Электрофизиологические механизмы устойчивости ритма сердца суслика Citellus undulatus во время гибернации Глухов Алексей Вячеславович

Содержание к диссертации

Список сокращений 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1. Клинические и экспериментальные наблюдения нарушений 8 ритма сердца при гипотермии

2. Феномен гибернации 11

3. Электрофизиологические механизмы развития блоков 14 проведения и аритмий при гипотермии. Устойчивость гибернирующих животных к возникновению нарушений ритма

1.3.1. Кальциевая перегрузка кардиомиоцитов при гипотермии 19

4. Особенности энергетического метаболизма у 21 гибернантов.

5. Са -транспортирующие системы кардиомиоцитов. 22

1.3.2. Проведение возбуждения 29

6. Роль деполяризующих токов в распространении ПД 30

7. Межклеточное взаимодействие 34

8. Роль 1са,ь тока в формировании и распространении ПД в 37 рабочем миокарде желудочков при гипотермии и гибернации

4. Особенности иннервации сердца гибернантов 39

5. Резюме 41

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42

1. Объект исследования и инструментальный протокол 42

2. Экспериментальный протокол 44

3. Система оптического картирования электрической активности 49 сердца.

4. Регистрация оптических сигналов, обработка и статистический 52 анализ полученных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 57

3.1. Электрофизиологические параметры функционирования сп
изолированного сердца гибернирующих и негибернирующих

животных при различных температурах (серия 1).

2. Хронотопография активации изолированного сердца сусликов 55 и кроликов при 37С и во время охлаждения до 3С (серия 2).

3. Пространственно-временные характеристики процессов 74 активации и реполяризации сердца сусликов и кроликов при различных температурах. Уязвимость к желудочковым тахиаритмиям при гипотермии (серия 3).

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 91

1. Возникновение нарушений ритма сердца при гипотермии и последующем нагревании у гибернирующих и негибернирующих животных

2. Роль скорости проведения в защите от остановки сердечной деятельности при гипотермии

3. Особенности межклеточного взаимодействия у гибернирующих животных

4. Надёжность проведения при гипотермии 104

5. Роль динамической неоднородности миокарда в механизме 109 развития ФЖ

6. Антиаритмическая роль постреполяризационной 116 рефрактерности

7. Сезонные изменения устойчивости сердца гибернантов к j j 9 гипотермии

ВЫВОДЫ 121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 123

Список сокращений

ФЖ - фибрилляция желудочков;

ТЖ - тахикардия желудочков;

ЖФРП - желудочковый функциональный рефрактерный период;

ЖЭРП - желудочковый эффективный рефрактерный период;

ПД - потенциал действия;

АТФ - аденозинтрифосфат;

ЧСС - частота сердечных сокращений;

ЗГ - зимний гибернирующий суслик;

ЗП - зимний проснувшийся суслик;

ЛА - летний активный суслик;

ЭГ - электрограмма;

АВ - атриовентрикулярный

СП - скорость проведения;

ДПД - длительность потенциала действия.

Введение к работе

Актуальность исследования.

Сердце человека и большинства млекопитающих имеет ограниченную устойчивость к холоду: снижение температуры тела до 28-26С приводит к увеличению экстрасистолической активности и часто - к развитию фибрилляции желудочков (ФЖ), самой опасной аритмии, приводящей к летальному исходу [Johansson, 1996; Matlu et al, 2002]. Дальнейшее снижение температуры до 15-10С приводит к полному блоку проведения возбуждения по сердцу и асистолии. Подобная ситуация наблюдается у всех негибернирующим млекопитающих при выраженной гипотермии [Mouritzen, 1963]. В то же время, сердце гибернирующих млекопитающих (гибернантов), напротив, устойчиво к низким температурам и способно адекватно сокращаться даже при 0-7С [Duker et al, 1983; Burlington et al, 1989]. Нарушения проведения, а также ФЖ не развиваются ни при входе в состояние гибернации, ни при выходе из него, когда температура тела гибернанта может изменяться в течение нескольких часов более чем на 30С [Saitongdee et al, 2000]. Несмотря на многолетние исследования проблемы гибернации, точные механизмы устойчивости ритма сердца зимнеспящих животных во время выраженной гипотермии остаются до конца неизвестными.

Среди возможных факторов, обуславливающих различную уязвимость сердца гибернирующих и негибернирующих млекопитающих к возникновению нарушений ритма сердца при низких температурах, выделяют несколько ключевых: дисперсию реполяризации и проведения в желудочках [Duker et al, 1987; Salama et al, 1998], плотность адренергической иннервации [Nielsen et al, 1968; Johansson, 1996], особенности Ca²⁺ гомеостаза [Liu et al, 1997; Wang el al, 2002], метаболические факторы, а также особенности утраструктуры межклеточных контактов [Saitongdee et al, 2000; Opthof, 2000; Fedorov et al, 2005]. В то же время, в настоящий момент нет убедительных данных о роли того или иного механизма в защите сердца гибернантов от возникновения аритмий при гипотермии.

Во время зимней спячки гибернирующие животные адаптируются к выраженной гипотермии, предотвращая негативные эффекты охлаждения. Весьма заманчивой представляется перспектива применения этих

физиологических явлений в клинической медицине, однако она ограничивается слабым пониманием механизмов гибернации. В связи с этим, изучение электрофизиологических механизмов, с помощью которых гибернанты защищены от возникновения нарушений ритма сердца при гипотермии, продолжает до сих пор оставаться в центре внимания многих исследователей. Результаты таких исследований могут привести к пониманию основных механизмов образования наиболее опасных нарушений сердечного ритма, к разработке новых способов их предотвращения и купирования.

Цель исследования.

Изучить электрофизиологические механизмы устойчивости сердца гибернирующих сусликов Citellus undulatus к развитию желудочковых тахиаритмий при низких температурах.

Задачи исследования.

1. Провести сравнительное исследование влияния гипотермии на электрическую активность изолированного по Лангендорфу сердца зимнеспящих сусликов (в различных состояниях активности) и негибернирующих млекопитающих (крысы и кролики).

2. Исследовать влияние гипотермии на спонтанный аритмогенез в сердце гибернирующих и негибернирующих млекопитающих, а также оценить уязвимость сердца к развитию желудочковых тахиаритмий во время электрической стимуляции при различных температурах.

3. Провести сравнительное исследование влияния гипотермии на пространственно-временные характеристики процессов активации и реполяризации сердца сусликов и кроликов.

4. С помощью метода оптического картирования проанализировать причины развития желудочковых тахиаритмий у негибернантов при охлаждении.

5. Исследовать сезонные изменения устойчивости сердца зимнеспящих сусликов Citellus undulatus к гипотермии.

Научная новизна.

1. В работе впервые непосредственно измерена скорость проведения возбуждения и детально исследована хронотопография активации сердца гибернирующего млекопитающего в условиях выраженной гипотермии. С помощью методики оптического картирования электрической активности

сердца показано сохранение функциональной однородности миокарда желудочков сусликов при охлаждении до 3 С и значительное увеличение при понижении температуры неоднородности у кроликов, что, по-видимому, обуславливает различную уязвимость сердца гибернантов и негибернантов к развитию блоков проведения и возникновению желудочковых аритмий.

2. Впервые показано появление у сусликов Citellus undulatus во время гибернации постреполяризационной рефрактерности, которая может являться дополнительным защитным механизмом против возникновения нарушений ритма и обуславливаться различной экспрессией и/или регуляцией Na⁺ и/или Са²⁺ каналов.

3. Получены экспериментальные доказательства важной роли межклеточных контактов в аритмогенезе во время гипотермии. Показано, что увеличение во время гибернации экспрессии белков, формирующих щелевые контакты, способствует устойчивости ритма сердца при охлаждении.

Теоретическая и практическая значимость.

Теоретическая значимость представленных результатов определяется существенным вкладом в понимание природных антиаритмических механизмов, присутствующих у гибернирующих млекопитающих. Исследование показало, что в сердце гибернантов присутствует ряд специализированных адаптационных механизмов, обуславливающих функциональную однородность миокарда и препятствующих развитию аритмий.

Практическая значимость работы связана с выявлением новых мишеней для действия кардиотропных средств. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых подходов к повышению устойчивости негибернирующих организмов, включая человека, в экстремальных условиях, и дальнейшего их применения в медицинской практике. Кроме того, применяемая в работе система оптического картирования электрической активности сердца может быть использована для быстрого и достаточно точного тестирования и исследования новых антиаритмических препаратов, что невозможно достичь, используя традиционные методы электрофизиологических исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Клинические и экспериментальные наблюдения нарушений ритма

сердца при гипотермии.

Переохлаждение организма встречается часто в виде самостоятельного заболевания или сопутствующего патологического процесса при отморожениях, травмах и др. Несмотря на большую практическую важность, многие вопросы, связанные с действием холода, особенно с глубоким охлаждением организма, завершающимся либо смертельным исходом, либо длительными и необратимыми патологическими последствиями, остаются до конца неясными, а, вследствие этого, и меры помощи и лечения недостаточно разработанными.

Патогенез замерзания характеризуется большим многообразием механизмов. Практически все системы организма обнаруживают при охлаждении значительные функциональные изменения. Однако среди непосредственных причин смерти организма при замерзании выделяют лишь четыре основные: 1) остановка дыхания; 2) ФЖ; 3) асистолия; 4) коллапс. Эти причины могут сочетаться друг с другом, но чаще - в зависимости от некоторых дополнительных условий - одна из них в патогенезе замерзания выступает на первый план.

Об ограниченной устойчивости сердца к холоду сообщают многие авторы. Так, снижение температуры тела человека до 28-26С приводит к увеличению экстрасистолической активности и часто - к развитию ФЖ [Вайнер, 1982; Покровский, 1994; Johansson, 1996; Майи, 2002]. Дальнейшее снижение температуры до 15С приводит к полному блоку проведения возбуждения по сердцу и асистолии. Подобная ситуация наблюдается у всех негибернирующим млекопитающих [Mouritzen, 1963]. Существует ряд работ, в которых проведено исследование температурного порога функционирования сердца [Кепуоп, 1957; Badeer, 1958; Nielsen, 1967; Mouritzen, 1963; Кобрин, 1991; Жегунов, 1993; Johansson, 1996]. Предельная температура функционирования сердца при общей гипотермии несколько отличается у различных животных. Так, у собак она находится в диапазоне от 22С до 13 С (в среднем 17,8С) [Покровский, 1994]. У кошек остановка сердца наступает при 19С - 13С, а в среднем - при 1бС [Покровский, 1994]. Для кроликов

соответствующие цифры составляют 18С - 12С и 15,2С. Температура остановки сердца у морских свинок варьируется от 17С до 10С, а у крыс - от 13С до 3С, а в среднем соответственно 14С и 8С. Кроме того, первостепенное значение имеет возраст: новорождённые животные в первые дни своей жизни способны без необратимых последствий переносить охлаждение до температур, близких к нулю.

