Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Современные представления о боли 13
2.1.1. Механизмы восприятия и формирования боли 15
2.1.2. Компоненты ноцицептивной реакции 18
2.2. Иммунные процессы в реализации ноцицептивного ответа 21
2.2.1. Взаимосвязь иммунных и ноцицептивных реакций 21
2.2.2. Цитокины и ноцицепция 24
2.3. Биологическая роль липополисахаридов 32
2.3.1. Общие сведения о липополисахаридах 32
2.3.2. Механизмы действия липополисахаридов 34
2.3.3. Липополисахариды и ноцицепция 42
3. Материалы и методы исследования 48
3.1. Условия содержания крыс 48
3.2. Определение показателей ноцицептивных реакций у крыс 48
3.2.1. Анализ перцептуального компонента ноцицепции 48
3.2.2. Анализ эмоционального компонента ноцицепции 49
3.3. Исследование цитокинового профиля периферической крови и тканей головного мозга крыс 50
3.3.1. Определение содержания цитокинов в сыворотке крови крыс 50
3.3.2. Определение содержания цитокинов в ткани структур мозга крыс 51
3.4. Схема экспериментов 51
3.4.1. Экспериментальная серия I 52
3.4.2. Экспериментальная серия II 54
3.5. Статистическая обработка данных 55
4. Результаты исследования 56
4.1. Цитокиновый профиль сыворотки крови у крыс
при внутрибрюшинном введении липополисахарида 57
4.2. Цитокиновый профиль ткани головного мозга у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида 61
4.2.1. Содержание цитокинов в дорсальном гиппокампе крыс после внутрибрюшинного введения липополисахарида 63
4.2.2. Содержание цитокинов в передней поясной коре головного мозга крыс после внутрибрюшинного введения липополисахарида 66
4.3. Ноцицептивная чувствительность у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида 72
4.4. Корреляционный анализ иммунологических и ноцицептивных показателей у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида 79
4.4.1. Корреляционный анализ ноцицептивных порогов и содержания цитокинов в сыворотке крови крыс 80
4.4.2. Корреляционный анализ ноцицептивных порогов и содержания цитокинов в структурах головного мозга крыс 82
4.5. Ноцицептивная чувствительность у крыс при введении липополисахарида в структуры головного мозга 88
5. Обсуждение результатов 96
6. Выводы 116
7. Список литературы
- Компоненты ноцицептивной реакции
- Анализ перцептуального компонента ноцицепции
- Цитокиновый профиль ткани головного мозга у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида
- Корреляционный анализ иммунологических и ноцицептивных показателей у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида
Введение к работе
Актуальность исследования
Ноцицепция – нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и центральную обработку сигналов о вредоносных процессах и воздействиях. Термин «ноцицепция», введенный в 1900 году Ч.С. Шеррингтоном, применяют в экспериментальных исследованиях на животных с целью четкой дифференцировки между физиологическими процессами, связанными с воздействием болевого раздражителя, и психологической реакцией на боль.
Выделяют следующие пять основных компонентов ноцицептивной реакции млекопитающих: перцептуальный, эмоционально-аффективный, вегетативный, двигательный и когнитивный [Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л., 2011]. Недавно описан иммунный компонент ноцицептивного ответа [Никенина Е.В., 2010], исследование которого - относительно новый подход к изучению боли.
В настоящее время накоплены данные, свидетельствующие о роли иммунологических механизмов в развитии болевых синдромов [Wiertelak E. et al., 1994; Yezierski R., 2001; Widerstrom-Noga E.G. et al., 2009; Rekand T. et al., 2012; Kukkar A. et al., 2013]. Однако имеются лишь отдельные сведения, указывающие на взаимосвязь между иммунным статусом и ноцицепцией у млекопитающих [Василенко А.М., 1995; Абрамов Ю.Б. и др., 2005].
Особое внимание в изучении роли нейроиммунных взаимодействий в механизмах формирования боли уделяется корковым и лимбическим структурам ЦНС, в частности дорсальному гиппокампу и поясной области мозга. Дорсальный гиппокамп вовлечен преимущественно в реализацию эмоционально-аффективного компонента боли [Liu M.G., Chen J., 2009]. Факт участия поясной коры и поясного пучка головного мозга в формировании ноцицептивного ответа у млекопитающих получил подтверждение в работах российских и зарубежных исследователей [Никенина Е.В. и др., 2006, 2010; Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Johansen J.P. et al., 2001]. При этом существенно, что как гиппокамп [Магаева С.В., Морозов С.Г., 2005; Геворкян М.М. и др., 2010; Devi R.S. et al., 2004], так и поясная область мозга [Абрамов Ю.Б. и др., 2009; Abramov Y.B. et al., 2003] занимают важное место в модуляции иммунных реакций. Однако в целом роль функционального сопряжения нервных и иммунных процессов в системных ноцицептивных реакциях у млекопитающих остается неясной.
