Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
I. Строение обонятельного эпителия позвоночных животных II
2, Строение обонятельной луковицы позвоночных 14
3. Электрическая активность обонятельного эпителия позвоночных в процессе адекватной стимуляции 23
4. Электрическая активность ОЛ позвоночных на запахи 32
Глава II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ 54
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ВНУТРЙКЛЕТОЧНО РЕГИСТРИ РУЕМЫХ РЕАКЩЙ НЕЙРОНОВ ОЛ ЛЯГУШЕК ( Яапсь ~Um -рог-enUcL) НА ДЕЙСТВИЯ РАЗНЫХ ЗАПАХОВЫХ ВЕЩЕІСТВ 62
I. Классификация реакций нейронов ОЛ лягушек на действие запахов. Способы проявления "специфичности" реакций нейронов ОЛ на запахи 62
2. Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на действия запахов в отдельных сериях опытов 74
Глава ІV. АНАЛИЗ ВНЕКЛЕТОЧНО РЕГИСТРИРУЕМЫХ РЕАКЩЙ НЕЙРОНОВ ОЛ ЛЯГУШЕК НА ДЕЙСТВИЯ РАЗНЫХ ЗАПАХОВЫХ ВЕЩЕСТВ 105
Глава V. СЕЗОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ИЗБИРАТЕЛЬНОСТИ РЕАКЦИЙ НЕЙРОНОВ ОЛ ЛЯГУШЕК НА ДЕЙСТВИЯ РАЗНЫХ ЗАПАХОВ \ 121
I. Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на действия запахов в конце зимы 121
2. Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на запахи в весенний период 125
3, Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на запахи в начале лета (май-июнь) 128
4. Сравнительный анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на запахи в разные сезоны одного года и между годами 130
Глава VI. РЕАКЦИИ НЕЙРОНОВ ОЛ СТЕПНЫХ ЧЕРЕПАХ (Те stud о h ox slit С сії > НА ЗАПАХИ ПРИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГИСТРАЦИИ ПОТЕНЦИАЛОВ 141
I, Классификация реакций нейронов ОЛ черепах на адекватную стимуляцию ОВ. Способы проявления "специфичности" реакций нейронов ОЛ на запахи 141
2. Анализ реакций нейронов ОЛ степных черепах на действия запахов в отдельных сериях опытов 145
3. Сезонные изменения избирательности реакций нейронов ОЛ степных черепах на запахи .156
ОБСУЖДЕНИЕ 166
ВЫВОДЫ 174
ЛИТЕРАТУРА 176
- Строение обонятельного эпителия позвоночных животных
- МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ
- Классификация реакций нейронов ОЛ лягушек на действие запахов. Способы проявления "специфичности" реакций нейронов ОЛ на запахи
- АНАЛИЗ ВНЕКЛЕТОЧНО РЕГИСТРИРУЕМЫХ РЕАКЩЙ НЕЙРОНОВ ОЛ ЛЯГУШЕК НА ДЕЙСТВИЯ РАЗНЫХ ЗАПАХОВЫХ ВЕЩЕСТВ
- Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на действия запахов в конце зимы
Строение обонятельного эпителия позвоночных животных
Тонкая структура рецепторного отдела обонятельных органов животных достаточно подробно изучена1; Многочисленный экспериментальный материал по этому вопросу обобщен в монографии Бронштейна А.А. (І977)1. Так как наша работа лишь косвенно касается указанного отдела обонятельного анализатора, мы считаем возможным ограничиться краткой характеристикой его структуры и функции .
У позвоночных животных рецепторний отдел обонятельного анализатора представлен обонятельным эпителием (ОЭ) - комплексом рецепторних, опорных, базальних и секреторных (боуменовы железы) клеток, отделенных от воздушной среды слоем слизи (PHC!,I)F« В типичном обонятельном рецепторе (ОР) позвоночных можно выделить: округлое тело с клеточным ядром, центральный отросток - немиели-низированное нервное волокно, соответствующее аксону, и входящее в состав обонятельного нерва и наконец, дистальний сегмент, гомологичный дендриту и оканчивающийся у поверхности эпителия утолщенным образованием - обонятельной булавой (Винников, Титова, 1957, Бронштейн; 1972, 1977, && оъе/?& % Vb .JzstcCa , tf A Lt , 1967, TviscA , 1967, M ses? t 1971 и $.У. Аоследняя несет различное число ресничкоподобных выростов (обонятельные волоски) снабженных фибрилярннм аппаратом (9 + 2 + 2 фибриллы) или атипичного строения (Бронштейн, 1969, Винников, 1971, t 1965, 1966, 1969, Яе&ъе , 1965); Наличие волосков - характерная особенность обонятельных рецепторних клеток в отличие от опорный Длина обонятельных волосков варьирует от 5 мкм у некоторых рыб (j&asttusiuz, 1965) до 100-200 мкм у некоторых лягушек (Бронштейн, 1972, Я test , 1965) при толщине 0,1-0,3 мкм у основания .