Проблема возникновения ФЖ при понижении температуры сердца стала перед кардиохирургами в 1950-60-х годах, на начальной стадии применения методики искусственного кровообращения во время операций по коррекции сложных врождённых пороков сердца с использованием методики глубокой гипотермии [Волколаков, 1977; Вахтер, 1982]. Охлаждение сердца до 25-23С представляет хирургу гораздо больше возможностей для оперативного вмешательства, чем при других способах анестезии или наркоза. Исключительно важным является то, что охлаждённый организм в состоянии переносить без тяжёлых последствий гораздо более длительную гипоксию, чем при нормальной температуре. Применение гипотермии (охлаждение до 20С) со вспомогательным искусственным кровообращением позволяет провести в один этап операции радикальные коррекции при сложных врождённых пороках сердца у грудных детей и детей раннего возраста. Однако на начальном этапе внедрения метода глубокой гипотермии возникновение ФЖ встречалось у больных с частотой до 20% [Волколаков, 1977].

Многие авторы указывают на то, что гипотермия способствует развитию нарушений ритма [Вайнер, 1982; Mortensen, 1993; Bjornstad, 1995; Johansson, 1996, Ujhelyi, 2001; Chorro, 2002]. Увеличение аритмогенности при гипотермии показано на морских свинках [Duker et al, 1983], кроликах [Перцов, Фаст, 1985], свиньях [Ujhelyi et al, 2001], собаках [Mortensen et al, 1993, Bjornstad et al, 1994]. В ряде работ в качестве экспериментальной модели ФЖ для тестирования антиаритмических препаратов предлагается использовать холодовые аритмии, так как вероятность их возникновения и воспроизводимость очень высоки [Bjornstad, 1995, Mortensen, 1993; Ujhelyi, 2001]. В то же время, в ряде работ отмечено, что при гипотермии не происходит увеличения уязвимости сердца к развитию нарушений ритма [Covino, D'Amato, 1962]. Более того, быстрое охлаждение до 27-24С может приводить к купированию ФЖ, вызванных при 37С [Covino, D'Amato, 1962].

По-видимому, проаритмический и антиаритмический эффекты гипотермии обусловлены различными изменениями функциональных характеристик миокарда, зависящих от скорости и продолжительности охлаждения и связанных с различной реакцией внутриклеточных процессов на понижение температуры (угнетение кинетических характеристик ионных каналов, фосфориллирование коннексинов, прогрессирующие нарушения Са -гомеостаза и процессов синтеза АТФ).

Мнение о том, что гипотермия создаёт благоприятные условия для развития и поддержания ФЖ, является общепризнанным [Johansson, 1996; Tachibana, 1999; Chorro, 2002]. В то же время, вопрос о спонтанном возникновении ФЖ во время гипотермии до сих пор остаётся открытым. В ряде экспериментальных работ показано, что возникновение ФЖ не является необходимым результатом охлаждения организма. Так, Kenyon J.R. и Ludbrook J. (1957) проводили охлаждение собак ниже 10С (4,7-7С) с последующим восстановлением до нормальной температуры. При этом развитие ФЖ наблюдалось в двух экспериментах из семи. В одном случае ФЖ возникала при охлаждении на фоне сниженного давления и спонтанно купировалась с восстановлением давления. В другом эксперименте развитие ФЖ произошло во время начальной фазы нагревания из-за большой скорости нагрева. Кобрин В.И. (1991) сообщает, что при охлаждении морских свинок наиболее часто наблюдалось значительное замедление ЧСС вплоть до остановки сердца при ректальной температуре 15-16С. Автор специально указывает на то, что ни в одном из опытов (п=27) общее охлаждение организма не приводило к возникновению ФЖ. В то же время, Nielsen с соавт. (1967) при охлаждении кошек наблюдали развитие ФЖ при 18-20С в 8 случаев из 10. Однако следует отметить, что в данной серии экспериментов для поддержания артериального давления животным вводили /?-агонисты, что, несомненно, могло повлиять на результаты работы и способствовать развитию ФЖ при гипотермии. То, что ФЖ необязательно сопутствует охлаждению, подтверждают работы, выполненные кардиохирургами при операциях по коррекции сложных врождённых пороков сердца с использованием методики глубокой гипотермии с вспомогательным искусственным кровообращением [Окатига, 1969; Shirotani, 1973; Волколаков, 1977]. В качестве профилактики возникновения ФЖ при операциях авторы советуют соблюдать методику охлаждения,

заключающейся в поддержании гомеостаза, соответствующей этапности и определённому режиму температуры тела. О важном значении соблюдения указанных требований свидетельствуют редко наблюдаемые случаи возникновения ФЖ или полное их отсутствие в работах, где проводилось соответствующая подготовка [Окатига, 1969; Shirotani, 1973; Волколаков, 1977].

1.2. Феномен гибернации.

В отличие от негибернирующих животных, сердце гибернирующих млекопитающих устойчиво к низким температурам и способно сокращаться даже при 0-7С. Нарушения проведения, а также ФЖ не развиваются ни при входе в состояние гибернации, ни при выходе из него, когда температура тела гибернанта может изменяться в течение нескольких часов более чем на 30С [Dave, Morrison, 1955; Жегунов, 1986; Eagles et al, 1988].

В природе существует широкий круг физиологических состояний сниженной жизнедеятельности: это анабиоз у простейших, период временного физического покоя у насекомых (диапауза), различные формы оцепенения у птиц и мелких млекопитающих и крайняя форма явления - зимняя спячка (гибернация) у холоднокровных и теплокровных [Колаева, 1993]. Сюда же относится и зимний сон медведя. Общее для всех этих состояний -обездвиженность (оцепенение) и значительное угнетение обмена веществ (окислительного метаболизма) [Колаева, 1993]. Отсюда и современное их название - природные гипометаболические состояния. Явление гибернации наблюдается у некоторых млекопитающих, обитающих в зоне с резкими колебаниями погодно-климатических условий, и является одной из форм приспособления к периодически меняющимся по временам года условиям среды. В холодное время года в связи с неблагоприятными условиями окружающей среды (низкие температуры и недостаток корма) гибернанты впадают в спячку. Гибернация довольно широко распространена среди млекопитающих: ежи, сурки, бурундуки, суслики, сони, летучие мыши, хомяки [Ануфриев, Ахременко, 1992].

Во время спячки животные стремятся уменьшить потерю энергии. Уровень метаболизма во время гибернации значительно снижается, составляя -1-4% от величины, наблюдаемой в состоянии активности [Ануфриев, 1992].

При этом температура тела может достигать 0С, число сердечных сокращений уменьшается от 300-700 уд/мин до 5-Ю уд/мин, число дыхательных движений сокращается от 100-150 в активном состоянии до 2-3 дв/мин; наблюдаются длительные паузы в дыхании [Dave, 1955; Duker, 1983; Burlington, 1989; Жегунов, 1986, 1988; Колаева, 1993].

Время гибернации составляет 6-8 месяцев (рис.1 А). Зимняя спячка не является непрерывным процессом, а состоит из циклов (баутов, их продолжительность составляет от семи до 30 дней), за которыми следуют кратковременные пробуждения (рис.1 Б) [Колаева, 1993]. Пробудившись, животные выводят из организма экскременты, могут принимать пищу [Ануфриев, Ахременко, 1992]. Процесс пробуждения происходит не более чем за 2-5 часа. За это время температура тела млекопитающих повышается на 30-35С, увеличенивается частота сердечных сокращений и дыхания до нормального уровня [Жегунов, 1986, 1988; Колаева, 1993]. Из безжизненного и холодного животное быстро превращается в активное, используя лишь собственные ресурсы и избегая патологических состояний. Частота и продолжительность погружений в спячку в течение зимы имеют свой ритм. Наиболее длительные погружения приходятся на середину зимы (рис.1 А). Глубокой спячке предшествует несколько пробных погружений, во время которых температура тела падает лишь до определённого уровня и снова возвращается к исходной (рис.1 А). Полагают, что биологический смысл этих погружений - проверка готовности всех физиологических систем организма к минимальному функционированию.

При общем снижении функциональной активности всех физиологических
процессов у гибернантов во время зимней спячки сохраняется
функционирование наиболее важных органов - сердца, головного мозга и
печени. Кровоснабжение этих органов является необходимым условием
сохранения жизни гибернантов и обусловлено адекватным

функционированием сердечно-сосудистой системы.

Механизм работы сердца в состоянии гибернации является предметом исследования уже более ста лет. Ещё в 1832 году Hall [цитировано по Dave, 1955] предположил, что поддержание сердечного выброса при экстремально низкой температуре во время гибернации обеспечивается гипервозбудимостью сердца. Отмечено, что сократительная функция изолированного сердца

Период летней

Активность между баутами

активности

20"

У

Ыщ&гЬц#*Ы^^!м\1Ш1#Г

Период гибернации

Ш*

ИИАСОНДЯФМАМ

2С

Дни спячки

Рис. 1. Изменение температуры тела сусликов Citellus undulatus во время зимней спячки (модифицированно по [Carey et al, 2003 ])

А: типичный образец изменения температуры тела суслика в течение 1 года. На графике видны пробные залегания в спячку в осенний период (снижение температуры тела до 10-5С). Во время зимней спячки суслики на короткое время периодически выходят из состояния гибернации.Продолжительность периодов спячки (баутов) изменяется в течение зимы: самые продолжительные бауты приходятся на самое холодное время (декабрь-февраль). Время (с июня по май) направлено по оси абсцисс, температура тела (0-40С) -по оси ординат.

Б: изменение температуры тела суслика в течение одного периода спячки (баута). Стрелками отмечены моменты входа в спячку и выхода из неё. Нарушения проведения, а также ФЖ не развиваются ни при входе в состояние гибернации, ни при выходе из него, когда температура тела гибернанта может изменяться в течение нескольких часов более чем на 30С [Saitongdee et al., 2000]. Время (6 суток) направлено по оси абсцисс, температура тела - по оси ординат.

гибернантов сохраняется при охлаждении до низких температур и при последующем восстановлении до нормальной температуры тела 37С [Burlington, 1989]. Несмотря на выявление нескольких типов аритмий, устойчивые желудочковые тахиаритмии, включая ФЖ, никогда не наблюдались у гибернирующих животных [Dave, 1955; Johansson, 1967; Eagles, 1988]. Ни при входе в гибернацию (постепенный процесс, 12-24 часов), ни при выходе из неё (2-4 часа) у животных не возникают блоки проведения или устойчивые желудочковые аритмии, несмотря на тот факт, что температура тела может меняться более чем на 30С за несколько часов [Жегунов, 1986; Johansson, 1996]. Несмотря на многолетние исследования проблемы гибернации, механизмы устойчивости сердца зимнеспящих животных к возникновению нарушений сердечной деятельности во время выраженной гипотермии остаются до конца неизвестными.