В плане изучения участия иммунных факторов в регуляции болевой чувствительности отдельного внимания заслуживают цитокины – медиаторы межклеточного взаимодействия, участвующие в формировании защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в координации ряда нормальных физиологических функций [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008]. Одной из широко распространенных является классификация цитокинов, предполагающая их рассмотрение в зависимости от доминирующего биологического действия [Фрейдлин И.С., 1998]. В соответствии с данной классификацией, цитокины подразделяются на провоспалительные (интерлейкин-1 [ИЛ-1], ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, фактор некроза опухолей-альфа [ФНО-a], интерферон-альфа [ИФН-a], ИФН-g и др.) и противовоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, трансформирующий фактор роста-бета). Определение соотношения указанных цитокинов – так называемого, цитокинового баланса, позволяет объективно оценить степень отклонений функциональной активности иммунной системы при различных воздействиях на иммунный статус у млекопитающих [Еричев В.П. и др., 2009].
Цитокины рассматриваются в качестве сигнальных молекул, информирующих мозг о состоянии – активации или подавлении – иммунных процессов на периферии. Продукция цитокинов является частью клеточного ответа, связанного с распознаванием иммунокомпетентными клетками сходных структурных компонентов различных патогенов – патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [Medzhitov R., Janeway C., 1997]. Такими структурами являются, например, липополисахариды грамотрицательных бактерий. Существуют немногочисленные данные, иллюстрирующие взаимосвязь между болевой чувствительностью и уровнем цитокинов в биологических тканях млекопитающих. По мнению Ю.Б. Абрамова (2009), цитокины вовлекаются в регуляцию ноцицептивных реакций, обеспечивая взаимодействие глиальных клеток и нейронов. Однако в целом роль цитокинов в супраспинальных механизмах реализации ноцицептивного ответа изучена недостаточно.
В экспериментальных исследованиях для изучения механизмов формирования и регуляции иммунных реакций широко применяются липополисахариды (ЛПС) – естественные стимуляторы иммунных процессов. ЛПС относятся к классу бактериальных антигенов, запускающих каскад иммунных реакций в ЦНС и периферических тканях, в том числе, высвобождение цитокинов [Basta-Kaim A. et al., 2012]. В современной научной литературе имеются указания о характере и механизмах влияния ЛПС на болевую чувствительность млекопитающих [Wadachi R., Hargreaves K., 2006; Cao L. et al., 2009; Seo J.W. et al., 2012]. Модулирующее воздействие ЛПС на ноцицептивные реакции позволяет использовать введение этого антигена как оптимальную модель для экспериментального изучения механизмов ноцицепции [Watkins L. et al., 1994; Colheo A. et al., 2000].
Несмотря на большое число исследований, посвященных анализу физиологических и патофизиологических механизмов боли, многие вопросы в этой области остаются нерешенными. Сведения о роли иммуноактивных веществ, в том числе цитокинов, в формировании и реализации различных компонентов ноцицептивных реакций у млекопитающих немногочисленны и противоречивы. Требуют дальнейшего изучения центрально-периферические механизмы вовлечения иммунных факторов в системную организацию физиологических функций на разных стадиях болевого ответа. В литературе практически отсутствуют данные о роли различных структур головного мозга в реализации взаимодействия между нервными и иммунными процессами, лежащими в основе формирования и регуляции ноцицептивных реакций. Данная работа направлена на решение этих вопросов.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение участия иммунных процессов в формировании различных компонентов ноцицептивных реакций у крыс при периферическом и центральном введении липополисахарида.
В соответствии с поставленной целью, конкретными задачами работы были:
-
изучить изменения эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;
-
определить содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в периферической крови крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;
-
измерить концентрацию цитокинов в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга у крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;
-
выявить взаимосвязь между ноцицептивными показателями и уровнем цитокинов в периферической крови и тканях структур головного мозга крыс в разные временные периоды после внутрибрюшинного введения липополисахарида;
-
установить возможные особенности участия дорсального гиппокампа и поясной области головного мозга крыс в реализации эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций при внутримозговом введении липополисахарида.
