клеткам с обратной связью между способностями к делению и к дифференциации. К концу продуктивного периода остеобласты становятся плоскими и превращаются в неактивные выстилающие клетки, покрывающие неминерализованный остеоид (Юрина Н.А., Радостина А.И., 1990). Постепенно остеобласты "замуровываются" в минерализованном костном матриксе и превращаются в звездообразные остеоци-ты, которые поддерживают связь с другими остеобластами путем образования отростков (отсюда и их название) и отвечают за остеоцитический остеолиз, формирование костной ткани и реакцию на механические стимулы. Однако точная функция этих клеток до конца неизвестна (Gehron R.P., 2005).
Другой тип клеток представляют остеокласты. Они являются функциональными антагонистами остеобластов и отвечают за резорбцию костной ткани. Остеокласты - многоядерные большие, до конца дифференцированные клетки, формирующиеся путем слияния мононуклеарных клеток гемопоэтического ряда. Уникальными признаками их ультраструктуры являются "щеточная каемка" или "гофрированный край" и чистая зона, отвечающие за выполнение остео-кластических функций. Процесс костной резорбции протекает именно под "гофрированным краем" в замкнутом пространстве. В этом месте рН составляет 3,5, величину кислотности среды, необходимую для растворения гидроксиапа-тита минерализованного костного матрикса. Оказывается, что на их поверхности находятся СГ, НС03"-каналы и Na+,K+, ЇҐ-АТФазьі, которые перекачивают ионы водорода, калия, натрия, карбонат-ионы и хлорид-ионы. Другим остео-кластным маркером является карбонангидраза II, которая также связана с резорбцией кости. В основном она находится на внутренней поверхности "гофрированного края" и способствует окислению через утилизацию ССЬ в ионы кислорода, которые в свою очередь с помощью гҐ"-АТФазьі поступают к месту резорбции (Heersche J.N., 1998).
Еще одним остеокластным маркером является тартрат-резистентная кислая фосфатаза, находящаяся на костной поверхности со стороны "гофрированного края". Этот фермент дефосфорилирует остеопонтин и костный сиалопротеин, белки, которые не могут длительное время обеспечивать прикрепление остеокластов. Понятно, что таким образом осуществляется цикл прикрепление-миграция остеокластов в костной ткани при ее ремоделировании.
Стоит отметить важный фенотипический маркер остеокластов - это наличие рецептора к кальцитонину, который снижает выход кальция из кости путем прямого воздействия на преостеокласты и остеокласты (Kameda Y. е.а., 1998). Так происходит регуляция количества и активности разрушающих костную ткань клеток.
Общая характеристика органического компонента и его роль в формировании костной ткани
Органические вещества кости составляют 30% от её веса. На минеральные компоненты приходится вдвое больше, приблизительно 60%; 10% приходится на долю воды. Органические вещества кости почти полностью состоят из коллагена - 95%, и только 5% составляют другие соединения, наиболее важными из них являются неколлагеновые белки, многие из которых обладают остео-индуктивными свойствами. Коллаген - это фибриллярный белок, представленный нитевидными структурами различных величин (Мазуров В.И., 1974; Хиль-кин A.M., Шехтер А.Б., 1976).
Аминокислотный состав коллагенов высокоспецифичен и резко отличается от аминокислотного состава других белков. Основная ячейка первичной структуры коллагена представлена трипептидом, состоящим из глицина, про-лина, оксипролина или оксшшзина (Мазуров В.И., Орехович В.Н., 1980; Мов-шович И.А., Виленский В.Я., 1978). Последние две аминокислоты составляют 23%, и их соотношение в разных типах коллагенов различно. Кроме того, в молекуле коллагена содержится небольшое количество тирозина, гистидина, ме-тионина и отсутствуют цистеин и триптофан. Около 1/3" общего содержания аминокислот коллагена кости приходится на глицин, который равномерно распределён вдоль молекулы белка (Попов Е.М., 1989).
То обстоятельство, что оксипролин включается в полипептидную цепь не в готовом виде, а образуется в ней путем гидроксилирования пролина, а также его относительно высокое содержание в коллагене и незначительное количество в других белках позволяют использовать эту аминокислоту в качестве одного из показателей метаболизма костной ткани в клинической биохимии (Слут-ский Л.И., 1969; Степанов В.М., 1992, 1996). Оксипролин, пролин и лизин выполняют важную функцию в формировании вторичной структуры коллагена (Орехович В.Н., 1966; Измайлова В.Н., Ребиндер П.А., 1974).