1.3. Электрофизиологические механизмы развития блоков проведения и аритмий при гипотермии. Устойчивость гибернирующих животных к возникновению нарушений ритма.

Несмотря на то, что ФЖ является самым опасным нарушением ритма сердца и изучению механизмов этой аритмии уделяется самое пристальное внимание со стороны ученых и клиницистов, природа ФЖ до конца не изучена. Известно, что процессы возникновения, поддержания и прекращения ФЖ определяются различными механизмами. В настоящее время принято считать, что механизм поддержания ФЖ обусловлен циркуляцией (re-entry) одной или нескольких волн возбуждения по желудочкам [Weiss, 2000; Ujhelyi el al, 2001; Efimov, 2003]. Кроме того, показано, что основным механизмом Холодовых аритмий также является циркуляция возбуждения [Перцов, Фаст, 1985; Bjomstad el al, 1994; Covino, D'Amalo, 1962; Ujhelyi el al, 2001]. Однако, нет единого мнения о механизмах, которые приводят к развитию ФЖ [Weiss, 2000; Qin, 2005].

Для возникновения циркуляции необходима функциональная неоднородность возбудимой среды - анизотропия проведения возбуждения и дисперсии рефрактерности. Основным фактором, определяющим возможность существования re-entry, является длина волны возбуждения, предложенная N. Wiener и A. Rosenblueth (1946) и вычисляемая как произведение рефрактерного

периода и скорости проведения [Перцов, Фаст, 1985; Smeets et al, 1986]. Чем короче длина волны, тем больше вероятность возникновения re-entry [Smeets et al, 1986; Byrd et al, 2005]. Считается, что аритмогенное действие гипотермии состоит в уменьшении длины путей для циркуляции возбуждения (контура reentry) и, как следствие, увеличении вероятности возникновения re-entry. Основную роль в этом процессе играет значительное угнетение проведения при охлаждении [Перцов, Фаст, 1985; Covino, D'Amato, 1962; Ujhelyi et al, 2001; Fedorov et al, 2005]. Таким образом, именно различный характер изменения скорости проведения и рефрактерности во время гипотермии приводит к укорочению длины волны, что способствует развитию циркуляции возбуждения и фибрилляции.

Возникновения нарушений ритма, вызванные циркуляцией волны возбуждения. В норме распространяющийся импульс исчезает сразу после последовательной активации предсердий и желудочков. Повторной активации сердца тем же импульсом препятствует только что деполяризованная ткань, находящаяся в рефрактерном состоянии. Феномен циркуляции возбуждения наблюдается в том случае, когда распространяющийся импульс не исчезает после полной активации сердца, а сохраняется, вновь возбуждая его после окончания рефрактерного периода. Для того чтобы это произошло, импульс должен не затухать, а оставаться в пределах сердца, пока в сердечных волокнах не восстановится возбудимость, и он сможет реактивировать их.

Основные принципы возникновения циркуляции сформулированы ещё в начале XX века в классических работах A. Mayer (1908) и G. Mines (1914). На рис.2 показаны этапы формирования контура циркуляции в кольце возбудимой ткани. При стимуляции кольца из точки стимуляции возникают две волны возбуждения, которые распространяются в противоположных направлениях по кольцу (рис.2А). При этом возбуждение возникает лишь однократно, так как волны сталкиваются и затухают. Однако при временном сдавливании ткани вблизи места стимуляции волна возбуждения распространяется лишь в одном направлении вдоль кольца, так как область сдавливания предотвращает проведение волны в другом направлении (рис.2Б). Волна, распространяющаяся в одном направлении, возвращается к точке стимуляции (на этот раз давление на

Стимул Стимул

Длина Волны = Скорость Проведения х Эффективный Рефрактерный Период

ДВ = СП х ЭРП = 100 см/сек х 0,2 сек = 20 см

Рис. 2. Циркуляция волны возбуждения (re-entry - повторный вход).

Циркуляция волны возбуждения в кольце возбудимой ткани (по Mayer и Mines) (А - В):

А - стимуляция кольца в точке, распространяющиеся импульсы сталкиваются;

Б - во время стимуляции на короткое время сдавливается заштрихованный участок,

при этом возбуждение распространяется только в одном направлении, так как

движение импульса блокируется в области сжатия;

В - т.к. кольцо больше не пережимается, импульс возвращается к исходной точке и

затем продолжает свое движение по кольцу, начинается циркуляция возбуждения.

Длинна волны (ДВ) для re-entry равна произведению скорости проведения возбуждения на эффективный рефрактерный период. Значения СП и ЭРП, взяты для нормальной ткани рабочего миокарда человека. Циркуляция возбуждения в кольце возможна только при условии, если ДВ меньше, чем путь, по которому движется волна (длина окружности - 2nR).

Два типа циркуляции волны возбуждения вокруг анатомического (Г) и функционального препятствия (Д). Стрелкой отмечено направление распространения волны. Черным закрашены участки ткани, находящиеся в состоянии абсолютной рефрактерное. Рядом с каждым участком показана фаза потенциала действия в данный момент.

Циркуляция возбуждения возможна только при наличии возбудимой щели между «головой» и «хвостом» волны.

ткань не производится), а затем снова проходит по кольцу (рис.2В). Импульс способен проходить по кольцу многократно раз, так как каждый раз при его возвращении к исходной точке возбудимость ткани в этой части кольца восстанавливается.

Необходимое условие для возникновения re-entry состоит в том, что в некоторой точке петли циркуляции волна возбуждения может проходить только в одном направлении. Это явления принято называть однонаправленным блоком проведения (рис.2Б). Причина, вследствие которой такое может произойти, заключается в том, что импульс, проводящийся в антероградном направлении, достигает зоны блока раньше, чем ретроградный импульс, так как последний проделывает более длинный путь. Следовательно, антероградный импульс может быть блокирован, так как он достигает области угнетения в течение фазы абсолютной рефрактерности. Если ретроградный импульс достаточно задержан по времени, то ткань может выйти из рефрактерного периода и сможет вновь возбудиться.

Однако однонаправленный блок проведения не является единственным условием для поддержания re-entry. Если контур циркуляции не, достаточно длинный, то волна возбуждения, проходящая в ретроградном направлении, пройдя место блока и вернувшись к началу своего пути, может затухнуть , так как ткань еще не успеет выйти из состояния рефрактерности. Таким образом, другим условием является требование, чтобы контур циркуляции был больше длины волны возбуждения, определяемой как произведение рефрактерного периода на скорость проведения (СП) [Wiener, Rosenbluelh, 1946].

В 1928 году F. Schmitt и J. Erlanger развили эти принципы и предположили, что циркуляция возбуждения может возникать в сердце млекопитающих не только вокруг анатомических препятствий в больших контурах, но и в очень небольших петлях, то есть в форме micro-reentry (рис.2Д). В 1964 году G.K. Мое сформулировал гипотезу о многоволновой природе поддержания фибрилляции. Группой Allessie М. были получены экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу [Allesie, 1985]. При картографировании левого предсердия кролика во время предсердной тахикардии, вызванной с помощью электрического экстрастимула, было отмечено, что импульс совершал не только круговое, но и центростремительное движение в разных направлениях. По мере приближения

к центру амплитуда и скорость подъема фазы 0 потенциала действия (ПД) понижались, и возбуждение затухало. Клетки в центре циркулирующей волны давали только локальный электрический ответ, поскольку они поддерживались в рефрактерном состоянии под воздействием поступающих с разных сторон импульсов. Место схождения этих импульсов служило функциональной основой для циркуляции волны возбуждения. Оно как бы заменяло анатомическое препятствие и защищало возбуждение от шунтирования. В 1992 году Davidenko JM с соавт. получили аналогичные результаты на желудочках.

Роль длины волны в существовании re-entry. Эффективный рефрактерный период в сердечных клетках длится от 150 мс (в предсердиях) до 300-500 мс (в специализированной проводящей системе желудочков). Поэтому импульс, обуславливающий циркуляцию возбуждения, должен сохраняться, по крайней мере, до окончания рефрактерного периода. Однако в течение этого времени импульс не может оставаться на одном месте, а должен продолжать свое движение по пути, функционально изолированному от остальных областей сердца. Такой путь проведения должен обеспечивать возможность возврата к ранее возбужденной области; он должен быть достаточно длинным, чтобы импульс распространялся по нему в течение всего рефрактерного периода. В норме импульс распространяется со скоростью от 0,5 до 2 м/с (за исключением волокон синусового и атриовентрикулярного узлов). Если бы он продвигался с такой скоростью в течение всего рефрактерного периода, он должен был бы пройти путь длиной от 7,5 см до 1 м. Существование столь длинного пути, пусть даже замкнутого, но находящегося в функциональной изоляции от остальных тканей сердца, никогда не представлялось возможным [Cranefield, 1971].

Однако распространение с нормальной скоростью не является единственным способом сохранения циркулирующего импульса во время рефрактерного периода: снижение скорости проведения устраняет необходимость такого длинного проводящего пути. Например, если проведение замедлено (до 0,02 м/с), импульс пройдет всего 6 мм в течение рефрактерного периода длительностью 300 мс [Cranefield, 1971], а такое расстояние уже сопоставимо с размерами сердца.

Укорочение длительности рефрактерного периода также может облегчить возникновение циркуляции. Например, уменьшение эффективного рефрактерного периода, обычно наблюдаемое при ускорении реполяризации ПД,

сокращает время, в течение которого импульс должен проводиться по функционально изолированному пути в ожидании восстановления возбудимости остальных областей сердца. Но изменения, происходящие с длительностью ПД и скоростью проведения при различных воздействиях на сердечную ткань, могут быть различными и поэтому необходимо учитывать их общий вклад в длину волны, поскольку именно она определяет возможность поддержания циркуляции. Понижение температуры сердца приводит к замедлению СП и увеличению рефрактерности [Duker et al, 1983; Smeets et al, 1986; Fedorov et al, 2005]. Однако эти два процесса могут иметь различную кинетику, и изменение длины волны может носить сложный характер.