Наличие обонятельных волосков значительно увеличивает поверхность обонятельного эпителия! Так у человека макроскопическая площадь обонятельного эпителия равна 2,5 ем2, а площадь обонятельных волосков 30-50 см2 на каждую ноздрю ( Ottoscn, 1970) Отношение указанных площадей варьирующее в данном случае от 12 до 20, может достигать 100 у животных с развитым обонянием { Мсх&ол ; ё-еса&п , 1967)1 Обонятельные волоски небольших размеров способны активно двигаться в окружающей их слизи, совершая неупорядоченные хаотичные движения, но неспособны при этом заметным образом перемешивать слизь (&ъ ъ&с&с1и, 1973), в то время как волоски наиболее крупных размеров остаются неподвижными (Retse ,1965)!
В ряде случаев обнаружено группирование рецепторних клеток, соприкасающихся своими периферическими отростками или телами (Ко-стонян, 1971а,б, War/« t JZ /Le-z , 1970, &?&& а , 1970 и др ,)-; Эти объединения, видимо, можно считать единым морфофунк-циональным ансамблем рецепторов, синхронно возбуждающимся при воздействии адекватных стимулов {Ottoman f 1956, Минор, I97I6) .
Согласно мнению большинства авторов, центры взаимодействия пахучих молекул и рецепторных .клеток лежат в пределах обонятельных волосков (Ottoson t 1956, 1970, Королев, Фролов, 1973, Бронштейн, 1977) хотя и не отрицается возможность наличия рецепторных мест на уровне апикальных дендритов, проксимальных сегментов волосков и микровилл опорных клеток (пАїси -fc 1971 и -щ$ У%
Рецепторные клетки окружены и изолированы опорными клетками обонятельного эпителия, свободная поверхность которых несет на себе некторое количество микровилл, что характерно для секрети-рующих или активно адсорбирующих вещества клеток (Бронштейн, 1972, Ottoson t 1970) и, вполне вероятно, что они принимают участие в инактивании и уборке пахучих молекул, прореагировавших с рецепторами. Многие исследователи сходятся во мнении, что между плазматическими мембранами рецепторных и опорных клеток существует контакт, способствующий их электрическому взаимодействию (Бронштейн, 1969, Костанян, 1969, Л-e se , 1965, gczcnsso , 1970) . .Высказываются предположения об участии опорных клеток в процессах удаления дегенерирующих вершин обонятельных рецепторов и разрушения чужеродных элементов, попадающих в полость носа {Jttcfzts , 1969, Бонашевская, I975)f.
Методика экспериментов
Опыты проводились на травяных лягушках {Яа па tem c a a.) и степных черепахах {Testctolo frcts/tetc/t) t обездвиженных внутрибрюшинной инъекцией диплацина. дыхание осуществлялось через увлажняемую поверхность кожи лягушек и принудительную вентиляцию легких черепах постоянным потоком воздуха, подаваемого через трахею. Подход к обонятельным луковицам обеспечивался широким вскрытием полости черепа. Кроме обонятельной луковицы обнажались ипсилате-ральный обонятельный нерв и тракт (боковая поверхность ипсилате-рального полушария переднего мозга). Мозговые оболочки удалялись1. Поверхность мозга покрывалась вазелиновым маслом для предохранения мозга от подсыхания1. Контроль функционального состояния животных осуществлялся по скорости кровотока в сосудах мозга и по характеру суммарной электрической активности.
Регистрировалась суммарная вызванная активность с поверхности обонятельных луковиц с помощью серебряного электрода (0- 100 мкм - монополярное отведение) и внутриклеточная электрическая активность нейронов с помощью стеклянных микропипеток, с диаметром кончика менее 0,5 мкм, заполненных насыщенным раствором цитрата калия. При этот сопротивление микро электродов было порядка 200-500 мом. В случае экстраклеточной регистрации импульсной активности нейронов 0Л использовались стеклянные микропипетки с диаметром кончика около I мкм, заполненные ЗМ раствором ЛлС с сопротивлением порядка 8-20 мом. Микроэлектроды вытягивались непосредственно перед опытом из капилляров диаметром 1,5-2 ии стекла марки "пирекс" или № 23 на микрокузнице МЭ-4. Индифферентный электрод (серебряная пластинка) помещался в ротовую полость лягушки, а у черепах им служил игольчатый электрод, который вкалывался в верхнюю челюсть.