Научная новизна работы
В работе впервые показано, что внутрибрюшинное введение крысам липополисахарида приводит к специфическим изменениям ноцицептивной чувствительности животных в разные временные периоды исследования. Обнаружено, что в 1-е сутки после антигенной стимуляции происходит усиление только перцептуального, а на 7-е сутки - как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции животных.
Установлено, что повышение ноцицептивной чувствительности крыс при воздействии липополисахарида сопровождается разнонаправленными изменениями уровня цитокинов в крови и тканях головного мозга. В отличие от наблюдающегося в этих условиях уменьшения концентрации провоспалительных (ИЛ-1a, ИЛ-1b, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-g и ФНО-a) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) в периферической крови животных, антигенная стимуляция приводит к увеличению содержания ИЛ-4 и ИЛ-10 в тканях дорсального гиппокампа и поясной области мозга. Показано, что формирование у крыс отрицательных корреляционных связей между ноцицептивными и иммунными показателями соответствует позднему периоду после введения липополисахарида.
Выявлено, что внутримозговое введение крысам липополисахарида не оказывает значимого влияния на перцептуальный компонент ноцицептивных реакций, но сопровождается выраженными изменениями эмоционального компонента ноцицепции животных на 7-е сутки исследования. Обнаружено, что микроинъекция указанного антигена в дорсальный гиппокамп приводит к подавлению, а в поясную область мозга – усилению эмоционального компонента ноцицепции у крыс.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в ходе исследования результаты могут быть использованы как в научно-исследовательской работе, так и в клинической практике. Теоретическое значение работы определяется расширением знаний о роли иммунных факторов в центральных и периферических механизмах формирования и реализации ноцицептивных реакций у млекопитающих. Представлены новые доказательства того, что изменения ноцицептивной чувствительности животных при введении липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими в частности от характера системного иммунного ответа при антигенном воздействии.
Результаты комплексного анализа ноцицептивных и биохимических показателей у экспериментальных животных при антигенной стимуляции могут быть использованы в клинической практике при разработке новых схем терапии болевого синдрома у больных с нарушениями иммунного статуса. Полученные данные перспективны для разработки лекарственных средств на основе иммуномодуляторов, направленных на устранение болей неясной этиологии при ряде хронических заболеваний. Материалы исследования целесообразно использовать в курсе преподавания нормальной и патологической физиологии, неврологии и иммунологии.
Положения, выносимые на защиту
-
Воздействие на иммунный статус крыс при введении липополисахарида приводит к изменению ноцицептивной чувствительности животных в разные временные периоды исследования.
-
Направленность изменений эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс различается в условиях периферического и центрального введения липополисахарида.
-
Изменения ноцицептивной чувствительности крыс в условиях введения липополисахарида опосредованы специфическими механизмами, зависящими, в частности, от характера иммунных процессов в тканях головного мозга и периферической крови при антигенном воздействии.
Апробация работы
Результаты исследования доложены и обсуждены на научных мероприятиях: II International Symposium "Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease" (Saint Petersburg, Russia, 2009); XII Школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2009); I Конференция молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2009); XXI Съезд физиологического общества им. Павлова (Калуга, 2010); VI Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2010); Первая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Сафага, Египет, 2010); VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011); III Съезд физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011); Вторая Международная междисциплинарная конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Бодрум, Турция, 2012); Международный симпозиум по проблемам боли «Подходы к пониманию механизмов и лечению симптомов боли» (Санкт-Петербург, 2012); III Конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2012); конференциях Отдела социальной физиологии НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2009-2013).
Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 7 статьях и 17 тезисах.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 15 таблиц. Библиографический указатель содержит 188 источников, из них 46 на русском и 142 на иностранных языках.
Компоненты ноцицептивной реакции
Несмотря на значительные успехи современной медицины в области изучения боли, наиболее частой причиной обращения больных за медицинской помощью, в том числе требующей проведения обезболивания, остается болевой синдром. Среди 14,5 млн. экстренных обращений умеренный болевой синдром был выявлен у двух миллионов пациентов (14% случаев), выраженный – у 2,9 миллионов (20%) [McLean S. et al., 2002]. По данным Национального научно-практического общества скорой медицинской помощи, в России количество пациентов, обращающихся за неотложной медицинской помощью с жалобами на боль различного генеза, за последние годы возросло на 25%. В соответствии с результатами статистического анализа, выполненного Международной ассоциацией по изучению боли (IASP, 2011), около 70% жалоб при обращении пациентов в службу неотложной помощи приходится на острую боль.