1.3.1. Кальциевая перегрузка кардиомиоцитов при гипотермии

В последние несколько десятилетий была обоснована и тщательно изучена роль ионов кальция в регуляции различных видов клеточного метаболизма и в поддержании функциональной и морфологической стабильности клеточных мембран. Появились работы, в которых ключевая роль в регуляции внутриклеточных процессов, протекающих в клетке при различного рода повреждениях, отводилась именно нарушению обмена ионов кальция между цитозолем и внеклеточной средой [Hochachka, 1986; Ivanov, 2000; Wang, 2002]. Именно с нарушением внутриклеточного кальциевого гомеостаза связывают возникновение нарушений ритма сердца и повреждение кардиомиоцитов при гипотермии [Chao, 1959; Wang et al, 1999; Lakatta, 1992]. Внутриклеточная перегрузка Ca⁺ кардиомиоцитов способствует развитию триггерной активности по механизму ранних и/или задержанных постдеполяризаций и может провоцировать жизнеугрожающие аритмии. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция выше нормального диастолического уровня может привести к осцилляторному выбросу Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума, что приведёт к возникновению временного входящего тока в фазу 2 или 3 ПД (ранние постдеполяризации) или в фазу 4, после окончания реполяризации (задержанные постдеполяризации) [Wit, Rosen, 1992]. При достаточно большой амплитуде постпотенциала достигается порог возбуждения и возникает ПД, не вызванный внешним стимулом. В развитии ранних постдеполяризаций важную роль играет 1с_а, обеспечивающий генерацию ПД с низкого уровня мембранного потенциала. Кроме того, на

появление ранних постдеполяризаций могут влиять все другие токи, участвующие в формировании фаз 2 и 3 потенциала действия и определяющие длительность (фазу плато) ПД, в том числе токи lNa,s, Ik, Ito и другие. По своему механизму аритмии по типу ранних постдеполяризаций во многих случаях сходны, по-видимому, с автоматией на низком уровне мембранного потенциала.

Задержанные постдеполяризации, возникающие в фазе 4 потенциала действия при внутриклеточной перегрузке Са²⁺, связывают с (1) Са²⁺-зависимым открыванием неспецифических каналов, пропускающих ионы Na⁺ и К⁺, в результате чего возникает транзиторный входящий ток I_tj; и/или с (2) работой Ма⁺/Са²⁺-обмена, формирующего ток Ішса [Гренадер, 1987; Wit, Rosen, 1992; Кушаковский, 1996]. Кроме того, перегрузка Са²⁺ может приводить к дефосфориллированию коннексинов и вызывать межклеточное разобщение кардиомиоцитов, также способствуя развитию аритмий [Strinivas et al, 2004].

В ряде работ показано, что перегрузка Са при гипотермии происходит у негибернирующих животных [Жегунов, 1993; Wang et al.„ 2002]. Показано, что у крыс при понижении температуры от 30~35С до 5-10С [Ca²⁺]j увеличивается от 140 нМ до 200-300 нМ [Liu el al, 1991; Wang and Zhou, 1999]. В то же время, сердце гибернирующих животных демонстрирует поразительную устойчивость кальциевого гомеостаза к гипотермии. Так, Wang с соавт. (1999) сообщают о незначительных изменениях [Са ]j в кардиомиоцитах суслика Spermophilus dauricus в диапазоне температур 30-10С [Wang et al, 1999]. Более того, сердечная мышца суслика (а также гибернирующего ежа) развивает более высокую сократимость в низких температурах по сравнению с 37С [Liu et al, 1990; Wang et al, 1997], что может являться адаптивным механизмом, направленным на поддержание адекватного кровоснабжения организма в условиях повышенной вязкости крови и увеличенного сопротивления периферических сосудов во время гипотермии.

Поддержание кальциевого гомеостаза у гибернирующих животных в условиях выраженной гипотермии может определяться рядом взаимодействующих факторов: особенностями регуляции энергетического

метаболизма, перестройкой работы Са -транспортирующих систем кардиомиоцитов, а также изменениями экспрессии белков, формирующих ионные каналы и насосы, которые осуществляют транспорт Са ⁺.

1.3.1.1. Особенности энергетического метаболизма у гибернантов.

Для поддержания кальциевого гомеостаза на постоянном уровне
требуются существенные затраты АТФ. Так, например, перемещение каждого
иона кальция из цитозоля в межклеточную среду с помощью Са²⁺-АТФазы
нуждается в гидролизе одной молекулы АТФ [Иванов, 1999]. У
негибернирующих млекопитающих продолжительное охлаждение вызывает
угнетение синтеза АТФ в митохондриях, что ведёт к дефициту энергии
[Hochachka, 1986; Boutilier, 2001]. Это связано с изменением энергетического
метаболизма при действии холода, сопровождающимся увеличением вклада в
процесс теплообразования не зависящих от АТФ экзотермических реакций.
Происходит разобщение процессов окисления и фосфорилирования в
митохондриях. Таким образом, снижается эффективность

специализированного преобразования энергии, однако возрастает продукция теплоты. Низкая эффективность окислительного фосфорилирования окисления снижает уровень продуцируемого АТФ, приводит к истощению запасов макроэргических соединений и ограничивает нормальную работу сердца (обеспечение биосинтеза, активного транспорта и мышечной работы). При таком дефиците энергии прежде всего нарушаются физиологические функции клеток, которые осуществляются с наибольшим потреблением энергии. Прежде всего, снижается сократимость сердечной мышцы. Кроме того, нарушается работа активного ионного транспорта в кардиомиоцитах и происходит деполяризация клеток, вызванная увеличением внутриклеточной концентрации Na и Са [Hochachka, 1986; Ivanov, 2000; Boutilier, 2001].

У зимнеспящих животных, в отличие от негибернирующих млекопитающих, существуют особенности в регуляции энергетического метаболизма, которые позволяют избежать истощения запасов АТФ во время гипотермии. Существенным компонентом адаптивной специализации метаболизма у гибернантов является увеличение массы бурой жировой ткани. Бурая жировая ткань представляет собой разновидность жировой ткани, главная функция которой заключается в генерации тепла и регуляции энергетического метаболизма за счёт высокой мощности несопряжённого окисления в митохондриях [Брустовецкий и др., 1987; Drahota, Jezek, 1990]. Высокая физиологическая эффективность теплообразования в буром жире

обусловлена наличием в митохондриях специализированного механизма, в основе которого находится разобщение окисления от синтеза АТФ с помощью специфического белка внутренней мембраны митохондрий термогенина [Физиология терморегуляции, 1984; Nicholls, 1984; Drahota, Jezek, 1990; Медведев, 2002], или, по новой терминологии, разобщающего белка 1 (РБ1). Функционально активный РБ1, представляющий собой протонофор белковой природы, является гомодимером с молекулярной массой субъединиц 32-33 кД [Viguera, Goni, 1992]. Он непосредственно шунтирует транспорт Н⁺ в матрикс митохондрий в обход АТФ-синтазы, тем самым трансформируя подавляюще большую часть энергии электоромеханического потенциала Н⁺ в тепло [Milner etal, 1989; Drahota, Jezek, 1990; Viguera, Goni, 1992].

Показано, что эффективная протонная проводимость митохондрий бурой жировой ткани печени у гибернанта (хомяка) на два порядка выше, чем у негибернанта (крыса) [Физиология терморегуляции, 1984]. Соответственно трансмембранный потенциал протонов существенно ниже, а уровень дыхания митохондрий - выше. При действии холода в буром жире происходит повышение активности окисления ацилкоэнзима А, возрастают васкуляризация и кровоток, что способствует согреванию жизненно важных органов передней половины тела животного [Барбараш, 1996].

Несмотря на относительно небольшие размеры (до 5% от веса тела), у гибернантов вклад бурой жировой ткани в усиление несократительного термогенеза при холодовом воздействии достигает 60-70% [Медведев, 2002]. Это позволяет другим органам и тканям, в том числе сердцу, не увеличивать продуцирование теплоты, а направлять энергию окисления макроэргических соединений на фосфорилирование АТФ, необходимого для адекватного обеспечения биосинтеза, активного транспорта и мышечной работы.

1.3.1.2. Са²⁺-транспорирующие системы кардиомиоцитов.

Вход ионов Са²⁺ через сарколемму. Основной вход Са²⁺ в кардиомиоциты из внеклеточной среды происходит через специальные ионные каналы, высоко селективные к ионам кальция. Существуют по крайней мере четыре различных типа Са -каналов, отличающихся по фармакологическим и биофизическим свойствам: L, Т, N и Р. Однако в сарколемме кардиомиоцитов обнаружены только L- и Г-типы каналов, активация и инактивация которых происходит при

различных уровнях мембранного потенциала. Амплитуда низкопорогового тока 1с_а,т составляет около 20% от амплитуды высокопорогового тока 1с_а,ь [Hagiwara et al, 1988; Irisawa et al, 1990]. Поэтому более важную роль в осуществлении входа кальция в кардиомиоциты играют каналы Z-типа или медленные кальциевые каналы.

Ток 1са,ь активируется при относительно высоком пороговом потенциале -40 мВ и достигает максимума при мембранном потенциале от 0 до +10 мВ, после чего происходит инактивация. В истинных пейсмекерных клетках Ic_a,L полностью формирует передний фронт ПД (фаза 4), и в связи с тем, что ток активируется относительно медленно, передний фронт клеток синусовго узла пологий (V_max от 1 до 5 В/с). 1с_а,ь присутствует в клетках предсердий, желудочков и проводящей системы Гиса-Пуркинье, где участвует в формировании плато ПД (фаза 2). Он также является триггером для

лавинообразного выхода Са из саркоплазматического ретикулума. Большое

Л_|_

количество свободного Са в цитозоле активирует миофиламенты, вследствие чего происходит сокращение.

Второй тип кальциевых каналов, обнаруженный в сердце, это Г-каналы. В отличие от каналов Z-типа для активации Z-каналов необходима меньшая величина деполяризации мембраны, а инактивируются они быстрее. Каналы Т-типа локализованы главным образом в предсердиях и клетках синоатриального узла. В желудочках активность Г-каналов низкая, за исключением случаев гипертрофии левого желудочка.

Liu с соавт. (1991) сообщают об устойчивости амплитуды 1с_а,ь к понижению температуры [Liu, 1991]. В то же время авторы отмечают значительное изменение кинетических характеристик I_CaiL. При понижении температуры у негибернирующих животных (крыс) происходит замедление активации и инактивации Са²⁺-тока, а также уменьшение максимальной амплитуды 1с_а. Скорость активации и инактивации Са -тока у зимнеспящих

ЄЖЄЙ также Замедляется При ПОНИЖеНИИ Температуры, ОДНаКО Ica,peak

значительно не меняется при понижении температуры до 10С [Liu, 1991].

