Содержание к диссертации
Введение
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
2.1. Значение запахов в жизни моллюсков 9
2.2. Анатомия обонятельной системы наземного моллюска 10
2.2.1. Периферический обонятельный орган 10
2.2.2. Центральное звено обонятельного анализатора 15
2.3. Спонтанная и вызванная запахом осцилляторная активность в процеребруме наземных моллюсков 20
2.4. Обучение улиток запахам 26
2.5. Нейроны, участвующие в реализации пищевого и оборонительного поведения улитки 28
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА 36
3.1. Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro 36
3.1.1. Животные и экспериментальные препараты 36
3.1.2. Отведение суммарных потенциалов 37
3.1.3. Внутриклеточное отведение. 39
3.1.4. Обработка электрофизиологических записей суммарных потенциалов от процеребрума 40
3.7.1. Предъявление запаха на полуинтактный препарат 40
3.2. Эксперименты с поведением 43
3.2.1. Аверзивное обучение на запах цинеола 43
3.2.2. Обучение пищевой реакции на запах цинеола. 44
3.2.3. Тестирование в открытом поле. 44
3.3. Электрофизиологическая регистрация от процеребрума in vivo и проведение операций 47
3.3.1. Экспериментальные животные и анестезия 47
3.3.2. Методика проведения операций по вживлению хронических электродов. 47
3.3.3. Отведение суммарных потенциалов от процеребрума in vivo и предъявление запаха животному. 48
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 49
4.1. Сравнение осцилляции в процеребруме in vivo и in vitro в отсутствие запаха 49
4.2. Изменение осцилляции процеребрума под воздействием запаха 53
4.2.1. Вызванная активность процеребрума in vivo 53
4.2.2. Вызванная активность процеребрума in vitro 60
4.3. Влияние характера обучения на ответ процеребрума на запах 64
4.3.1. Аверсивное обучение. 64
4.3.2. Пищевое обучение 72
4.3.3. Сравнительный анализ ответов на запах у наивных и обученных улиток. 77
4.4. Соотнесение осцилляции процеребрума с активностью идентифицированных нейронов пищевого и оборонительного поведения 82
4.4.1. Спонтанная активность 83
4.4.2. Вызванная запахом активность 89
4.5. Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца 91
5. ОБСУЖДЕНИЕ 95
5.1. Спонтанная активность процеребрума in vivo и in vitro 95
5.2. Вызванная активность процеребрума in vivo и in vitro 96
5.3. Влияние характера обучения на ответ процеребрума на запах 103
5.4. Роль процеребрума в регуляции активности мотонейрона щупальца 106
6. ВЫВОДЫ 109
БЛАГОДАРНОСТИ 111
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 112
- Значение запахов в жизни моллюсков
- Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro
- Сравнение осцилляции в процеребруме in vivo и in vitro в отсутствие запаха
- Спонтанная активность процеребрума in vivo и in vitro
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Среди всех беспозвоночных животных спонтанная ритмическая осцилляторная активность мозга обнаружена только у наземных легочных моллюсков (улиток и слизней). Низкочастотные (~1 Гц) спонтанные осцилляции были описаны в процеребруме (ответственная за обоняние структура мозга) слизня Limax maximus (Gelperin and Tank, 1990; Kleinfeld et al, 1994), а также в процеребруме улитки Helix lucorum (Никитин и Балабан, 1999; Nikitin and Balaban, 2000).
В составе процеребрума насчитывают до 80 000 нейронов, в то время как во всех остальных ганглиях нервной системы улитки содержится всего около 20 000 нейронов. Поведение моллюсков довольно стереотипно и ограничено относительно простыми формами. Это позволяет исследовать организацию разных типов поведения на клеточном уровне, например, проследить связь активности нейронов процеребрума моллюска с идентифицированными нейронами, вовлеченными в реализацию конкурентных форм поведения (пищевого и оборонительного). Так, известно, что сокращением щупальца улитки в ответ на запах (оборонительное поведение) управляет группа мелких мотонейронов и крупный идентифицируемый метацеребральный мотонейрон щупальца (МтЦ3). Вклад этого мотонейрона в центральный компонент рефлекса втягивания щупальца составляет ~85% (Захаров и др., 1982; Prescott et al., 1997). Самый крупный нейрон церебральных ганглиев первый метацеребральный нейрон (МтЦ1) осуществляет модуляцию пищевого поведения у таких моллюсков как Helix (Chase and Tolloczko, 1992) и Lymnaea (Elliott and Susswein, 2002).