За многовековую историю изучения боли разные исследователи давали различные определения боли. Эти формулировки, так или иначе, охватывали разные аспекты и проявления болевого синдрома. Древние греки называли боль «сторожевым псом здоровья», акцентируя, таким образом, внимание на положительной защитной функции боли. В свою очередь, «негативное» определение боли дал Н. Кассиль (1975): «Боль – неприятное, гнетущее, иногда нестерпимое ощущение, возникающее преимущественно при сверхсильных или разрушительных воздействиях на организм человека и животных». П.К. Анохин рассматривал боль как «своеобразное психическое состояние человека, определяющееся совокупностью физиологических процессов в центральной нервной системе, вызванных к жизни каким-либо сверхсильным или разрушительным раздражителем» (В кн. «Очерки по физиологии функциональных систем», 1975). К.В. Судаков (2010) дал следующее определение боли: «С позиции теории функциональных систем боль является интегративной функцией организма, которая мобилизует организм и его разнообразные функциональные системы на защиту от воздействующих вредящих факторов и включает такие компоненты, как сознание, память, мотивации, вегетативные, соматические, поведенческие реакции, эмоции». По мнению Л.В. Калюжного (1984), «боль, как интегративная функция организма, является отрицательной биологической потребностью, ответственной за формирование функциональной системы по сохранению гомеостаза».
Международная ассоциация по изучению боли (IASP) в 1994 году обобщила имеющиеся определения боли: «Боль – это неприятное ощущение и эмоциональное переживание, возникающее в связи с настоящей или потенциальной угрозой повреждения тканей или изображаемой терминами такого повреждения». Таким образом, боль в современной алгологии рассматривается как многокомпонентная интегративная реакция организма на повреждение или представление такого повреждения.
В настоящее время существуют различные классификации боли, в зависимости от патогенетических, этиологических, временных, клинических и других признаков. По наличию или отсутствию повреждающего фактора выделяют боль физическую и психогенную [Дегтярев В.П., Раевская О.С., 2011]. Психогенная боль возникает без видимой связи с каким-либо повреждением и часто является следствием депрессивного состояния. Физическую боль по происхождению подразделяют на соматогенную, возникающую вследствие активации ноцицепторов при травме, воспалении, ишемии или растяжении тканей [Кукушкин М.Л., Хитров Н.К., 2004], и нейрогенную, связанную с нарушением функций периферической и центральной нервных систем. По временным параметрам выделяют острую и хроническую боль. Острая боль – это новая, «недавняя» боль, которая неразрывно связана с вызвавшим её повреждением и, как правило, является симптомом какого-либо заболевания. Такая боль исчезает при устранении повреждающего фактора. Острую боль, в свою очередь, делят на эпикритическую – «быструю», локализованную, физиологическую, а также протопатическую – «медленную», с непостоянной интенсивностью, плохо локализованную. Хроническая боль часто приобретает статус самостоятельной болезни, продолжается в течение длительного периода времени; причина, вызвавшая боль такого вида, в ряде случаев может не определяться [Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л., 2011]. В нейрофизиологической классификации боль принято подразделять на ноцицептивную (в результате повреждения структур, чувствительных к боли) и неноцицептивную (нейропатическую и психогенную). Ноцицептивная боль бывает соматической и висцеральной, а нейропатическая – центральной и периферической [Smith H.S., 2002].
Приведенные выше классификации боли иллюстрирует многообразие различных болевых аспектов и свидетельствует о «единстве анатомического, физиологического, психологического и социального компонентов, каждый из которых в свою очередь состоит из целого ряда составляющих» [Дегтярев В.П., Раевская О.С., 2011].
Анализ перцептуального компонента ноцицепции
В предыдущих разделах нами были рассмотрены периферические и центральные механизмы, лежащие в основе биологической активности ЛПС. При анализе участия ЛПС как фактора, вызывающего системный иммунный ответ организма, в формировании и реализации ноцицептивных реакций, необходимо охарактеризовать роль глиальной ткани в механизмах боли.