Не смотря на то, что существенных различий в работе кальциевых каналов Z-типа у гибернантов (S. richardsonii) и негибернантов (морская свинка) не было выявлено [Herve et al, 1992], имеются основания полагать, что во время гибернации транспорт Са²⁺ через сарколемму значительно

изменяется. Так, форма потенциала действия у гибернирующих сусликов, сурков и ежей характеризуется отсутствием фазы плато, характерной для негибернирующих животных [Wang et al, 1995; Johansson, 1996; Fedorov et al, 2005]. Кроме того, у гибернантов наблюдается снижение чувствительности электрической и механической активности кардиомиоцитов к действию антагонистов Са²⁺-каналов /,-типа (нифедипин, Cd²⁺) по сравнению с негибернирующими животными [Kondo, Shibata, 1984; Kondo, 1986; Wang et al, 1995]. Также сообщается об уменьшении пиковой величины Іс_а,ь У гибернирующих сурков по сравнению с активными животными [Yatani et al, 2004]; при этом существенных изменений в вольтамперной характеристике 1с_а,ь между двумя группами животных не отмечается. Подобные изменения 1с_а,ь наблюдались также у гибернирующих сусликов [Alekseev et al, 1997]. Все эти данные свидетельствуют об уменьшении входа Са⁺ в клетку во время гибернации. Yatany с соавт. (2004) обнаружили, что у гибернирующих сурков по сравнению с активными животными наблюдается пониженная плотность а-субъединицы Са²⁺-канала Z-типа, которая формирует проводящую пору канала [Yatani et al, 2004]. Можно предполагать, что когда животное входит в состояние гибернации, происходит ремоделирование ионных каналов, что приводит к подавлению входящего 1са,ь тока. Это помогает защитить сердце гибернантов во время спячки от кальциевой перегрузки. Кроме того, у гибернирующих сусликов {Citellus undulatus) обнаружен сдвиг порога активации Z-типа Са²⁺-каналов в сторону положительных потенциалов [Alekseev et al, 1996], что будет препятствовать спонтанной активации кальциевых каналов при частичной деполяризации кардиомиоцитов во время гипотермии и способствовать поддержанию ионного градиента [Willis, 1979; Wang, 1988; Wangetal, 2002].

Системы транспорта Са в саркоплазматическом ретикулуме. Существуют два основных механизма удаления избытка Са²⁺ из клетки. Первый состоит во временном депонировании избытка этих ионов в саркоплазматическом ретикулуме с помощью специального фермента Са ⁺-АТФазы (SERCA), второй - удаление Са²⁺ во внеклеточное пространство с помощью Са²⁺-АТФазы (РМСА) и Na⁺/Ca²⁺ обмена [Clapham, 1995; Berridge et al, 2000]. В кардиомиоцитах депонирование кальция в саркоплазматическом ретикулуме является основным механизмом быстрого удаления Са⁺ из

цитозоля, обеспечивая около 70-92% утилизации катиона при каждом цикле электро-механического сопряжения [Bers, 2000].

Во многих работах показано, что при уменьшении температуры у негибернирующих животных происходят нарушения функционирования Са²⁺-транспортирующих систем саркоплазматического ретикулума [Жегунов, 1993; Ыи, 1997]. И у крыс, и у сусликов {Citellus dauricus) при охлаждении происходит монотонное замедление скорости релаксации после сокращения. Однако у сусликов скорость релаксации выше во всём диапазоне исследуемых температур (35С - 10С) [Wang et al, 1997]. Измерения [Ca²⁺]i свидетельствуют о более быстром восстановлении кальциевого гомеостаза у сусликов по сравнению с крысами благодаря более быстрой утилизации кальция в саркоплазматическом ретикулуме [Wang et al, 2000], что может свидетельствовать об адаптационных изменениях в работе Са²⁺-транспортирующих систем саркоплазматического ретикулума у гибернантов.

Электронно-микроскопические данные и результаты морфометрического анализа желудочковых кардиомиоцитов гибернирующего суслика Citellus dauricus [Rosenquist, 1970; Tang el al., 1995] и хомяка [Skepper, Navaratnam, 1995] свидетельствуют о двух-трёх кратном увеличении объёма саркоплазматического ретикулума по сравнению с негибернирующими животными. Причём наблюдается преимущественно увеличение продольной части саркоплазматического ретикулума, которая содержит Са²⁺-АТФазу и обеспечивает депонирование Са²⁺. При этом объём переходной части саркоплазматического ретикулума, обеспечивающей выброс кальция через Са²⁺-зависимые Са²⁺ каналы при сокращении, изменяется слабо [Tang et al, 1995; Skepper, Navaratnam, 1995].

Обнаружено, что уровень откачки Са в саркоплазматический ретикулум у сусликов значительно выше, чем у крыс как при 37С, так и при 5С [Ыи et al, 1997]. Везикулы саркоплазматического ретикулума, изолированные у зимнего гибернирующего суслика, проявляют более высокую скорость

утилизации Са и больший объём депонирования Са по сравнению с сусликами, находящимися в других состояниях активности (летние и зимние активные животные) [Belke et al, 1991; Tang et al, 1995]. Для суслика зависимость уровня утилизации Са²⁺ при охлаждении носит линейный характер от температуры. Для крыс зависимость скорости утилизации кальция

в саркоплазматическом ретикулуме при температурах ниже 15С отклоняется от линейной и начинает резко падать [Liu et al, 1997]. Это свидетельствует о развитии прогрессирующих нарушений в работе саркоплазматического ретикулума у крыс при низких температурах [Liu, 1997].

Захват Са⁺ саркоплазматическим ретикулумом осуществляется с помощью Са²⁺ -стимулируемой Mg^-зависимой Са²⁺-АТФазы (SERCA).

Согласно биохимическим данным, Са*-АТФаза ретикулума обладает более высоким сродством к Са ⁺ и имеет более высокую скорость поглощения

цитоплазматического кальция по сравнению с Са -АТФазой сарколеммы. Эти свойства позволяют SERCA играть ведущую роль в удалении Са²⁺ из цитоплазмы при расслаблении. Во время каждого каталитического цикла

9+

SERCA транспортирует два иона Са из цитоплазмы в цистерны саркоплазматического ретикулума, при этом расходуется одна молекула АТФ.

Снижение эффективности транспорта Са²⁺ может быть вызвано повреждением бислоя мембран или самой молекулы АТФазы и увеличением пассивного оттока аккумулированного кальция. Повреждение мембран может быть связано с нарушением белок-липидных взаимодействий, активации перекисных процессов или фосфолипаз. Несмотря на это сердце крысы in situ способно функционировать при 19С некоторое время, однако прогрессирующее повреждение Са -насоса мембран саркоплазматического ретикулума может приводить к быстрой утилизации АТФ Са²⁺-АТФазой, и к

нарушению гомеостаза Са в клетках [Жегунов, 1993].

Не смотря на то что во время гибернации активность Са²⁺-транспортирующих систем саркоплазматического ретикулума увеличивается, ферментативная активность SERCA не изменяется [Belke et al, 1991]. Во время гипотермии активность Са²⁺-АТФазы в мембране саркоплазматического ретикулума снижается и у сусликов, и у крыс. Liu с соавт. (1997) показали, что снижение активности Са²⁺-АТФазы у крыс происходит в гораздо большей степени по сравнению с сусликами (S. richardsonii) [Liu et al, 1997]. Тем не менее, увеличение аккумулирующей способности саркоплазматического ретикулума во время гибернации за счёт изменения свойств SERCA объяснить нельзя.

В основном Са²⁺ запасается в саркоплазматическом ретикулуме в

ионизированной форме. Однако часть ионов связывается с Са -связывающими

мембранными белками ретикулума. Среди этих белков наиболее важными являются калсеквистин и калретикулин. Главная роль этих белков состоит в поддержании концентрации свободного кальция внутри саркоплазматического

ретикулума. Кроме того, Са -связывающие белки снижают концентрацию
свободного Са ⁺ в цистернах ретикулума, тем самым способствуя дальнейшему
захвату кальция Са²⁺-АТФазой и увеличивая аккумулирующую способность
ретикулума. Кроме того, калсеквистин напрямую регулирует утечку и
выделение Са ⁺, непосредственно связываясь с рианодиновыми рецепторами
на мембране саркоплазматического ретикулума [Sitsapesan, Williams, 1977]. С
помощью электронной микроскопии Rosenquist (1970) обнаружил, что
терминальные цистерны саркоплазматического ретикулума, выделенного из
сердца гибернирующих сусликов, имеют более высокую электронную
плотность по сравнению с негибернирующими сусликами. Этот факт может
свидетельствовать об увеличенной экспрессии калсеквистина во время
гибернации. Кроме того, у двух видов сусликов обнаружена новая изоформа
калсеквистина, молекулярная масса которой на 7% больше по сравнению с
изоформой, выделенной у других животных [Milner et al, 1991]. Возможно,
более высокая молекулярная масса обусловлена наличием дополнительной
углеводородной цепи, увеличивающей связывание Са²⁺ с калсеквистином.
Таким образом, увеличение аккумулирующей способности

саркоплазматического ретикулума гибернирующих животных обусловлено наличием модифицированной изоформы калсексистина, который также препятствует утечке кальция и способствует увеличению количества кальция, выделяемого при сокращении [Wang et al, 2002].

Уменьшение входа кальция через Са²⁺-каналы Z-типа саркоплазматической мембраны кардиомиоцитов во время гибернации должно приводить к снижению сократимости сердечной мышцы. Однако, у гибернирующих сусликов, наоборот, наблюдается более высокая амплитуда сокращения по сравнению с негибернирующими животными [South, Jacobs, 1973; Wang, 1988]. Рост сократимости может быть связан с увеличенным выбросом кальция в цитозоль или с увеличением чувствительности

миофиламентов к [Са ]\. Однако, отмечается достоверное снижение чувствительности Са²⁺-каналов к внутриклеточной концентрации Са²⁺, происходящее как у гибернирующих, как и у негибернирующих

млекопитающих [Khromov et al, 1990; Liu et al, 1993]. При частичном ингибировании функций ретикулума у гибернирующих и негибернирующих бурундуков [Kondo, Shibata, 1984] и сусликов (Citellus richardsonti) [Zhou et al, 1991] кофеином или рианодином, у гибернирующих животных наблюдается большее ингибирование сокращения сердечной мышцы. Во время гибернации происходит ремоделирование электро-механического сопряжения таким образом, что меньшая концентрация Са ⁺ вызывает большее высвобождение Са из саркоплазматического ретикулума.