Считается, что осцилляции в процеребруме моллюсков играют важную роль в распознавании, запоминании и кодировании информации о запахе (Teyke and Gelperin, 1999), однако на сегодняшний день механизм участия осцилляций в этих процессах остается неизвестным. Кроме того, ни на одном объекте не изучены конкретные нейронные механизмы, регулирующие осцилляции в обонятельных структурах. Неизвестна также роль осцилляций в запуске моторной программы поведения животного. На данный момент осцилляторная активность процеребрума наземных улиток при восприятии запахов является единственным известным физиологическим феноменом, связывающим восприятие запахов с формированием поведения и является ключом к пониманию клеточных основ поведения у наземных моллюсков и выяснению нейронного кодирования обонятельной модальности у животных.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью данной работы являлось изучение возможной роли процеребрума наземных улиток в реализации двух альтернативных форм поведения (пищевого или оборонительного поведения) в ответ на один и тот же запах (цинеол) у обученных условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции и у необученных (наивных) животных.
В соответствии с поставленной целью исследования были определены следующие задачи:
1. Зарегистрировать и проанализировать осцилляторную активность процеребрума виноградных улиток in vivo и in vitro в условиях адекватной обонятельной стимуляции у необученных улиток и обученных условно-рефлекторной пищевой или аверсивной реакции на запах цинеола.
2. Зарегистрировать и сопоставить спонтанную осцилляторную активность процеребрума с активностью нейронов, вовлеченных в реализацию разных форм поведения виноградных улиток.
3. Изучить взаимоотношения между вызванной предъявлением запаха суммарной активностью клеток процеребрума и активностью мотонейрона щупальца МтЦ3 (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения.
1. Динамика изменения частоты и амплитуды спонтанных осцилляций в процеребруме в ответ на запах различается у обученных (пищевой или оборонительной реакции) и у необученных улиток, что отражает участие процеребрума в обучении и выборе поведения в ответ на запах.
2. Спонтанные изменения обонятельного ритма в процеребруме улитки коррелируют по времени с изменением активности идентифицированных нейронов в сетях управления конкурентными формами поведения (пищевым и оборонительным).
3. Активация клеток процеребрума вызывает торможение спонтанной спайковой активности мотонейрона щупальца МтЦ3, принимающего участие в реализации оборонительного поведения. Обратного влияния со стороны мотонейрона щупальца на клетки процеребрума не обнаружено. Тормозное влияние со стороны процеребрума может уменьшать длительность оборонительной реакции животного в ответ на запах, которая определяется уровнем активности мотонейрона щупальца.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработана методика экстраклеточного отведения активности процеребрума in vivo и проведена регистрация суммарной спонтанной и вызванной электрической активности процеребрума in vivo у наземного моллюска Helix lucorum L. Проведен анализ вызванной осцилляторной активности процеребрума in vivo и in vitro в ответ на предъявление запаха цинеола у необученных (наивных) и обученных (условно-рефлекторной пищевой или оборонительной реакции) улиток. Впервые показана спонтанная синергичная активность процеребрума и нейронов ЦНС, вовлеченных в реализацию двух конкурентных форм поведения улитки. Впервые обнаружено тормозное влияние нейронов процеребрума на активность мотонейрона щупальца МтЦ3 (третьего метацеребрального нейрона), принимающего участие в реализации оборонительного поведения. Описана роль процеребрума как центрального звена восприятия запахов при реализации двух конкурентных форм поведения виноградной улитки.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Анализ изменения осцилляторной активности в обонятельном мозге улитки в ответ на запах расширяет представления современной физиологии о роли сенсорной структуры в организации поведения. Описание влияния активности процеребрума на активность мотонейрона щупальца, принимающего участие в реализации оборонительного поведения, дополняет существующие представления о механизме выбора поведения животным.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации были доложены на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Дагомыс, 2005), на 5-ом международном форуме FENS (Fifth Forum of European Neuroscience, Вена, Австрия, 2006), на 8-ой международной конференции ISIN (International Society for Invertebrate Neurobiology) "Простые нервные системы" (Казань, 2006), на конференциях молодых ученых ИВНД и НФ РАН (Москва, 2004, 2005, 2006).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 6 докладов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста, иллюстрирована ____ рисунками. Список литературы содержит ____ источников.