Усиление электрической активности осуществлялось с помощью энцефалографа E-I20 фирмы "5 и ". Микро электроды подключались через мостовую схему с целью компенсации постоянного потенциала в случае подачи поляризующего напряжения через микроэлектрод. Регистрация исследуемых процессов производилась с экрана 2 лучевого осциллоскопа той же фирмы на кинопленку с помощью фоторегистратора Ф0Р-І.
Погружение микро электродов осуществлялось шаговой (шаг = 4 мкм) масляной микро подачей с контролем глубины погружения по индикатору. Морфологический тип регистрируемых нейронов идентифицировался по форме фокальных вызванных потенциалов в месте их регистрации и по характеру реакций этих нейронов на ортодромное (ОР) и антидромное (АР) раздражения. При этом использовались раздражающие биполярные нихромовые электроды (0 =70 мкм), расположенные на обонятельном нерве (ОР) и латеральном обонятельном тракте (АР), с подачей электрического стимула от электронных стимуляторов ЗСЛ-2. Длительность прямоугольного импульса равнялась 0,1-0,5 мсек, амплитуда - 10-60 в. На рис.6 дана схема расположения регистрирующих и раздражающих электродов в 01 лягушек и черепах.
Адекватная стимуляция (АДР) обонятельной выстилки в одном опыте осуществлялась выравниванием потоками чистого воздуха (ЧВ) и десятикратно разбавленных насыщенных паров четырех одорантов . Для лягушек контрольный поток ЧВ был равен 1,7 с /сек., для черепах - 3,5 с /сек. Время подачи адекватного стимула было равно 5 сек., а интервал между ними составлял 2-3 минуты.
Классификация реакций нейронов ОЛ лягушек на действие запахов. Способы проявления "специфичности" реакций нейронов ОЛ на запахи
Учитывая то, что каждый запах может вносить свою специфику в картину ответов нейронов, мы прежде всего классифицировали ответы нейронов на действие ЧВ. Необходимо сразу отметить, что выбранный нами поток ЧВ, равный 1,7 ск /сек., не случаен. Этот выбор основан на данных, полученных на длительно регистрируемых нейронах (10 нейронов) при воздействии изменяющегося потока ЧВ в пределах 0,6-2,5 см3/сек. Как выяснилось, при увеличении потока ЧВ усиливается выраженность типа реакций нейронов без взаимного перехода одного типа реакций в другой. При этом наиболее стабильным параметром реакции нейронов оказался латентный период депо- и гиперполяризационных сдвигов мембранного потенциала в пределах изменения потока ЧВ от 1,25 см3/сек. до 2,5 см3/сек. Этот параметр реакции нейронов оказался наиболее стабильным и при повторных раздражениях "стандартным" потоком ЧВ, который на основании вышесказанного был выбран равным 1,7 см3/сек.
У большинства нейронов частота спонтанных импульсных разрядов не превышала 2 имп./сек., однако в некоторых случаях достигала 10 имп/сек. Потенциал покоя нейронов обычно имел небольшую величину -20-30 мв и амплитуда ПД не превышала его. Конечно, это свидетельствует о частичном повреждении нейронов микроэлектродами, однако мы имели возможность сопоставить реакции менее поврежденных нейронов с реакциями более поврежденных, т.к. неоднократно регистрировали нейроны при МП равном 60 мв и с амплитудой спайка около 70 мв в течение длительного времени (1-2 часа). Подобный сравнительный материал мы имели и на примерах длительной регистрации одиночных нейронов, у которых с течением времени изменялось функциональное состояние, о котором можно было судить по изменению величины МП и частоты фоновой импульсапии. В этих случаях мы искали такой параметр реакции нейронов, на котором изменения функционального состояния сказывались бы наименьшим образом. Таким параметром реакций нейронов, как выяснилось, является латентный период медленных депо- и гиперполяризационных сдвигов МП. Этот параметр реакций нейронов при их классификации по типам играл важную роль .
Классификация нейронов 01 по типам их реакций осуществлялась на основе сравнения частотных характеристик ответа нейронов на действие стимула относительно их фоновой частоты, а также учитывалось направление сдвигов мембранного потенциала (ДП или ГП). В результате мы выделили три типа реакций нейронов 01 лягушек на действие ЧВ: В - возбуждающийся, Т - тормозной, Н - не реагирующий (рис.9). Процентные соотношения этих типов приведены в таблице 2;
Анализ внеклеточно регистрируемых реакщй нейронов ол лягушек на действия разных запаховых веществ
При внутриклеточной регистрации электрической активности нейронов ОЛ неизбежно в какой- то мере их повреждение и, как следствие, отсутствует возможность длительной регистрации их активности, что препятствует мног азовому испытанию воздействия на реакции нейронов одного и того же адекватного стимула. Это, конечно, снижает информационную ценность полученных данным методом результатов. В этой связи перед нами встала задача проведения экспериментов с использованием методики с внеклеточной регистрацией электрической активности нейронов ОЛ на воздействие тех же запаховых веществ и в тех же условиях проведения опытов, какие использовались нами при внутриклеточной регистрации активности нейронов. Сопоставление данных, полученных в одних и тех же условиях проведения экспериментов, но с использованием разных методик регистрации активности нейронов может быть весьма ценным для выявления наиболее значимых параметров реакций нейронов при "оценке" ими качества воздействующих стимулов. Кроме того, это давало нам возможность сопоставить результаты наших экспериментов с данными других авторов, которые использовали методику с внеклеточной регистрацией электрической активности нейронов ОЛ позвоночных животных на действие разных запахов.