В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что ноцицептивные реакции у животных, как и боль у человека, обусловлены не только деятельностью нейронов мозга. В 90-х годах XX века глия привлекла внимание исследователей в связи с участием этой ткани в ноцицептивных реакциях. Были получены доказательства того, что некоторые препараты, блокирующие нейропатическую боль, также снижают степень глиальной активации [Garrison C.G. et al, 1991]. Сейчас известно, что микроглия и астроциты по своему количественному составу существенно превосходят число нервных клеток. Они относятся к разряду иммунокомпетентных клеток и, одновременно, являются мощными модуляторами боли, особенно, нейропатической. Глия – это единственный и полноценный представитель иммунной системы в мозге. Посредством сложных взаимодействий между различными нейроиммунными процессами, глия вносит вклад в регуляцию ноцицептивных возбуждений. Подробный анализ научных данных по этой проблеме представлен в одной из обзорных работ Ю.Б. Абрамова (2009).
Глиальные клетки способны «поддерживать» боль даже тогда, когда исходный очаг повреждения уже отсутствует. Эти клетки за счет длительной устойчивой активации, сопровождающейся выделением провоспалительных интерлейкинов, облегчают синаптическую передачу в нейронах. Именно поэтому для подавления болей такого рода было предложено использовать терапию, направленную на увеличение экспрессии генов противовоспалительных цитокинов [Jo H.J. et al., 2011].
Общеизвестно, что прогрессирование воспалительных и инфекционных процессов в периферических тканях может приводить к активации глиальных клеток ЦНС. Усиленное выделение указанными клетками физиологически активных веществ в этих условиях способствует возникновению симптомов гипералгезии. Важная роль в развитии перечисленных изменений отводится иммуномодулирующим веществам, в частности цитокинам. В исследованиях L.Watkins с соавт. (1996) было обнаружено, что введение экспериментальным животным ингибитора глиальных элементов и антагониста рецепторов ИЛ-1 – флуороцитрата – устраняет гипералгезию в «формалиновом тесте».
Современные научные сведения о характере взаимосвязи между иммунной реактивностью и болевой чувствительностью млекопитающих как в нормальных условиях, так и при патологии, отрывочны и противоречивы. Одной из немногих в этой области является работа, опубликованная А.Б. Мулик в 2001 году. Показано, что кролики с высокой чувствительностью к пирогеналу, в состав которого входит ЛПС клеток Pseudomonas aeruginosa, характеризуются высокими болевыми порогами. Было установлено, что системное (внутривенное) введение пирогенала приводит к неодинаковому повышению ректальной температуры у животных с разной ноцицептивной чувствительностью. У кроликов с низкими ноцицептивными порогами в этих условиях наблюдали незначительное, а у особей с высокими значениями соответствующих показателей - существенное увеличение температуры тела. На основании приведенных данных можно высказать предположение о наличии корреляций между болевой чувствительностью и степенью иммунной активации у млекопитающих при антигенном воздействии.
В научной литературе имеется и ряд других указаний об особенностях действия и механизмах влияния иммуноактивных веществ, в частности, ЛПС на ноцицептивную чувствительность млекопитающих. Выявлено, например, что внутрибрюшинное введение ЛПС крысам вызывает симптомы аллодинии даже при незначительном растяжении прямой кишки. С другой стороны, предварительные внутрижелудочковые инъекции животным антагонистов рецепторов ИЛ-ір или ФНО-ос уменьшали ноцицептивную сенситизацию в ответ на последующее введение ЛПС [Coelho A.M. et al, 2000]. Полученные данные иллюстрируют тот факт, что периферическое действие ЛПС на висцеральные (ноцицептивные) реакции реализуется при обязательном участии цитокиновой сети головного мозга.
Усиление ноцицептивных реакций при системном (внутрибрюшинном) введении ЛПС продемонстрировано также в работе L.Watkins с соавт. (1994). Этот эффект связывают со стимулирующим влиянием ЛПС на моноциты и макрофаги, которые в указанных условиях способны к повышенной секреции ряда провоспалительных цитокинов [Colheo A.M. et al, 2000]. Данное предположение находит подтверждение и в результатах других наблюдений. В опытах на крысах установлено, в частности, что гипералгезия в ответ на подпороговое раздражении кожи может возникать при внутрибрюшинном введении ИЛ-ір и ФНО [Mazelin L. et al, 1998; Watkins L. et al, 1994].
