Введение к работе
Актуальность темы
Проблема борьбы с гиперлипидемией в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость в связи с тем, что в последние годы увеличивается количество больных с повышенным уровнем холестерина в крови. В исследовании INTERHEART было продемонстрировано, что 45 % сердечно-сосудистых событий с тромбозами у жителей Западной Европы были связаны с различными проявлениями гиперлипидемий. Гиперлипидемии (гиперлипопротеинемии) являются одним из основных факторов риска развития атеросклероза, атеротромбоза и других сосудистых патологий.
Гиперлипопротеинемии представляют собой нарушения транспорта липидов, обусловленные ускоренным синтезом или замедленным разрушением липопротеинов, переносящих холестерин и триглицериды в плазме крови. Одни гиперлипопротеинемии обусловливаются непосредственно первичным нарушением процессов синтеза и разрушения липопротеиновых частиц. Другие развиваются вторично, т.е. повышение уровня липопротеинов в плазме служит одним из проявлений аномалий, связанных с нарушением регуляторных метаболических систем, например с недостаточностью тиреоидных гормонов или инсулина (Craber R., et al., 1994).
Гиперлипидемии приводят к появлению симптомов сердечно-сосудистых заболеваний (коронарной болезни сердца, заболеваниям периферических артерий). Высокое содержание триглицеридов (> 11,3 ммоль/л) может вызывать симптомы острого панкреатита. Высокие показатели липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) приводят к появлению ксантом (подкожные отложения холестерина) и ксантелазм (небольшие образования бледно-желтого цвета в области верхнего века, обусловленные отложением в них липидов) (Judith R. et al., 1990).
В качестве основной терапии обычно назначают статины в связи с их достаточно высокой эффективностью. Гипохолестеринемическое действие статинов основано на их способности конкурентно ингибировать активность гидроксиметил-глутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы), которая принимает важное участие в синтезе эндогенного холестерина. Это приводит к компенсаторной экспрессии гепатоцитами повышенного числа рецепторов ЛПНП, что увеличивает клиренс ЛПНП из плазмы. Но при этом статины обладают рядом нежелательных побочных эффектов.
Нарушения липидного обмена часто сопровождаются нарушениями работы системы гемостаза и приводят к повышенной свёртываемости крови. Одной из важных задач физиологии и медицины является разработка новых нетоксичных препаратов пептидной природы, способных положительно влиять как на систему гемостаза, так и на липидный обмен. В институте молекулярной генетики был получен пептид пролил-глицил-пролин (PGP) в 2 модификациях: с лейцином (L) на N-конце и на С-конце.
Цель настоящего исследования изучение влияния пептидов PGPL и LPGP на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина, фибринолитическую активность и липидный профиль в плазме крови в норме и в условиях гиперхолестеринемии.
Задачи исследования:
1. В условиях in vitro на крысиной плазме установить действие обоих пептидов и лейцина на процессы свёртывания крови и фибринолиз;
-
Изучить влияние PGPL и LPGP на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина в условиях in vitro;
-
Исследовать влияние каждого из пептидов на показатели свёртывающей и противосвёртывающей систем в условиях in vivo при внутривенном и интраназальном введении здоровым животным;
4. Продемонстрировать одновременное действие каждого из пептидов на жировой обмен и свёртывание крови в организме крыс с гиперхолестеринемией при их хроническом интраназальном введении;
5. Показать эффект каждого из пептидов на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина и на липидный профиль в условиях ex vivo у людей с гиперхолестеринемией;
-
Провести сравнительный анализ гиполипидемического и фибриндеполимеризационного действия PGPL и LPGP в организме.
Научная новизна исследования: Впервые нами было исследовано сочетанное действие пептидов на липидный обмен, гемостаз и фибринолиз и выявлены различия в степени выраженности эффектов глипролинов, включающих лейцин на С- и N-концах. В экспериментах на животных и на плазме крови людей изучены эффекты этих регуляторных пептидов на параметры гемостаза и липидный обмен: антикоагулянтные, фибринолитические, фибриндеполимеризационные и гиполипидемические.
Впервые установлен факт ингибирования процесса полимеризации фибрина в присутствии исследуемых пептидов в плазме крови людей спектрофотометрическим методом, вследствие чего уменьшалась скорость образования сгустка по сравнению с контролем.
Впервые в экспериментах на животных показано, что пептид PGPL оказывает более значительный фибриндеполимеризационный эффект, чем LPGP. В то же время LPGP проявляет гиполипидемический эффект в большей степени, чем PGPL.