Значение запахов в жизни моллюсков
Обоняние у наземных гастропод (улиток и слизней) является важной сенсорной модальностью для определения локализации запахов во время питания и ориентации в пространстве (Chase, 1986). На кончиках верхних щупалец имеются глаза и сенсорный обонятельный эпителий, но глаза очень слабо развиты (позволяют различать свет и тень) и не позволяют улиткам достаточно свободно ориентироваться в пространстве. Специализированные органы слуха у наземных моллюсков и вовсе отсутствуют.
Обоняние наземных моллюсков очень чувствительно к различным химическим веществам и изменению их концентраций. Для наземных моллюсков обоняние играет центральную роль при поиске пищи (Balaban, 1993). Голодная улитка Achatina fulica способна уловить запах пищи с расстояния 20-50 см (Croll and Chase, 1980). Улитки и слизни локализуют источник запаха с помощью пары задних (верхних) щупалец головы. У некоторых видов моллюсков щупальца не втягиваются, у других они втягиваются без инверсии (вворачивания) внутрь, у третьих, включая Helix и Achatina, они втягиваются с инверсией. Получается, что щупальце - это втягивающийся вариант носа (Chase, 1986).
Удаление обоих задних щупалец лишает улитку ахатину способности находить пищу по запаху. Если голодную улитку с одним удалённым задним щупальцем поместить в градиент аппетитного запаха, то она начнёт блуждать по окружности, заворачивая в сторону второго (интактного) заднего щупальца (Chase and Croll, 1981). Удаление одного или обоих передних щупалец (ринофоров) заметно не сказывается на способности улитки двигаться в направлении запаха пищи. Передние щупальца могут служить улиткам для прослеживания следов пищи на опорной поверхности (например, на грунте, по которому ползёт улитка) (Chase and Croll, 1981). На передних щупальцах улитки располагаются органы химической чувствительности, действующие при непосредственном контакте с объектом - органы вкуса, а на задних щупальцах располагаются органы дистантной химической чувствительности - органы обоняния.
Обонятельный орган улитки включает в себя специализированный сенсорный эпителий, расположенный на кончиках задних щупалец, и залегающий под эпителием тентакулярный (щупальцевый) ганглий (Рис. 2.2.1., по: Chase and Tolloczko, 1993). Ранее (Chase and Tolloczko, 1986) было показано, что основная часть обонятельных рецепторов посылает аксоны в гломерулы, располагающиеся в пальцеобразных выростах тентакулярного ганглия. Гломерулы характеризуются плотным неиропилем и многочисленными синаптическими контактами, а также окружены глиальными клетками. В каждом щупальце Achatina fulica около 20 гломерул, рядом с которыми располагаются перигломерулярные интернейроны.
Морфология обонятельного эпителия и гломерул у моллюсков (Рис. 2.2.2.) сходна с аналогичными структурами у позвоночных (Gelperin, 1999; Hildebrand and Shepherd, 1997). Главное отличие от обонятельного органа млекопитающих состоит в том, что у улиток сенсорные нейроны собраны в кластеры (lobuli), расположенные под эпителием (Chase, 1986, Chase and Tolloczko, 1993). Площадь поверхности обонятельного сенсорного эпителия каждого щупальца улитки ахатины составляет 1 мм2, на которой находится около 100 000 рецепторых клеток (Chase, 1985), примерно такое же количество у слизня Arion ater (Wright, 1974).
Электрофизиологическая регистрация от процеребрума и нейронов ЦНС in vitro
Для работы использовали взрослых виноградных улиток Helix lucorum L. крымской популяции. Для предотвращения операционного шока животное анестезировали изотоническим раствором MgCb. Из животного извлекали ЦНС (изолированный препарат) (Рис. 3.1.1.А), или ЦНС с интактными обонятельными нервами и несущими обонятельный эпителий задними щупальцами (полуинтактный препарат) (Рис. 3.1.1.Б). Препарат помещали в экспериментальную ванночку (объем 3 мл) с раствором Рингера. Для фиксации использовали стальные иголочки, с помощью которых препарат прикалывали ко дну экспериментальной ванночки, покрытому силгардом (Sigma, USA). Состав физиологического раствора был следующим (концентрации в ммоль): 100 Na+, 4,2 К+, 7,0Са2+, 4,6Mg2+, 10Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-М -2-этансульфоновая кислота (HEPES, Sigma, USA), рН 7.6-7.8 (Rhines et al., 1993; с изменениями). Для обеспечения подачи запаха на обонятельный эпителий, кожу щупальца (которое во время извлечения из тела животного выворачивалось наизнанку) почти полностью удаляли. Щупальце прикалывали за мышцу ретрактора к специальной подложке из силгарда, находившейся над уровнем физиологического раствора (Рис. 3.1.1.Б; Egan and Gelperin, 1981).