Роль Na⁺/Ca ⁺ обмена. Ток Na⁺/Ca ⁺-насоса (Wca) формируется за счёт электрогенного Na+/Ca²⁺ транспорта, за один цикл работы которого происходит обмен через клеточную мембрану 3-х ионов Na⁺ внутрь на один Са²⁺. Направление Іма/са зависит от градиента ионов Na⁺ и Са²⁺. Во время диастолы Na⁺/Ca²⁺ обмен генерирует небольшой входящий ток. После быстрой деполяризации (фаза 0) I_Na/c_a может на короткое время быть выходящим, затем, когда внутриклеточная концентрация Са²⁺ увеличивается, он становится входящим. Таким образом, I_Na/c_a принимает важное участие в формировании плато потенциала действия клеток рабочих кардиомиоцитов. В связи с тем что работа Ш⁺/Са²⁺-обменника непосредственно не связано с гидролизом АТФ, концентрация которого уменьшается при гипотермии, было предложено, что Na⁺/Ca²⁺-Hacoca играет важную роль в транспорте Са²⁺ во время гибернации. В подтверждении этой гипотезы приводился тот факт, что у гибернирующих бурундуков [Kondo, 1987] и сусликов [Wang et al, 1995] форма потенциала действия характеризуется наличием увеличенного низкоамплитудного плато, чувствительного к изменению внеклеточной концентрации Са²⁺ и Na⁺. Однако при последующем изучение механизмов откачки Са²⁺ из клетки, как у сусликов, так и у крыс, ведущая роль Ыа⁺/Са²⁺-обменника в поддержании кальциевого гомеостаза во время гипотермии не подтвердилась. Наоборот, показано, что при низких температурах относительный вклад Na⁺/Ca²⁺-обменника у сусликов даже уменьшается по сравнению с крысами [Wang et al, 2000]. Более того, обнаружено, что температурный коэффициент для Na⁺/Ca²⁺-обменника больше, чем для SERCA, которая переносит два иона Са²⁺ при гидролизе одной молекуле АТФ, в то время как На⁺/Са²⁺-обменник

9+

обеспечивает перенос только одного иона Са на одну АТФ (при этом в клетку переносится 3 иона Na⁺, которые затем выкачиваются из клетки Na⁺/K⁺-

АТФазой с затратой одной АТФ) [Bers, 2000].

Таким образом, на основании вышеизложенных результатов, можно предположить, что поддержание кальциевого гомеостаза у гибернирующих животных во время гипотермии обусловлено рядом адаптационных изменений

9+

в энергетическом метаболизме и работе Са -транспортирующих систем кардиомиоцитов. Основная стратегия заключается в уменьшении входа Са²⁺ в клетки при увеличении откачки Са²⁺ из цитозоля во внутриклеточные запасники и внеклеточную среду. В процессе утилизации внутриклеточного кальция ведущую роль играет саркоплазматический ретикулум. При частичном ингибировании функций ретикулума кофеином у сусликов происходит снижение устойчивости кардиомиоцитов в гипотермии, а также наблюдаются кальциевые перегрузки, характерные для негибернирующих животных [Kondo and Shibata, 1984]. Напротив, неполная блокада Іс_а,ь У крыс предотвращает многие отрицательные эффекты гипотермии, связанные с кальциевыми перегрузками клеток [Wang et al, 2002]. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что механизм устойчивости гибернирующих животных к кальциевым перегрузкам не является уникальным, характерным только для гибернантов. Понимание механизмов, обеспечивающих поддержание ионного гомеостаза кардиомиоцитов у гибернантов в условиях выраженной гипотермии, позволит выделить новые мишени для фармакологического воздействия и помочь в разработке новых лекарственных препаратов, повышающих устойчивость негибернирующих организмов, включая человека, к экстремальным воздействиям.

1.3.2. Проведение возбуждения

Механизмы устойчивости гибернирующих животных к вызванным гипотермией блокам проведения и тахиаритмиям остаются до конца неизвестными [Johansson, 1996; Opthof Rook, 2000].

Duker с соавт. (1983) впервые предположили, что различная устойчивость гибернирующих и негибернирующих животных к желудочковым тахиаритмиям, включая ФЖ, обусловлена, главным образом, различиями в скорости проведения. Duker с соавт. (1987) показали, что СП, оцениваемая по времени нарастания монофазного потенциала действия и по интервалу QRS, значительно сильнее уменьшалась при гипотермии (16С) у негибернантов

(морская свинка), чем у гибернантов (еж). При снижении температуры тела от 35С до 16С интервал QRS у морской свинки увеличивался на 80 %, а у ежа -только на 30 %. Однако, данные по скорости проведения возбуждения по миокарду гибернантов при низкой температуре немногочисленны [Opthof, Rook, 2000].

Необходимо отметить, что для возникновения ФЖ важно не просто уменьшение СП, а наличие неоднородного проведения возбуждения (анизотропии) по миокарду. Уменьшение СП и/или увеличение анизотропии проведения может происходить при значительном ослаблении деполяризующих токов или при существенном межклеточном разобщении [Bakauskas, 1993; Shaw, Rudy, 1997; Opthof, 2000; Kleber, Rudy, 2003].

1.3.2.1. Роль деполяризующих токов в распространении ПД

Распространение возбуждения по сердечному волокну зависит от нескольких взаимодействующих факторов: пассивных и активных свойств клеточных мембран, электрического сопряжения клеток, а также от анатомических особенностей миокарда [Gettes et al, 1985; Quan, Rudy, 1990; Kleber, Rudy, 2003]. В рабочем миокарде максимальная скорость нарастания фронта ПД (V_max) отражает максимальную проницаемость мембраны для Na⁺; таким образом, 1ы_а определяет генерацию ПД и скорость его распространения [Гофман, Крейнфилд, 1962; Buchanan et al, 1990]. Возбуждение в синоатриальном и атриовентрикулярном узлах зависит от медленного входящего 1са,ь поэтому в этих тканях наблюдается «медленный ответ» с низкой Vmax и малой скоростью распространения (0,01 - 0,2 м/с), а также с высокой вероятностью декременти ого проведения и блока [Gettes et al, 1985]. Таким образом, различные факторы, приводящие к уменьшению активации 1ы_а и 1са,ь, будут замедлять СП.

Функционирование всех потенциал-зависимых ионных каналов, в том числе натриевых и кальциевых, зависит от уровня трансмембранного потенциала. Поддержание определённого баланса внутриклеточных ионов (К⁺, Na , Са и СГ) обеспечивают ионные насосы, для работы которых требуется гидролиз АТФ, и обменники, являющиеся вторичным активным транспортом.

В сердечных клетках присутствуют, по крайней мере, два АТФ-зависимых электрогенных насоса: Na⁺/K⁺~Hacoc и Са²⁺-АТФаза. Однако

основной вклад в поддержание трансмембранного потенциала покоя обеспечивает именно работа Na /К⁺-насоса, осуществляющего активный транспорт ионов Na⁺ и К⁺ через клеточную мембрану. За один цикл работы насоса переносится 3 иона Na⁺ из клетки и 2 К⁺ внутрь клетки, таким образом генерируя выходящий ток - 1ыа/критр [Gaclsby et al, 1987]. Работа Na⁺/K⁺-Hacoca зависит от концентрации Na⁺ внутри клетки и от уровня трансмембранного потенциала [Gadsby el al, 1987].

При понижении температуры у негибернирующих млекопитающих происходит частичное ингибирование работы Na⁺/K⁺-Hacoca [Glitsch, 1984; Lee, 1996; Boutilier, 2001]. Ингибирование Na⁺/K⁺-Hacoca может быть непосредственно связано с охлаждением [Glitsch, 1984; Lee, 1996] или происходить опосредованно при снижении количества продуцируемого АТФ, связанного с изменением энергетического метаболизма при действии холода (см. раздел 1.3.1.) [Hochachka, 1986; Boutilier, 2001]. Увеличение внутриклеточной концентрации Na приводит к деполяризации мембраны при гипотермии [Marshal, 1962; Jacobs, 1976; Herve, 1992; Wang, 1997]. Кроме того, накоплению внутриклеточного натрия также способствует работа Na /Н⁺-обменника, который активируется при закислении цитозоля в результате гипоксии и переключения энергетического метаболизма на анаэробный путь [Plesnila, 2000]. Это означает, что необходимая разность электрических потенциалов между внутренней и наружной поверхностью мембраны (ионный градиент) в состоянии покоя при гипотермии не поддерживается [Hochachka, 1986; Liu, 1987; Boutilier, 2001; Wang, 2002]. Смещение потенциала покоя в более положительную область, в первую очередь, уменьшает количество работающих Ш⁺-каналов и, соответственно, амплитуду и скорость распространения ПД.

У гибернирующих млекопитающих при понижении температуры сохраняется функционирование Na /К -насоса [Willis, 1979; Lymann, 1982; Wang, 1988; Willis, 1992; Wang, 2002], что определяет большую устойчивость потенциала покоя к гипотермии [Marshall, Willis, 1962; Liu et al, 1987]. Поддержание уровня трансмембранного потенциала во время гипотермии продемонстрировано во многих работах [Marshall, Willis, 1962; Liu et al, 1987; Wang et al, 1997; Fedorov et al, 2005]. В нашей лаборатории с помощью микроэлектродной техники проведено сравнительное исследование влияния

охлаждения на параметры ПД изолированной папиллярной мышцы кроликов и сусликов в различных состояниях активности (летние активные, зимние гибернирующие и зимние проснувшиеся суслики) [Fedorov еї al, 2005]. Понижение температуры приводило к деполяризации клеточной мембраны, уменьшению амплитуды ПД и максимальной скорости нарастания переднего фронта ПД, как у кроликов, так и у сусликов. Эти изменения были более выражены у кроликов. Кроме того, у кроликов наблюдалось значительное увеличение пороговой амплитуды стимуляции при понижении температуры ниже 27С, а при охлаждении до 15 - 10С препарат папиллярной мышцы кролика переставал отвечать на стимуляцию амплитудой 20 В. В то же время, у сусликов даже при 7С порог стимуляции увеличивался не более чем в два раза по сравнению с 37С [Fedorov el al, 2005].

Достоверные изменения потенциала покоя у кроликов наблюдались уже при 17С, в то время как у сусликов (в каждом из трех состояний) снижение потенциала покоя происходило лишь при 7С. При этом у сусликов потенциал покоя поддерживался на уровне не менее 70% от величины, наблюдавшейся при 37С. У кроликов же потенциал покоя снижался более значительно - от -84 мВ при 37С до -37мВ при 7С. При таком уровне трансмембранного потенциала натриевые каналы оказываются инактивированны, и в сердце происходит полное подавление электрической активности. Кроме того, обнаружено, что у зимних гибернирующих сусликов при 37С - 17С потенциал покоя достоверно ниже по сравнению с летними активными сусликами.

Аналогичные изменения обнаружены и для амплитуды ПД. При охлаждении ниже 27С у кроликов происходило резкое снижение амплитуды ПД, тогда как у сусликов амплитуда ПД была более устойчива к гипотермии и достоверные изменения наблюдались лишь при 7С. Однако и при 7С у сусликов амплитуда ПД оставалась достаточно высокой (около 75 мВ, в то время как у кроликов уже при 17С - около 65 мВ). В то время как в папиллярной мышце кролика при охлаждении ниже 15 - 10С происходило полное подавление электрической активности и ПД не регистрировался [Fedorov et al, 2005].