Вторичная структура коллагенов представляет ломанную левозакручен-ную и обладающую высокой прочностью спираль. Внутри це почечных водородных связей нет. Стабилизация достигается за счет межцепочечных кова-лентных связей, а также водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Три такие спирали, свитые в правильную суперспираль, и составляют субъединицу коллагена, которая называется тропо коллагеном. Спирали упорядочены таким образом, что свободные боковые группы глицина каждой пептидной цепи находятся внутри общей спирали, а требующие пространства кольца пролина, оксипролина и боковые группы других аминокислотных остатков выступают наружу (Поглазов Б.Ф., 1970; Попов Е.М., 1989; Якубке X., Ешкайт X., 1985). Водородные связи в молекуле коллагена имеют межспиральный характер. Тропоколлагены, составленные "голова к хвосту", образуют нити фибрилл.
Волокна коллагена состоят из параллельно расположенных фибрилл. Поверхность фибрилл покрыта глико протеидами и протеогликанами с целью защиты коллагенов от действия ферментов (Хьюз Р., 1985).
В настоящее время выявлено более 25 различных альфа-цепей, из которых формируется до 14 разных типов коллагена (Степанов В.М., 1992, 1996; Страйер Н., 1985; Шульц Г. и соавт., 1982). Часть из этих коллагеновых молекул являются тканеспецифичными.
В соответствии с составом коллагена выделяют ряд типов коллагена. В соединительной ткани в основном преобладает коллаген типа I. Он содержится в коже, костях, хрящах, сухожилиях, дентине. Его молекула [аі(1)Ь а.2 состоит из двух цепей щ (1) и одной цепи а2. Коллаген типа II выделили из хрящей человека, быка, цыплят. Коллаген типа III обнаружили в коже новорожденных людей, в аорте и коже. Часто он сопутствует коллагену типа I, за исключением костей и сухожилий. В нем есть дисульфидные связи, что обуславливает его низкую растворимость. Он отличается от коллагена типа I и II высокой степенью гидроксилирования пролина (до 60% против 47% коллагенов типов I и II) и наличием цистеина. Тип V коллагена образует тонкие фибриллы, которые располагаются вдоль коллагеновых волокон типов I и III в межклеточных пространствах гладких мышц. В хрящях встречается коллаген типа XI и имеет аналогичные связи с волокнами коллагена типа II. Все это фибриллярные белки (Слутский Л.И., Севастьянова Н.А., 1986; Gehron R.P., 2005).
К нефибриллярным типам коллагена относят IV, VI, VII, VIII. Коллаген типа IV выделили из различных типов базальных мембран, включая хрусталик человека. Он содержит цистеин и дисульфидные связи, как и коллаген типа III. Коллаген типа VI состоит из димеров и тетрамеров, которые формируют микрофибриллы, содержащиеся в больших количествах в интерстициальных тканях. Следующий тип коллагена отличается от коллагена типа I тем, что его тройные спирали в 1,5 раза длиннее и беспорядочно друг с другом соединены. С помощью образованных из него структурных компонентов базальные мембраны прикрепляются к подлежащей соединительной ткани. В культуре эндо телиальных клеток и десцеметовой оболочке глаза обнаружили тип VIII. Тройная спираль данного типа коллагена достаточно короткая и формирует гексагональную сетчатую структуру (Степанов В.М., 1996).
Другой структурой обладают коллагены типов IX, X и XIV. Их называют FACITs - Fibrils Associated Collagens with Intermited Triple helices - коллагены с прерывающимися тройными спиралями, связанные с фибриллами. Они содержат длинную "неколлагеновую" последовательность вблизи N-концевого отдела, что и придает ему гибкость. Структура коллагена типа XIII до сих пор не определена (Gehron R.P., 2005).
Коллагеновые спирали агрегируют в межклеточном пространстве. Между фибриллами существуют промежутки. Пептиды, обуславливающие поперечные связи, находятся в области перекрывания концов макромолекул, где поперечная связь может быть наиболее эффективной. СВ-пептиды, содержащие углеводные единицы, располагаются в области промежутков между молекулами (Хьюз Р., 1985). При агрегации происходит транспорт коллагена, причем его транспортная форма не агрегирует. Агрегация происходит только после того, как произойдет отщепление пептидных остатков с N-конца молекулы.