Ниже приводятся данные опытов, проведенных в январе-феврале, в которых использовались пара ванильных и пара камфарных запахов.
Спонтанная активность внеклеточно регистрируемых нейронов не превышала I имп./сек, и в основном составляла менее 0,5 имп./сек. В данной серии опытов было зарегистрировано 28 нейронов, реакции которых можно было разделить на три типа: В - возбуждающийся, Т - 106 торшзный и Н - нереагирующий. Количественные соотношения этих типов реакций нейронов на действие ЧВ, ванильных и камфарных запахов несколько различались . Как видно из таблицы II на действие пары камфарных запахов (3,4-диметилфенол, п-диэтоксибензол) наблюдалось меньшее количество В-типов реакций нейронов и большее количество Т и Н типов. Собственно эти различия определялись спецификой реакций лишь четырех нейронов, остальные же нейроны реагировали однотипной реакцией на все предъявляемые стимулы. В таблице 12 представлены эти типы реакций всех 28 нейронов. Видно, что 3 нейрона, возбуждаясь на действия ЧВ и пары ванильных запахов, а тормозились на камфарные. Один нейрон не реагировал на камфарные запахи, но отвечал на пару ванильных и ЧВ.
Анализ реакций нейронов ОЛ лягушек на действия запахов в конце зимы
В опытах на степных черепахах с целью сравнения дублировались та же схема постановки экспериментов, что и в опытах на лягушках. Здесь также использовался "стандартный" поток чистого воздуха равный 3,5 см3/сек, который позволил получить стабильные хорошо выраженные ВВ. Выбор в качестве "стандартной" именно этой величины потока ЧВ был сделан на тех же основаниях, что и в опытах на лягушках.
Спонтанная активность нейронов ОЛ черепах была несколько выше, чем у нейронов ОЛ лягушек и колебалась в пределах 0-6 имп/сек. В среднем для популяции нейронов в отдельных сериях опытов она находилась в пределах 0,5-3 имп/сек.
В ОЛ черепах на действие потока чистого воздуха наблюдаются те же типы реакций нейронов, что и в ОЛ амфибий (рис.13). Процентные соотношения выделенных типов реакций нейронов представлены в таблице 21.
Мы не останавливаемся на описании особенностей найденных типов реакций нейронов 01 черепах в связи с почти полным их соответствием уже описанным типам реакций нейронов в 0Л лягушек. Можно отметить, что у нейронов 01 рептилий выраженность реакций как на уровне импульсного разряда, так и на уровне изменений величины МП несколько выше, чем у лягушек.
При действии запахов основная масса нейронов 0Л черепах реагирует по тому же типу, что и на действие ЧВ. Но иногда встречаются нейроны, которые различными способами реагируют на действие ЧВ и запахов. Так, в серии опытов, где сравнивались влияния 1,6-дигид т роксинафталина, дурола, 2,2 -дипиридила и о-ванилина, мы наблюдали у одной Ж "on" реакцию одним спайком на действие 1,6-дигидро-ксинафталина и о-ванилина и у другой МК такую же реакцию на действие о-ванилина и дурола при отсутствии в обоих случаях реакций на действие ЧВ и двух других запахов. В другой серии опытов, где ис-пытывались та же пара ванильных веществ (2,2-дшшридил и о-ванилин) и пара камфарных (3,4-диметилфенол, п-диэтоксибензол) у одной Ж наблюдалась "on" реакция одним спайком на действие 3,4-диметилфенол и реакция также одним спайком на действие 2,2-дипиридила при отсутствии реакций на действие других стимулов. Говорить о "специфичности" этих реакций нейронов затруднительно, ибо как наличие реакции, так и ее отсутствие имеет место при действии противоположных типов запахов. "Специфичность" реакций нейронов 0Л рептилий к запахам обычно проявляется не в различии их типов, а в структуре их импульсного разряда или же в различной скорости возникновения этих реакций на разные вещества, судя по величине ЛИ ДП или ЛП ГП сдвигов МП. А иногда "специфичность" реакций нейронов ОЛ черепах к разным запахам проявляется в характере колебаний МП (рис.32).