Также об угнетении работы натриевых каналов при охлаждении свидетельствует уменьшение скорости нарастания переднего фронта ПД,

которое происходит сразу после начала охлаждения и уже при 27С достигает достоверных изменений. Однако начиная с 27С у кролика этот процесс более выражен: при 17С dV/dT_max у кролика уменьшается до 8±2 В/с, тогда как у сусликов подобные изменения наблюдаются при температурах около 7С.

Все эти данные свидетельствуют о значительном угнетении работы быстрых натриевых каналов во время гипотермии у негибернирующих животных, что приводит к полному подавлению электрической активности кардиомиоцитов (невозможности генерировать ПД).

Однако необходимо заметить, что достоверные изменения уровня потенциала покоя происходят только при охлаждении ниже 27С, тогда как dV/dT_max уменьшается уже начиная с 37С. Таким образом, снижение натриевого тока, по-видимому, происходит не только вследствие деполяризации мембраны. Действительно, в ряде работ показано, что гипотермия может непосредственно влиять на кинетические характеристики ионных токов, оказывая различные эффекты на гибернантов и негибернантов [Dudel, 1970; Colatsky, 1980; Liu, 1991; Herve et al, 1992]. Понижение температуры приводит к сдвигу кривой активации для натриевого тока (зависимости количества способных к активации натриевых каналов от уровня трасмембранного потенциала) в сторону отрицательных потенциалов [Colatsky, 1980; Liu, 1991]. Так, если при 37С полная инактивация Ыа⁺-каналов происходит при мембранном потенциале, равном -40 мВ, то при понижении температуры до 20С порог инактивация достогает -60 мВ, -70 мВ при 15 С и -90 мВ при 10С [Colatsk}>, 1980; Liu, 1991]. Таким образом, при гипотермии необходим более отрицательный потенциал покоя для активации натриевых каналов. Сдвиг кривой активации для натриевого тока в более отрицательную сторону характерен как для незимнеспящих животных (кролик [Colatsky, 1980], крыса [Liu, 1991], овца [Colatsky, 1980; Dudel, 1970]), так и для зимнеспящих (еж [Liu, 1991]). Однако, если при 20С порог инактивации 1ы_а одинаков для крысы и ежа и, то при дальнейшем понижении температуры натриевые каналы в мембране кардиомиоцитов ежа оказываются менее чувствительными к холоду [Liu, 1991].

При понижении температуры происходит замедление активации и инактивации Na⁺-TOKa, а также уменьшение максимальной амплитуды 1к<_а [Liu, 1991; Colatsky, 1980]. Эти температурные эффекты менее выражены в

кардиомиоцитах гибернирующих млекопитающих, что позволят им сохранять амплитуду ПД и, следовательно, адекватную сердечную деятельность в условиях выраженной гипотермии.

Таким образом, влияние температуры на натриевый ток определяется двумя основными процессами: прямое изменение свойств натриевых каналов и снижение величины мембранного потенциала. Всё это приводит к снижению амплитуды и скорости распространения ПД. Эти изменения более выражены у негибернирующих животных.

1.3.2.2. Межклеточное взаимодействие

Помимо деполяризующих токов важную роль в проведении возбуждения играет распределение межклеточных щелевых контактов (нексусов) в тканях сердца и их функциональное состояние [Spach, 1986; Saitongdee, 2000]. Задержки, возникающие при переходе возбуждения от клетки к клетке, составляют существенную часть общего времени проведения [Rook et al, 1988; Spach, Josephson, 1994).

Межклеточный контакт образуют два коннексона, каждый из которых, в свою очередь, состоит из шести белковых субъединиц (коннексинов). В сердце млекопитающих присутствуют коннексины Сх43, Сх45 и Сх40, которые различаются между собой по молекулярной массе и по проводимости. Щелевые контакты, образованные из Сх40 имеют самую высокую проводимость - 168 пС, из Сх43 - 96 пС, а из Сх40 - 25 рпС. Все межклеточные контакты потенциал-зависимы, но каналы, образованные Сх43, находятся в открытом состоянии при более широком диапазоне величин трансмембранного потенциала. Например, потенциал полуактивации Сх43 - 60 мВ, а Сх45 и Сх40 - 15 и 40 мВ соответственно [Strinivas, 2004]. Межклеточные контакты, образованные коннексинами пропускают в основном ионы Na⁺ и К⁺ [Saffitz, 2004].

В различных тканях содержание каждого коннексина разное. Так, наличие Сх45 и Сх40 характерно для узловых структур и проводящей системы Гиса-Пуркинье. Коннексин Сх43 также присутствует в волокнах Пуркинье. Кроме того, Сх43 является основным коннексином в рабочем миокарде желудочков.

За счёт изменения межклеточного сопротивления в математической модели удавалось воспроизвести замедленное проведение, декрементное

проведение и блок [Quart, Rudy, 1990]. Также, замедление СП, не зависящее от V_max ПД, можно вызвать при фармакологическом разобщении кардиомиоцитов алифатическими спиртами (гептанол) [Spear et al, 1990]. Увеличение межклеточного сопротивления в результате межклеточного разобщения в ишемической зоне наряду с другими факторами может приводить к аритмиям сердца, в том числе к ФЖ [Spach et al, 1994]. К увеличению межклеточного сопротивления могут приводить гипоксия, закисление цитозоля, а также

увеличение внутриклеточной концентрации Са [Kleber et al, 1987; Noma, Tsuboi, 1987]. Межклеточное сопряжение также определяется уровнем экспрессии коннексинов и их распределением на клеточной мембране [Darrow etal, 1996; Zhuangetal, 2000].

Пространственное распределение коннексинов на поверхности клеток определяет анизотропию проведения по волокну. Основным параметром при оценке анизотропии является соотношение продольного и поперечного проведения. В связи с анатомическими особенностями строения сердца в норме существует естественная анизотропия проведения: СП по волокнам зависит от их диаметра, геометрии, направленности. Значительный вклад в анизотропию проведения возбуждения вносит неоднородное распределение межклеточных контактов между кардиомиоцитами [Spach et al, 1981, 1982, 1986, 2000; Rohr, 2004]. Основанием для такого вывода послужили данные об анизотропии сердечной мышцы и связанным с ней более быстрым проведением импульса вдоль, чем поперёк мышечного волокна. В работах Spach М. с соавт. (2000) показано, что большая СП в продольном направлении обусловлена большей плотностью щелевых контактов вдоль волокна, чем поперёк. Соответственно, общее время открытия натриевых каналов оказывается более продолжительным, когда импульс проводится вдоль волокна. Такого же рода неравномерности проведения проявляются в тех участках, где мышечные пучки разветвляются или соединяются с другими пучками, что в норме приводит к замедлению распространения ПД [Rohr, 2004]. В патологических условиях при ослаблении деполяризующего тока или межклеточных связей в подобных мышечных разветвлениях могут возникать блоки проведения.

Salama с соавт. (1998) показали, что у морской свинки при умеренной гипотермии значительно увеличивается неоднородность по скорости проведения [Salama et al, 1998], что может приводить к появлению

однонаправленного блока проведения и способствовать развитию циркуляции возбуждения. По всей видимости, основной причиной увеличения неоднородности проведения при гипотермии является межклеточное разобщение, вызванное снижением функционирования и/или экспрессии коннексинов. Показано, что при охлаждении снижается вероятность открывания щелевых контактов [Sailongdee, 2000]. На клеточных парах кардиомиоцитов новорождённых крысят обнаружено, что проводимость щелевых контактов уменьшается на 70% при понижении температуры от 37С до 0С [Bukauskas, 1993]. Ослабление взаимодействия между кардиомиоцитами при охлаждении приводит к увеличению межклеточного сопротивления и может вызывать замедление проведения и развитие блоков проведения.

Нарушения проведения и полный блок проведения наблюдаются у всех негибернирующих животных при охлаждении ниже 15-10С [White, 1980; Salama et at, 1998; Mattu et at, 2002; Fedorov et at, 2005]. У гибернирующих животных, напротив, проведение возбуждения сохраняется даже при температурах близких к 0С [Dave, Morrison PR, 1955; Duker et at, 1983, 1987; Geiser et at, 1989; Fedorov et at, 2004, 2005; Розенштраух и др., 2005]. Saitongdee P с соавт, (2000) с помощью иммуногистохимических методов показали, что в желудочках хомяков во время гибернации значительно увеличивается плотность коннексина Сх43, основного белка щелевых контактов между кардиомиоцитами. Авторы предположили, что эти изменения могут представлять собой компенсаторный ответ, направленный на поддержание количества межклеточных щелевых контактов, достаточного для сохранения проведения возбуждения в экстремальных физиологических условиях. Для того чтобы исключить возможность структурных изменений коннексинов у гибернирующих животных, van der Heyden с сотр. (2004) исследовали аминокислотные последовательности коннексина Сх43 у 12 различных видов млекопитающих, в том числе и у гибернирующих сусликов Spermophilus citellus и впадающих в дневную спячку джунгарских хомяков Phodopus sungorus. Никаких различий между гибернирующими и негибернирующими животными выявлено не было, что может свидетельствовать об активации специфических регуляторних механизмов, увеличивающих экспрессию коннексинов у гибернантов в ответ на гипотермию. Среди возможных факторов транскрипции выделяют PPARy

(гамма-рецептор пролифератора-активатора пероксисом), PGC-1 (фактор регуляции транскрипции, проявляющий активность в бурой жировой ткани, сердечной мышце, легких и мозге и влияющий на клеточный метаболизм) [Bertram, Vine, 2005] и CREB (транскрипционный фактор, активирующий экспрессию ряда белков) [MacDonald, Storey, 2005]. Кроме того, в сердце гибернирующих животных обнаружена более активная форма р38 МАРК (семейство митоген-активируемых протеинкиназ) [MacDonald, Storey, 2005].

1.3.2.3. Роль Ігя.і, тока в формировании и распространении ПД в рабочем миокарде желудочков при гипотермии и гибериадии

В нормальных условиях кальциевая компонента деполяризующего тока не влияет на генерацию и проведение ПД. Однако в ряде работ отмечается, что при увеличении межклеточного сопротивления задержка проведения между соседними клетками или группами клеток значительно превышает продолжительность фронта ПД, что может свидетельствовать о более важной роли 1са,ь в проведении ПД в условиях при межклеточного разобщения [Joyner et al, 1996; Kumar, Joyner, 1995; Pu, Boyden, 1997; Shaw, Rudy, 1997; Sugiura, Joyner, 1992].