Коллаген минерализированных тканей имеет много общего с коллагенами мягких тканей: у них близкий аминокислотный состав. Идентичны и первичная структура, и строение цепей. Необычным может быть тот факт, что в костной ткани представлен коллаген только типа І. В нем содержится больше свободных аминогрупп лизиновых и оксилизиновых остатков. В молекуле коллагена кости присутствуют пептиды, богатые отрицательно заряженными аминокислотами и органический фосфор, чего нет в коллагенах мягких тканей. В отличие от других видов соединительной ткани в костном коллагене преобладают производные моносахаридов, а не дисахаридов. Очень важная особенность коллагена костной ткани - его молекулярная организация, характеризующаяся высокой степенью упорядоченностью молекулярных агрегатов благодаря прочным межмолекулярным связям (Gehron R.P., 2005).
Выявлены отличительные особенности коллагена кости, максимально приспособленные для выполнения функции минерализации. Аминогруппы лизина и оксилизина связывают фосфаты, принимая участие в процессе зарождения первичных кристаллов кости (Слутский Л.И., Севастьянова Н.А., 1986).
Объект исследований и условия постановки эксперимента
Исследования проведены на 212 белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 180-290 г. Все опытные животные были разделены на 6 основных групп, соответствующих следующим сериям экспериментов: 1. Моделирование усиления процесса костной резорбции у животных в лабораторных условиях с помощью повышенной температуры." 2. Изучение влияния ежедневного введения гидрокортизона различных концентраций на биохимические показатели метаболизма костной ткани. 3. Исследование влияния многократного воздействия ПМП различной продолжительности на показатели обмена костной ткани и на функциональное состояние коры и мозгового слоя надпочечников при нагреве. 4. Изучение состояния функции надпочечных желез, показателей обмена костной ткани и морфо-функционального состояния бедренной кости после ежедневного теплового воздействия, внутримышечных инъекций суспензии ал-логенного ГАП и различного по продолжительности воздействия ПМП. 5. Исследование обмена коллагена, уровня активности щелочной фосфа-тазы, содержания кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови, функционального состояния надпочечников при хроническом воздействии ПМП и многократном действии повышенной температуры. 6. Изучение функции надпочечных желез, показателей обмена костной ткани и морфо-функционального состояния бедренной кости после внутримышечных инъекций суспензии аллогенного ГАП, ежедневного теплового воздействия и хронического воздействия постоянного магнитного поля. Схема экспериментов представлена в таблице.
В качестве фактора, вызывающего развитие стресса и впоследствии ускорение процесса резорбции костной ткани, использовали воздействие горячего воздуха. В работе Писаревой Е.В. (2000) была разработана экспериментальная модель развития стресса у животных. Были исследованы различные варианты выраженнуто стрессовую реакцию вызывает воздействие горячего воздуха с температурой 70 С в течение 10 минут.
Температурному воздействию (70 С в течение 10 минут) крыс подвергали в течение двух недель. Воздействие горячим воздухом производили на оригинальной установке. Животных помещали в камеру из фанеры с крышкой из оргстекла размером 0,6 х 0,4 х 0,22 м. Одновременно там находилось 5-6 крыс. В полу камеры имелось большое количество мелких отверстий диаметром 5 мм, через которые подавался нагретый воздух от электрокалорифера. В верхней части камеры в стенках были сделаны несколько закрывающихся отверстий диаметром 20 мм для регуляции скорости прохождения воздуха. Температура регулировалась с помощью реле с контактным термометром, к которому был подключен источник тепла. Во всех частях камеры температура воздуха была одинаковая. Температуру в камере измеряли ртутным термометром.
Во второй серии экспериментов животным в мышцы ежедневно вводили растворы гидрокортизона нескольких концентраций: 1, 2, 5 и 10 мкг/кг массы тела в объеме ОД мл в течение двух недель.
В третьей серии экспериментов в течение первых 2 недель применяли ежедневное тепловое воздействие. В течение последующих 2 недель ежедневно животные подвергались действию ПМП различной продолжительностью: 30 минут, 60 минут и 3 часа. Общее время продолжительности эксперимента 4 недели.