Впервые выявлено на плазме крови людей, что оба пептида вызывают гиполипидемический и фибриндеполимеризационный эффекты.
Теоретическая и практическая значимость работы:
В эксперименте определена физиологическая роль глипролинов, содержащих лейцин с N- и С-концов, и показано их участие в регуляции жидкого состояния крови и липидного обмена в организме. Результаты работы дополняют представление о механизмах антикоагулянтно-фибринолитического и гиполипидемического действия глипролинов.
Результаты работы позволяют предложить пептиды PGPL и LPGP в качестве перспективных антитромботических и гиполипидемических средств направленного действия в условиях гиперхолестеринемии.
Разработан способ определения полимеризации и деполимеризации фибрина, основанный на применении спектрофотометрического анализа.
Апробация работы: Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (11 сентября 2013 г.). Отдельные фрагменты работы доложены на XVIII международной научной конференции Ломоносов-2011, конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (2010 г.), конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (2011 г.).
Объём и структура работы: Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы (86 отечественных и 58 иностранных источников), иллюстрирована 7 таблицами и 27 рисунками.
Материалы и методы
В работе применялись препараты пептидов PGPL и LPGP, синтезированные в институте молекулярной генетики РАН.
Исследования in vitro были проведены с плазмой крови животных и ex vivo с плазмой крови человека. Нами использовались экспериментальные модели гиперхолестеринемии, основанной на методе Вильграмма в нашей модификации, и тромбообразования, основанной на методе Весслера с нашей модификацией, которые были разработаны в нашей лаборатории. Наряду с этим проводились совместно с Центром неврологии РАН исследования действия PGPL и LPGP на крови пациентов с повышенным уровнем холестерина.
В работе использовались стандартные коагулологические методы анализа (тромботест, активированное частичное тромбопластиновое время – АЧТВ, суммарная фибринолитическая активность – СФА, неферментативный фибринолиз – НФ, ферментативная фибринолитическая активность – ФФ, активность тканевого активатора плазминогена – ААП), спектрофотометрическое определение процессов полимеризации и деполимеризации фибрина, основанное на турбидиметрическом анализе, предложенном Щербак и др., c нашей модификацией, а также определение уровня холестерина и липидного профиля (триглицериды, ЛПНП, липопротеины высокой плотности – ЛПВП) плазмы крови по стандартной методике с реагентами фирмы Ольвекс Диагностикум.
Оценку динамики полимеризации и деполимеризации фибрина проводили спектрофотометрическим методом. В эксперименте свёртывание плазмы инициировали добавлением 0,1 мл рабочего раствора тромбина (2 NIH ед./мл) к 0,1 мл плазмы, инкубированной с пептидами и разведённой в 0,8 мл боратного буфера pH 7,2. Прохождение полимеризации регистрировали сразу после добавления тромбина на протяжении 10 минут по увеличению оптической плотности среды при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см, термостатируемой при 37 С. Деполимеризацию ускоряли добавлением раствора монохлоруксусной кислоты (МХУ) в конечной концентрации 2%. Определяли следующие показатели: tg (скорость возрастания оптической плотности), tg (скорость снижения оптической плотности), Dполим (изменение оптической плотности сгустка при полимеризации), Dдеполим (изменение оптической плотности сгустка при деполимеризации).
В условиях in vitro пептиды добавлялись к плазме крови в концентрациях от 10-1 до 10-10 М. In vivo препараты пептидов в дозе 1 мг/кг вводились внутривенно и интраназально. Гиперхолестеринемию вызывали специальной диетой с повышенным содержанием насыщенных (пальмитиновой, стеариновой), а также гидрогенизированных жирных кислот, глюкозы и холестерина с необходимым количеством витаминов и микроэлементов с добавлением желчегонных средств.
В условиях ex vivo на крови людей исследования проводились следующим образом: к плазме крови добавлялись пептиды в концентрации 10-3 М и инкубировались в течение не менее 10 мин при 37 С. Далее проводилось исследование процессов поли- и деполимеризации, параметров гемостаза, уровня общего холестерина и липидного профиля до и после добавления пептидов на одной и той же плазме.
В работе было использовано 114 крыс. Всего было проведено 8 серий экспериментов в условиях in vitro, in vivo и ex vivo.
Статистическая обработка осуществлялась по методу Стьюдента и критерию Вилкоксона.