На изолированных желудочковых волокнах зимнего активного хомяка (животное не входило в спячку зимой) показано, что удаление кальция из перфузионного раствора при 5 С приводило к полному подавлению электрической активности кардиомиоцитов, тогда как при нормальной концентрации кальция (2,7 мМ) амплитуда ПД поддерживается на уровне 80-85% от величины, наблюдаемой при 37С [Liu et al, 1987]. Liu с соавт. обнаружили, что при понижении температуры от 35С до 10С пиковая величина Са²⁺-тока достоверно не изменялась у летнего активного ежа и существенно подавлялась у крысы. В то же время, как отмечалось ранее (см. раздел 1.3.2.1.), во время гипотермии снижается амплитуда натриевого тока и уменьшается число натриевых каналов, способных к активации [Пи, 1991; Colatsky, 1980]. Уменьшение натриевого тока происходит как у негибернирующих животных, так и у гибернантов. Однако у гибернантов отмечается большая устойчивость кальциевого тока к охлаждению. Эти данные могут свидетельствовать об увеличении роли кальциевой компоненты деполяризующего тока в генерации ПД [Wang, 1997, 2002]. Однако, не

выявлено влияния верапамила (5 мкМ), блокатора кальциевых каналов L-типа, на dV/dTmax и амплитуду ПД изолированных папиллярных мышцах' летних активных сусликов. Это позволяет сделать предположение, что передний фронт ПД у сусликов при низких температурах, как и при 37С, формируется быстрым натриевым током.

Тем не менее, кальциевый ток может вносить существенный вклад в проведение возбуждения. С помощью математического моделирования показано, что в условиях пониженной возбудимости клеток важную роль в проведении возбуждения играет не уровень деполяризующего тока, а состояние межклеточного взаимодействия [Shaw, Rudy, 1997]. Авторами специально подчёркивается, что для преодоления реполяризующего влияния окружающих тканей и возникновения распространяющегося ПД необходимо пропускание через ткань некоторого количества тока. Важно именно количество тока, то есть произведение тока на время или, другими словами, электрический заряд (Q). Таким образом, несмотря на уменьшение амплитуды Iwa, сохраняется возможность деполяризации более низким током, но за более продолжительное время. При снижении 1ка увеличивается вклад кальциевой компоненты деполяризующего тока в проведение (Qca, то есть заряд, который переносится Ica за время ПД). Так, если при нормальном межклеточном проведении (gj=2,5 mkS) вклад Qc_a по сравнению с Qua в деполяризацию незначительный, то при межклеточном разобщении (gj=0,02 mkS) соотношение Qca:QNa равно 1,47:1, а при дальнейшем снижении межклеточного проведения (gj=0,006 mkS) Ica,L вносит основной вклад в деполяризацию (Qca:QNa~0,26) [Shaw, Rudy, 1997]. Таким образом, во время гипотермии длительность ПД (фазы плато, зависящей от входящего кальциевого тока) в условиях сниженной возбудимости, с одной стороны, и межклеточного разобщения, с другой, будет играть ключевую роль в распространении ПД. Увеличение роли Іс_а,ь в поддержании скорости и надёжности проведения подтверждается также в ряде экспериментальных работ [Joyner et al, 1996; Kumar, Joyner, 1995; Sugiura, Joyner, 1992].

В настоящее время мало данных о роли Іс_а,ь в механизме сохранения проведения у гибернирующих животных в условиях выраженной гипотермии. Нельзя исключать наличие и/или появление экспрессии других изоформ натриевых каналов, например нейрональной, которая обладает меньшей

чувствительностью к температуре. Таким образом, в устойчивость сердца гибернантов к возникновению блоков проведения во время гипотермии могут вносить вклад различные факторы, такие как изменения функционирования Na⁺, Са²⁺ и межклеточных каналов и/или уровня экспрессии белков этих каналов, а также появление экспрессии новых белков ионных каналов и/или щелевых контактов.

1.4. Особенности иннервации сердца гибернантов

Помимо различных клеточных механизмов, обеспечивающих поддержание нормального функционирования сердца гибернирующих млекопитающих в условиях выраженной гипотермии, существует значительная разница в иннервации сердца у зимнеспящих животных по сравнению с другими млекопитающими [Johansson, 1996]. Так, показано, что сердце ежа (гибернанта) имеет менее выраженную симпатическую иннервацию по сравнению с сердцем морской свинки (негибернант). Причём отмечено, что у ежа плотность симпатических нервных окончаний выше в предсердиях, чем в желудочках. Неравномерное распределение симпатических окончаний было обнаружено также и у других зимнеспящих животных ~ суслика {Citellus tridecemlineatus) и летучей мыши {Nyctalus noctula) [Nielsen, 1968]. Эти результаты подтверждаются данными о троекратной разнице концентраций норадреналина в левом желудочке ежа по сравнению с морской свинкой [Johansson, 1996].

Известно, что катехоламины приводят к увеличению внутриклеточной концентрации Са²⁺ и тем самым способствуют возникновению триггерной активности по механизму задержанных постдеполяризаций. Увеличение вероятности возникновения фибрилляции желудочков при действии катехоламинов показано во многих работах [Hoffamn, 1955; Han, 1964; Nielsen, 1968]. Полученные данные согласуются с хорошо известным предохранительным эффектом /?-блокаторов при клиническом применении и, возможно, могут иметь важное клиническое значение при лечении осложнений, возникающих при гипотермии, особенно сердечных аритмий и гипотензии [Johansson, 1996].

Напротив, O'Shea и Evans (1985) сообщают о нормальной симпатической иннервации желудочков зимнеспящей летучей мыши Miniopterus schreibersii,

не отличающейся от симпатической иннервации предсердий и характерной для большинства млекопитающих. Авторы обнаружили в желудочках летучей мыши значительный инотропный эффект при раздражении блуждающих нервов и при перфузии ацетилхолином [О'Shea, 1985]. Полученные данные могут свидетельствовать о различной парасимпатической иннервации желудочков летучей мыши по сравнению с другими млекопитающими. Исследователи высказали предположение, что повышенная парасимпатическая иннервация желудочков летучей мыши может являться важным инструментом при уменьшении сердечного выброса в процессе зимней спячки, а также для быстрых и скоординированных изменений сердечной деятельности во время полёта [О'Shea, 1985]. Предложен возможный «парасимпатический» механизм защиты сердца зимнеспящих животных в условиях пониженной температуры. Обильная парасимпатическая иннервация желудочков может способствовать предотвращению возникновения различных аритмий при понижении температуры. Выделяемый парасимпатическими окончаниями ацетилхолин может оказывать антиаритмический эффект, обусловленный его способностью увеличивать выходящий ток ік,а_сіі и уменьшать входящий ток If, предотвращая тем самым анормальную автоматию в волокнах проводящей системы Пуркинье [Кушаковский, 1998]. Другой механизм возможного антиаритмического действия ацетилхолина связан с уменьшением Ic_a,u что может являться причиной подавления под действием ацетилхолина постдеполяризаций и триггерной активности [Cranefield, 1977; Wit, Rosen, 1992]. У собак во время ишемии увеличение парасимпатической активности предотвращает возникновение фибрилляции желудочков [Vanoli, 1991]. Однако, этот эффект сильно зависит от уровня симпатической активности [О'Shea, 1985; Haunstetter et al, 1994]. Современные представления об адрено-холинергическом взаимодействии достаточно полно описывает концепция «акцентированного антагонизма», согласно которой ингибирующий эффект данного уровня парасимпатической активности выражен тем сильнее, чем выше уровень симпатической активности [Levy, 1966]. Акцентированный антагонизм обусловлен взаимодействием как на пресинаптическом, так и на постсинаптическом уровнях. Пресинаптический механизм состоит в ингибировании высвобождения норадреналина из окончаний постганглионарных симпатических волокон под действием ацетилхолина.

БИШІОЇЕІІ

Постсинаптический механизм опосредован взаимодействиями на уровне самих эффекторных клеток и, по-видимому, обусловлен циклическими нуклеотидами, цАМФ и цГТФ [Levy, 1966].

Известно, что снижение температуры тела приводит к активации симпатоадреналовой системы и высвобождению депонированных катехоламинов из надпочечников и нервных волокон сердца как у негибернантов (крысы) [Афанасьев, 1997], так и у гибернирующих млекопитающих [Florant, 1982]. Таким образом, повышенная парасимпатическая иннервация сердца может оказывать защитный эффект при понижении температуры тела на фоне повышенного аритмогенного симпатического тонуса за счёт ингибирования действия катехоламинов с помощью вторичных внутриклеточных посредников (Gj-белки).

1.5. Резюме.

Представленный литературный обзор показывает, что гибернирующие животные обладают целым рядом адаптационных механизмов, обеспечивающих нормальное функционирование организма при температурах близких к 0С. Большое практическое значение представляет изучение электрофизиологических механизмов, препятствующих возникновению у гибернирующих животных нарушений ритма во время спячки, когда температура тела животных снижается до 0-7С. Понимание причин развития аритмий во время охлаждения у негибернирующих млекопитающих и устойчивости ритма сердца у гибернантов позволит разработать новые подходы к повышению сопротивляемости негибернирующих организмов, включая человека, в экстремальных условиях и дальнейшего применения их в медицинской практике. Такие подходы помогут расширить возможности лечения людей, подвергшихся переохлаждению; улучшить восстановление работы сердца после охлаждения во время кардиохирургических операций; снизить последствия ишемических повреждений сердца, в том числе, инфаркта миокарда. Полученные знания должны выявить новые мишени для фармакологических воздействий и помочь в разработке новых лекарственных препаратов.

Похожие диссертации на Электрофизиологические механизмы устойчивости ритма сердца суслика Citellus undulatus во время гибернации

Роль моноаминергических систем мозга в механизмах регуляции поведения сусликов (Citellus undulatus) Аношкина Ирина Анатольевна

Физиологические механизмы формирования позной устойчивости у девочек первого детства с двигательной активностью различной координационной сложностиКурочкина Евгения Игоревна

Половые различия в устойчивости к развитию экспериментальной гипертонии у крыс и их механизмыБердникова Вероника Александровна

Половые различия в устойчивости к развитию экспериментальной гипертонии у крыс и их механизмыБердникова Вероника Александровна

Адренергические и NO-зависимые механизмы регуляции кровотока желудка у крыс и их роль в устойчивости к повреждающему воздействию стрессаСемячкин-Глушковский, Игорь Александрович

Вариабельность ритма сердца как показатель степени участия центрального звена иерархической системы ритмогенеза в формировании ритма сердцаГурбич Дмитрий Викторович

Ритм сердца у школьников от 7 до 12 лет в покое и при ортоклиностатическом тестировании Сапожникова Елена Николаевна

Тахикардическая реакция при глотании: динамика, эфферентное звено и влияние на спектральную оценку вариабельности ритма сердца Шерозия Ольга Петровна

Динамика ритма сердца при дозированных нагрузках различной физической тяжести и нервной напряженностиОглоблин Денис Леонидович

Возрастная характеристика ритма сердца и состояния мозговых сосудов с учетом результатов анализа крови у преподавателей вузаИгнатьев Данила Игоревич