Для изучения эффекта влияния ПМП на организм животных их содержали в камере из пермаллоя толщиной 1 мм (сваренной из полос шириной 170 мм, которые крепились к алюминиевому каркасу). Ширина, высота и длина камеры равны 0,5 м. Для обеспечения свободного газообмена сверху камера была открыта. Пермаллой обладает способностью экранировать слабые магнитные поля, т. е. значительно снижать их интенсивность. В данном случае существенным свойством данной камеры является экранирование магнитного поля Земли. Кроме этого камера была искусственно намагничена. В соответствии с поставленной задачей магнитное поле в ней было сильно искаженным и неравномер ным по величине и направлению. В результате дополнительного намагничивания индукция магнитного поля в разных частях экранирующей камеры варьировала от 0 до 100 мкТл. Градиент индукции составлял от 0 до 5 мкТл/см. Измерение индукции МП проводилось магнитометром одно компонентным типа МО.
В четвертой серии экспериментов изучали комбинированное влияние однократных инъекций суспензии ГАП, многократного действия ПМП продолжительностью 3 часа и повышенной температуры. ГАП получали из солянокислых растворов после деминерализации компактной костной ткани путем осаждения гидроокисью натрия при значениях рН 12 с добавлением фосфатного буфера (Na2HP04 + КН2Р04; 0,1 М; рН 7,4) (Волова Л.Т., Подковкин В.Г., 2001). Осажденный ГАП высушивали (20 часов 150 С). Полученный препарат содержал Са2+, Mg2+, РО3", Fe3+ в соотношениях, близких к составу минерального компонента кости. Путем качественного анализа выявлено наличие ионов Zn2+, Cu2+, Mn2t, F" (Власов М.Ю., 2003). Суспензии стерильного ГАП в изотоническом растворе хлорида натрия (40 мг/0,2 мл) однократно вводили с помощью одноразового шприца в бедренные мышцы крыс. В течение первых двух недель эксперимента животных подвергали ежедневному воздействию повышенной температуры. Затем вводили суспензии аллогенного ГАП и в течение последующих двух недель каждый день крыс помещали в камеру из пермаллоя на 3 часа. Одну группу животных (ГАП и ПМП 3 часа) подвергали температурному воздействию на протяжении всего эксперимента. Продолжительность эксперимента составила 4 недели.
В пятой серии экспериментов исследовали двухнедельное хроническое влияние ПМП при ежедневном действии повышенной температуры на обменные процессы соединительной ткани крыс.
В шестой серии изучали комбинированное влияние физических факторов, примененных в предыдущей серии эксперимента, и однократных инъекций ГАП на выбранные нами биохимические показатели. Все животные содержались в одинаковых условиях вивария на сбалансированном по жирам, углеводам, белкам и минеральным веществам питании при комнатной температуре. Каждая экспериментальная серия содержала контрольную группу животных, которые не подвергались описанным выше воздействиям.
Отработка экспериментальной модели усиления костной резорбции с использованием теплового воздействия
Из литературы (Писарева Е.В., 2000; Нестеров Ю.В., 2003) известно, что многократное воздействие горячего воздуха приводит к развитию стойкой стрессовой реакции у крыс, что в свою очередь вызывает резкое повышение уровня глюкокортикоидов в плазме крови и надпочечниках. Указанные гормоны оказываютсерьезное влияние на-организм вцелом и на соединительную ткань в частности. Стрессовые воздействия способны снижать скорость синтеза коллагена при усилении его деструкции, вызывать активный выход минеральных веществ из кости, изменять соотношение функций клеток остеобластиче-ского ряда. Поэтому во второй серии экспериментов нами была поставлена задача по выяснению картины реакции организма со стороны соединительной ткани и неироэндокринных систем на постоянное тепловое воздействие, как на один из факторов усиления резорбции. Поэтому в качестве исследуемых показателей были выбраны те же критерии, что и в первой серии экспериментов: содержание свободного и белковосвязанного оксинролина как маркера метаболизма коллагена; концентрация неорганического фосфата и кальция, активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови, показатели минерального обмена; уровень 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крови и адреналина - в надпочечниках как показатели состояния ГГНС; в печени — содержание МДА, активность каталазы, аланинаминотрансферазы и супероксид-дисмутазы.
Эксперимент был проведен на 18 половозрелых крысах-самцах. Животные помещались в камеру с температурой воздуха 70 "С на 10 минут ежедневно в течение 2 недель.