Описан и другой механизм влияния ЛПС на болевую чувствительность. В экспериментах на крысах обнаружено, что укорочение латентного периода ноцицептивных реакций при свето-термальном раздражении лап, вызванное внутривенной инъекцией ЛПС, не наблюдается после предварительного введения индометацина - селективного ингибитора циклооксигеназы [Matsuzaki S. et al., 2002]. Следовательно, развитие ЛПС-индуцированной гипералгезии может быть опосредовано кинином и простагландином.
Среди возможных центральных механизмов действия ЛПС на болевую чувствительность млекопитающих следует также отметить модулирующее влияние этого вещества на нейрохимические процессы в головном мозге. Установлено, например, что внутрибрюшинное введение мышам ЛПС облегчает ноцицептивные реакции животных не только в «формалиновом тесте», но и при интратекальной инфузии вещества Р или глутамата [Seo J.W. et al., 2012]. Описаны серотонинергические и адренергические механизмы модуляции синаптической передачи при воздействии ЛПС [Dunn A.J., 1992]. В основе влияния ЛПС на разнообразные физиологические функции могут лежать также опиоидергические процессы. В исследованиях K. Benamar с соавт. (2000) показано, что инъекции в преоптическую область гипоталамуса животных антагониста -опиоидных рецепторов, угнетающего болевые реакции, предотвращают лихорадку, вызванную внутрибрюшинным введением ЛПС. Вовлечение ЛПС в генез болей при патологических процессах, в частности при инфекционных пульпитах, может быть связано и с усилением экспрессии рецепторов этого иммуноактивного вещества в ядре тройничного нерва [Wadachi R., Hargreaves K., 2006].
Необходимо остановиться на изложении результатов исследований, иллюстрирующих взаимосвязи между состоянием иммунных функций, болевой чувствительностью и стресс-реактивностью млекопитающих. Группой ученых под руководством K.T. Nguyen (2000) было показано, что интенсивная стрессорная нагрузка у животных по методике «tail-shock» (электрокожная ноцицептивная стимуляция) сопровождается увеличением содержания ИЛ-1 в гипоталамусе, мозжечке и гиппокампе. Сходные изменения уровня этого провоспалительного цитокина в указанных структурах головного мозга были выявлены при введении ЛПС.
Цитокиновый профиль ткани головного мозга у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида
Перцептуальный компонент ноцицептивной реакции у крыс оценивали по латентному периоду реакции отведения хвоста (ЛП РОХ) в ответ на свето-термальное раздражение методом «tail-flick» [D Amour F.E., Smith D.L., 1941; Daniel le Bars et al., 2001]. Измерения проводили на приборе Tail-Flick Analgesia Meter 0104-301M (Columbus Instruments, USA). Данный прибор позволяет наносить свето-термальное раздражение в автоматическом и ручном режимах. Животных помещали в индивидуальные стандартные пластиковые боксы и фиксировали в горизонтальном положении с выведенным наружу хвостом. Бокс с находящейся в нем крысой устанавливали на горизонтальную площадку на наружной поверхности прибора; хвост животного располагали в специальном углублении, откуда подавали свето-термальный раздражитель. Индикатором соответствующего положения хвоста крысы являлось загорание зеленого светодиода на корпусе прибора. С целью минимизации риска повреждения тканей и исключения «эффекта привыкания» крыс, раздражение подавали вручную с интервалом 3-5 минут на разные участки кожи хвоста животных. Время отдергивания хвоста крысы регистрировалось автоматически с точностью до 0,1 сек. Осуществляли 5 предъявлений свето-термального раздражителя c последующим расчетом среднего значения ЛП РОХ в секундах у каждого животного.
Эмоциональный компонент ноцицептивной реакции у крыс определяли по порогу вокализации животных (ПВ, мА) в ответ на электрокожное раздражение хвоста по оригинальной методике, разработанной в НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН (Абрамов Ю.Б., Козлов А.Ю., 2005). Для исследования применяли электростимулятор SEN-3201 (Nihon Kohden, Япония). Животных помещали в индивидуальные стандартные пластиковые боксы и фиксировали в горизонтальном положении с выведенным наружу хвостом. На хвост крысы надевали 2 металлических кольцевых электрода из медной проволоки на расстоянии 2,5-3,0 см друг от друга, через которые подавали электрокожное раздражение. Кожу хвоста в области наложения электродов предварительно смазывали электродным контактным гелем (УНИАГЕЛЬ, ООО «Гельтек-Медика», Россия). Использовали следующие параметры электростимуляции: частота -10 Гц, длительность импульса - 0,5 мс. Силу тока постепенно увеличивали от 0,25 до 1 мА до появления реакции вокализации (писка) у крыс. 3.3. Исследование цитокинового профиля периферической крови и тканей головного мозга крыс
Собранную после декапитации крыс кровь помещали в пробирки с сывороточным разделителем (набор сывороточных разжижителей Bio-Plex), отстаивали в течение 30 минут, а затем центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут при температуре +4С (MULTI CENTRIFUGE FUGE CM 6М, ELMI, Latvija). Полученные пробы сыворотки крови помещали в пробирки «эппендорф», замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературной камере при температуре -70С.