Оболочки с процеребрума удаляли полностью или частично. Оболочки с нейронов других ганглиев ЦНС удаляли полностью. Для удаления наружных грубых оболочек с ЦНС препарат обрабатывали 7 минут протеазой (тип XIV, Sigma, USA) с последующим отмыванием раствором Рингера в течение 20-30 мин (время обработки препарата ферментом и концентрация фермента подобраны эмпирически). Во время обработки ферментом обонятельный эпителий находился выше уровня физиологического раствора и не подвергался протеолитическому действию.
Во время проведения серий экспериментов с обучением животных держали голодными (подкармливая раз в неделю капустой) в стеклянных террариумах с повышенной влажностью при комнатной температуре и с регулируемым световым режимом (12.00:12.00). Внутри террариума находилась фарфоровая чашка с водой, которую меняли каждый день. Контрольных (наивных) и обучаемых животных держали вместе, различали по номерам, нанесённым на раковину. Обучаемых животных было две группы: группа, обучаемая аверзивной реакции на запах цинеола и группа, обучаемая пищевой реакции на цинеол. Всех животных поддерживали в бодрствующем состоянии, помещая их каждый день на 30 минут в среду с высокой влажностью.
В работе применяли синхронное экстраклеточное отведение суммарных потенциалов от процеребрума и церебро-буккальной коннективы и внутриклеточное отведение мембранного потенциала нейронов ЦНС улитки. Стимуляцию процеребрума проводили с помощью стимулятора ЭСЛ-2.
Для электрофизиологического отведения активности в процеребруме использовали заполненный физиологическим раствором тонкий (внутренний диаметр 0,3 - 0,5 мм) стеклянный присасывающий электрод. Электрод сначала обламывали до нужного диаметра, затем кончик электрода затачивали на тонкой алмазной шкурке для выравнивания краёв. После этого кончик электрода оплавляли над спиртовой горелкой для придания краям отверстия гладкости. Помещённая внутрь электрода хлорированная серебряная проволока осуществляла электрический контакт с раствором Рингера внутри электрода.
Сравнение осцилляции в процеребруме in vivo и in vitro в отсутствие запаха
Закономерности спонтанных изменений электрофизиологических параметров ритмической активности, определяющих паттерн фоновой активности процеребрума в отсутствие запаха, выявляли путем статистического анализа амплитуды и частоты осцилляции, регистрируемых в экспериментах in vivo и in vitro (см. Методы гл. 3.1.4.).
Спонтанные осцилляции, зарегистрированные in vivo у наивных оперированных улиток, отличались от спонтанных осцилляции процеребрума, регистрируемых на полуинтактных препаратах in vitro. При экстраклеточной регистрации активности процеребрума на полуинтактном препарате (ЦНС — обонятельный нерв — обонятельный эпителий) осцилляции длительное время (часы) имеют более или менее постоянную частоту и амплитуду, незначительно изменяясь под влиянием неподдающихся учёту внешних или внутренних сигналов. В свободном поведении амплитуда, частота и форма осцилляции у наземных улиток были менее постоянными и предсказуемыми, нежели осцилляции процеребрума при регистрации in vitro (Рис. 4.1.1.).
Частота спонтанных осцилляции в процеребруме наивной улитки в свободном поведении, в отличие от частоты обонятельного ритма на полуинтактном препарате, в большинстве случаев была больше 1 Гц. Средняя частота осцилляции, зарегистрированных in vivo, составляла 1,16 ±0,08 Гц (Рис. 4.1.2.), что почти в два раза больше, чем частота спонтанных осцилляции до предъявления запаха на полуинтактном препарате как у наивных улиток, так и улиток, с выработанной условнорефлекторной пищевой или оборонительной реакцией на запах цинеола. При in vitro регистрации осцилляторной активности процеребрума наивных улиток частота осцилляции редко превышала 1 Гц, а средняя частота осцилляции составляла 0,68 ± 0,09 Гц (Рис. 4.1.2.).
В группе препаратов, полученных из обученных пищевой реакции на запах цинеола улиток, средняя частота осцилляции in vitro до нанесения запаха составляла 0,65 ± 0,05 Гц, достоверно не отличаясь от средней частоты осцилляции процеребрума наивных улиток in vitro (Рис. 4.1.2.).