При продолжительном неблагоприятном воздействии в организме начинаются деструктивные процессы, которые затрагивают все его структурные части. В частности, в костной ткани появляются первые признаки усилении ее резорбции, что выражается в снижении плотности костей и содержания минеральных веществ в них, нарушении биосиптетических процессов.
Реакция организма на ежедневное тепловое воздействие со стороны минерального обмена не была выражена. Это проявилось в отсутствии изменений содержания кальция и неорганического фосфата в крови экспериментальных животных. Достоверных изменений ферментативной активности ЩФ выявить не удалось. Перечисленные критерии обмена минеральных веществ тесно связаны между собой. Между содержанием кальция и неорганического фосфата существует обратная зависимость. Известно также, что ионы кальция играют роль одного из самых важных вторичных посредников в разнообразных реакциях организма. Ионы кальция выходят из различных депо, в том числе и из костей. При длительном влиянии сильного раздражителя начинают развиваться патологические изменения костной ткани.
О развитии стрессовой реакции у животных, подвергавшихся многократному тепловому воздействию, говорит увеличение содержания кортикостерои-дов в надпочечниках, однако в плазме крови уровень гормонов снизился по сравнению с контролем (Рис. 2, Приложение 1). В печени при этом наблюдалось снижение активности АлАТ на 48,85 % относительно контрольного значения. Параллельно с этим не было отмечено изменений показателя относительной массы железы при воздействии горячего воздуха.
Как известно из литературы (Писарева Е.В., 2000), тепловое воздействие вызывает нарушение гомеостаза. В случае гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, как уже было отмечено ранее, наблюдалось повы 49 шение уровня кортикостероидов в коре надпочечников при снижении данного показателя в плазме крови. В отношении состояния симпатоадреналовой системы не выявлено существенных отклонений содержания адреналина в надпочечнике, которое может быть результатом развития долговременной адаптации при многократном воздействии горячего воздуха.
Так у животных, подвергнутых воздействию горячего воздуха, по сравнению с животными, не подвергавшихся влиянию указанного физического фактора, в кортикальном слое подвздошной кости наблюдалось расширение гавер совых каналов за счет рассасывания их костных стенок. Видны многочисленные остеокласты. Костные балки спонгиозы истончались, некоторые из них рассасывались. У большинства животных опытной группы кортикальный слой в значительной степени утрачивал компактное строение, приобретая структуру, до некоторой степени сходную со спонгиозной.
Примечания: видно нарушение целостности костных балок (а); неровные контуры балок, наличие узур, и остеокластическая реакция (Ь); отсутствие остеоцитов (с); лизис костной ткани (d). Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение: 10x40.
Полученные результаты морфологического исследования подтверждают изменения биохимических показателей, свидетельствующие об усилении костной резорбции у животных, подвергавшихся воздействию горячего воздуха. Поэтому в последующих сериях экспериментов нами использована данная модель, как наиболее удачная и подходящая для решения поставленных нами задач.
Нами была поставлена задача проанализировать влияние глюкокортикоидов на развитие резорбции костной ткани и сопровождающие ее метаболические процессы у крыс в лабораторных условиях. Как известно из литературы (Насонов Е.Л., 2003), длительное применение глюкокортикоидов при лечении некоторых заболеваний приводит к развитию патологических процессов в соединительной ткани и, в частности,-в костной ткани; Происходит угнетение деятельности остеобластов и активизация остеокластов, что усиливает разрушение кости. В качестве воздействий, приводящих к ускорению костной резорбции, использовали инъекции гормонального препарата гидрокортизона различных концентраций. В наших исследованиях уделялось внимание изучению ряда биохимических показателей, связанных с функционированием соединительной ткани и работой 11 НС таких, как содержание кальция и неорганического фосфора в крови, свободного и белковосвязанного оксипролина в плазме, 11-оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крыс, активность щелочной фосфатазы, концентрация адреналина в надпочечниках. Дополнительно измеряли массу надпочечников и тела и вычисляли относительную массу гормональных желез. В печени определяли содержание малонового диальдегида, активность каталазы, супероксиддисмутазы и аланинаминотрансферазы.
Серьезных доказательств усиления резорбции на примере оксипролина не было выявлено. Тогда, как на морфологическом уровне получены четкие доказательства развития патологических изменений костной ткани.