После полного размораживания пробы сыворотки крови животных готовили к анализу путем разбавления одного объема пробы тремя объемами разжижителя проб сыворотки крысы Bio-Plex 171-305008 (1x96).
После фильтрации на предварительно увлажненную пластину фильтра добавляли гранулы, и осуществляли двукратную промывку пластины. На пластину помещали пробы сыворотки крови и образцов. После 30-минутной инкубации и трехкратной промывки добавляли определяющие антитела к цитокинам (Rat 9-Р1ех A Detection Antibody). Спустя 30 минут инкубации и трехкратной промывки, добавляли стрептавидин-фикоэритрин (входит в состав Bio-Plex Reagent Kit). Все указанные реактивы поставляются в комплекте набора Bio-Plex Rat Cytokine 9-Р1ех A Panel. Ресуспендирование гранул проводили по окончании 10-минутной инкубации и трехкратной фильтрации. Затем пластину помещали в систему Bio-Plex для анализа. 3.3.2. Определение содержания цитокинов в ткани структур мозга крыс
Сразу после декапитации животных быстро извлекали головной мозг; выделяли дорсальный гиппокамп и переднюю поясную кору. Указанные структуры взвешивали на аналитических весах Ohaus Adventurer Pro (AV) (Китай), помещали в пробирки «эппендорф», замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературной камере при температуре -70С.
Для определения уровня цитокинов в тканях структур головного мозга крыс предварительно готовили лизирующий раствор (согласно инструкции к Bio-Plex cell lysis kit). После полного размораживания пробы мозга животных промывали буферным раствором, разрезали на кусочки диаметром 3x3 мм, помещали в пробирки «эппендорф» объемом 2 мл, добавляли лизирующий раствор и измельчали в гриндере (PYREX, USA). Полученную смесь центрифугировали при температуре +4оС и 4500 об/мин в течение 20 минут. Последующие этапы подготовки тканей мозга крыс проводили по методике, применяемой при анализе проб сыворотки крови (с использованием набора реагентов Bio-Plex Pro Rat Cytokine Thl/Th2 Assay). Все первичные исследования проб сыворотки периферической крови и тканей структур головного мозга крыс проводили с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager, вер. 4.1.
Корреляционный анализ иммунологических и ноцицептивных показателей у крыс при внутрибрюшинном введении липополисахарида
Наши опыты продемонстрировали, что внутрибрюшинное введение крысам физиологического раствора приводит к увеличению ЛПРОХ при свето-термальном раздражении хвоста в 1-е сутки исследования. Полученные данные дополняют имеющиеся сведения о физиологическом значении перцептуального компонента ноцицепции у животных. Согласно теории «воротного контроля», сформулированной R.Melzak и P.Wall в 1965 году, формирование ноцицепции на уровне сегментов спинного мозга находится под контролем вышележащих структур, где происходит оценка значимости ноцицептивного потока. Данный процесс осуществляется при участии тормозных нейронов желатинозной субстанции, которые активируются импульсацией с периферии по толстым проводящим волокнам, а также нисходящими влияниями со стороны супраспинальных отделов, в том числе коры головного мозга. Недостатком этой теории является невозможность объяснения существования всех разновидностей болевого синдрома, в частности болей центрального происхождения. В то же время, полученные в наших исследованиях результаты могут быть связаны с реализацией именно «воротного» механизма, описанного в этой теории. Выявленное нами снижение ноцицептивной чувствительности животных через 1 сутки после введения физиологического раствора свидетельствует о раннем подавлении распространения ноцицептивного возбуждения на уровне периферического звена системы оценки ноцицептивного потока. Следует подчеркнуть, что в поздние сроки после инъекции ЛПС (7-е сутки) изменений ноцицептивной чувствительности крыс в этом экспериментальном тесте не обнаружено.