На полуинтактных препаратах улиток, обученных оборонительной реакции на запах цинеола, не наблюдали ни одного случая, когда частота осцилляции в фоне до момента нанесения запаха на препарат превышала 1 Гц. Средняя частота осцилляции у таких улиток составляла 0,6 ± 0,04 Гц (Рис. 4.1.2.).
Изменения амплитуды осцилляции процеребрума, зарегистрированные как in vivo, так и in vitro, также, как и частота, оказались непредсказуемыми, зависели от неизвестных факторов. Средняя амплитуда осцилляции в фоне (до предъявления запаха цинеола) in vivo составляла 65,5 ± 4,07 мкВ (Рис. 4.1.2.). Средняя амплитуда осцилляции, зарегистрированных in vitro, была достоверно меньше - у наивных улиток 46,8 ± 4,02 мкВ и улиток, обученных пищевой реакции на цинеол, 35,2 ± 2,23 мкВ. Средняя амплитуда осцилляции, зарегистрированных in vitro у улиток с выработанной аверсией на цинеол была недостоверно больше (110,34 ± 16,44 мкВ), чем амплитуда осцилляции in vivo, что может быть связано с сильной сенситизацией улиток к данному запаху во время обучения (Рис. 4.1.2.).
Спонтанная активность процеребрума in vivo и in vitro
Считается, что процеребрум является высшим обонятельным центром мозга наземных моллюсков и насекомых. По общему убеждению у водных видов моллюсков обоняние отсутствует (есть только хеморецепция, вполне заменяющая обоняние в водной среде), в связи с чем у них нет и процеребрума. Впервые спонтанная активность процеребрума in vitro была проанализирована в деталях у слизня Limax maximus (Gelperin and Tank, 1990). Позднее были зарегистрированы спонтанные ритмичные осцилляции в процеребруме у наземной улитки Helix lucorum (Chase and Hall, 1996; Никитин и Балабан, 1999). До сих пор неизвестно значение этого спонтанного осцилляторного ритма процеребрума, однако считается, что волна возбуждения вызывает синхронизацию работы большого количества клеток процеребрума и тем самым способствует более точной настройке всей системы на выделение новых, в том числе очень слабых, источников запаха из окружающей среды, содержащей множество одорантов (Laurent, 1996). Первую и единственную на сегодняшний день попытку зарегистрировать осцилляторную активность процеребрума in vivo на слизне Umax maximus с помощью вживленных электродов провели Cooke и Gelperin (2001). По их данным спонтанные осцилляции процеребрума при регистрации in vivo и in vitro различались как по частоте ритма, так и по амплитуде. Наши результаты также показывают различия в спонтанном осцилляторном ритме процеребрума при регистрации in vivo и in vitro на наземной улитке Helix lucorum (Рис. 4.1.1. и 4.1.2.). Не совсем ясно, с чем связано такое различие в частоте и амплитуде осцилляции in vivo и in vitro (частота осцилляции in vivo в два раза больше, чем in vitro, различия в амплитуде тоже достоверны), однако можно предположить, что различия в составе омывающей ЦНС среды и модуляторные влияния со стороны нервной системы вносят существенный вклад. В любом случае, в качестве отправной точки для оценки механизмов восприятия запахов следует брать данные, полученные на свободно-подвижном животном.
Известно, что при восприятии запаха моллюсками (животное или полуинтактный препарат) происходят изменения осцилляции в процеребруме, обеспечивающего восприятие и обработку обонятельной информации (Gelperin and Tank, 1990; Cooke and Gelperin, 2001; Murakami et al., 2004; Никитин и Балабан, 1999). В работе Cooke и Gelperin (2001) показано, что после предъявления запаха слизню Umax maximus значительных изменений частоты осцилляции в процеребруме in vivo не происходит, а вот увеличение амплитуды осцилляции очевидно. Но в этой работе авторы использовали заведомо аверсивный стимул (амилацетат) и длительность его предъявления животному была в течение нескольких десятков секунд, в связи с чем реакция на запах в процеребруме была мощной и длительной (Cooke and Gelperin, 2001). Изменения частоты и амплитуды осцилляции связывают с восприятием обонятельной информации, а также с ее обработкой и хранением (Toda et al., 2000; Inoue et al., 2000; Murakami et al., 2004).