Изучение характера влияния ЛПС на ноцицептивную чувствительность животных показало следующее. В отличие от крыс, получавших инъекции физиологического раствора, ЛПРОХ животных в ответ на свето-термальное раздражение хвоста снижался через 1 сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС более чем в 1,5 раза по сравнению с исходным показателем.
Указанные изменения иллюстрируют усиление перцептуального компонента ноцицептивных реакций у крыс после воздействия ЛПС. Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными о гипералгетическом эффекте ЛПС, выявленном при оценке ноцицептивных порогов у животных в тесте «горячей пластины» [Abu-Ghefreh A.A., Masocha W., 2010; Mehrotra A. et al., 2011]. Нами обнаружено, что внутрибрюшинное введение крысам ЛПС сопровождается усилением как перцептуального, так и эмоционального компонентов ноцицепции в поздние сроки исследования. Это проявлялось в выраженном снижении ЛПРОХ и ПВ животных в ответ на ноцицептивное раздражение хвоста на 7-е сутки после инъекции ЛПС (по сравнению с исходными показателями). С одной стороны, полученные данные дополняют имеющиеся научные сведения о пролонгированном действии ЛПС при периферическом введении, которое проявляется, в частности, в изменении перцептуального компонента ноцицепции у крыс [Maier S.F. et al., 1993]. В то же время, усиление эмоционального компонента ноцицепции у животных, выявленное в поздние сроки после периферического введения ЛПС является абсолютно новым фактом. Представленные результаты способствуют пониманию системных механизмов взаимодействия между иммунными и ноцицептивными процессами в организме при действии антигена. Известно, что эмоционально-аффективный компонент ноцицепции у млекопитающих отражает психо-эмоциональную реакцию на повреждение [Кукушкин М.Л. и др., 1994]. Формирование этого компонента происходит преимущественно в лимбических структурах головного мозга [Дегтярев В.П., 1998]. Усиление эмоционального компонента ноцицепции у крыс, наблюдающееся на 7-е сутки после внутрибрюшинного введения ЛПС, косвенно свидетельствует о развитии у животных вторичной гипералгезии под воздействием этого иммуноактивного соединения. Состояние вторичной гипералгезии у млекопитающих является результатом повышения возбудимости ноцицептивных нейронов в ряде структур головного мозга, может сохраняться длительное время [Кукушкин М.Л., 2007] и является одним из клинических симптомов центральной сенситизации [Данилов А.Б, Данилов Ал.Б., 2012].
В настоящее время имеется значительное число работ, указывающих на участие цитокинов в регуляции ноцицептивных реакций у млекопитающих [Роговина Е.Г., 1999; De LuLeo J. et al, 1997; Turnbull A.V., Riviev C.L., 1999; Reeve A. et al, 2000; Song P. et al, 2002; Wang Z. et al, 2012]. С учетом этих данных, на следующем этапе исследования, с целью оценки взаимосвязи между ноцицептивной чувствительностью и характером иммунных реакций в организме при антигенном воздействии, мы определяли уровень цитокинов в периферической крови и тканях мозга у крыс, получавших ЛПС. Содержание провоспалительных (ИЛ-1а, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН-у и ФНО-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) измеряли у интактных особей, а также в разные периоды после внутрибрюшинного введения ЛПС.
Наши опыты продемонстрировали, что внутрибрюшинное введение крысам ЛПС приводит к снижению уровня как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов в периферической крови. Указанные изменения были наиболее выражены в 1-е сутки исследования. Содержание провоспалительных цитокинов, особенно ИЛ-1а и ИЛ-ір, в сыворотке крови животных возрастало на 7-е сутки после антигенного воздействия и практически не отличалось от такового у интактных особей. Концентрация других изученных цитокинов в крови крыс несколько увеличивалась на 7-е сутки после инъекции ЛПС, но была меньше соответствующих контрольных показателей. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о временной динамике изменений уровня цитокинов в сыворотке крови млекопитающих под влиянием ЛПС. Ранее установлено, что продукция ИЛ-1(3 и ФНО-а в культуре альвеолярных макрофагов крыс наиболее выражено возрастает через 6 ч после введения ЛПС, но несколько снижается на 8-й час после воздействия [Ren W. et al, 2011].
