Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЯДОВ ПОЗВОНОЧНЫХ И ЧЛЕНИСТОНОГИХ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СИ НАШИ ЧЕС КОЙ ПЕРЕДАЧИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 9-32
1.1. Состав ядов и методы их получения 9-14
1.2. Цитотоксическое действие меыбраноактивных пептидов 14-16
1.3. Влияние ядов-и их компонентов на синаптиче-
скую передачу позвоночных 16-20
1.4. Функциональные особенности центральных и нерв
но-мышечных синапсов насекомых 21
1.4.1. Иннервация мышц и физиология нервно-мышечных синапсов 21-26
1.4.2. Анатомия и морфология сегментарных ганглиев 26-27
1.4.3. Физиология церкальных синапсов таракана 28-30
1.4.4. Влияние ядов и нейротоксинов на нервную систему насекомых 30-32
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА 33-46
2.1. Энтомологическая характеристика исследованных ядовитых членистоногих 33-35
2.2. Объекты исследования 35
2.3. Препаровка 36
2.4. Регистрация активности интернейронов 6-го брюшного ганглия (6 БГ) тарак ана 36-39
2.5. Регистрация миниатюрных возбуждающих постси-наптических потенциалов (МВПСП) мышечных волокон саранчи 40-43
2.6. Регистрация потенциалов действия гигантских аксонов брюшной нервной цепочки таракана .. 43
2.7. Определение токсичности 43-44
2.8. Экспериментальные растворы и использованные фармакологические соединения 4-4-46
ГЛАВА 3. ТОКСИЧНОСТЬ И ВЖЯНИЕ ЦЕЛЬНЫХ ЯДОВ НА ПРОВЕДЕНИЕ НЕРВНЫХ ИМПУЛЬСОВ ПО ГИГАНТСКИМ АКСОНАМ НЕРВНОЙ ЦЕГОЧКИ ТАРАКАНА 47-55
ГЛАВА 4. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЦЕРКАЛЬНЬК СИНАП
СОВ ШЕСТОГО БРЮШНОГО ГАНГЛИЯ 56-64
4.1. Потенциал ганглия и синаптические ответы .. 56-57
4.2. Влияние ацетилхолина и карбахолина на интернейроны 57-62
4.3. Пресинаптическое и постсинаптическое блокирование передачи нервных импульсов в церка-
льных синапсах 62-64
ГЛАВА 5. ВЖЯНИЕ ЯДОВ НА ИНТЕРНЕЙРОНЫ 6-ГО БРЮШЮГО
ГАНГЖЯ ТАРАКАНА 65-91
5.1. Яд сколопендры Scolopendra cingulata 66-70
5.2. Яд паука Eresus niger 70-76
5.3. Яд тарантула Lyooea singoriensis 76-80
5.4. Яд черного скорпиона Ortocbirus sorobiculo-
sus 80-85
5.5. Яд погребного паука Segestria florentina .. 85-90
5.6. Яд лже-каракурта Steatoda paykulliana 91
ГЛАВА 6. ВЖЯНИЕ ЯДОВ НА ПРОЦЕСС ВЬЩЕЛЕНИЯ МЕДИАТОРА
В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ САРАНЧИ 92-112
6.1. Яд сколопендры Scolopendra cingulata 93-95
6.2. Яд паука Sresus niger 95-99
6.3. Яд тарантула Lyoosa singoriensis 99-102
6.4. Яд черного скорпиона Ortocliirus scrobiculo-
sus 102-104
6.5. Яд погребного паука Segestria fiorentina .. 104-108
6.6. Яд лже-каракурта Steatoda paykulliana I08-II2
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ II3-I26
ВЫВОДЫ 127-128
ЛИТ Е PAT УРА 129-157
- Состав ядов и методы их получения
- Энтомологическая характеристика исследованных ядовитых членистоногих
- ТОКСИЧНОСТЬ И ВЖЯНИЕ ЦЕЛЬНЫХ ЯДОВ НА ПРОВЕДЕНИЕ НЕРВНЫХ ИМПУЛЬСОВ ПО ГИГАНТСКИМ АКСОНАМ НЕРВНОЙ ЦЕГОЧКИ ТАРАКАНА
- Потенциал ганглия и синаптические ответы
- Яд сколопендры Scolopendra cingulata
Введение к работе
Актуальность. Нейротоксины, продуцируемые рааличными ядовитыми организмами, широко используются в качестве инструментов при выяснении молекулярных механизмов функционирования электро- и хемовозбудимых мембран. Так, при помощи тетродоток- сина И сакситоксина (Као,19бб; Narachashi et al.,1967; Evans, 1972), батрахотоксина и алкалоидов вератридина, аконитина (иі-hricht, 19 69} Kayaalp et al.,1970; Albuquerque et al., 1971) и полипептидных нейротоксинов скорпионов (Adam et al., 19665 Koppenhofer, Schmidt, 1968; Можаева и др., 1979) удалось выявить особенности работы потенциалзависимых натриевых каналов. Исследование избирательности действия ядов змей и некоторых членистоногих позволило понять особенности функционирования синаптического аппарата. Было показано, что в состав яда кобры входят сС-бунгаротоксин, который обладает способностью избирательно связывать никотиновые холинорецепторы ( Chang, Ьее, 1966), и ft-бунгаротоксин, специфически взаимодействующий с пресинаптической мембраной и модифицирующий процесс секреции медиаторов (Lee, Chen, 1970).
В настоящее время выделенные из цельных ядов токсические нейропептиды и ферменты широко используются как модельные препараты для изучения возбудимых мембран, и большой вклад в этом направлении внесен исследованиями зарубежных (ziotkin et al., 1972, 1979; Ilarachashi, 1974; Piek, 1981; Piek et al., 1982; Clark et al., 1982) и отечественных (Магазаник, 1977; Орлов, 1977; Гришин и др., 1978, 1979; Можаев и др.,1979; Ус- манов и др., 1982) авторов. Большой интерес для нейрофизиологических исследований представляют яды членистоногих, поскольку они содержат токсины с высокой избирательностью для млекопитающих и насекомых.
С другой стороны, исследование ядов членистоногих,насчитывающих около 200000 видов, большинство из которых почти не изучены, поможет выявить новые токсины, при помощи которых удастся выяснить недостающие детали сложного механизма функционирования возбудимых мембран.
Исследование влияния вновь выделенных ядов на центральные и нервно-мышечные синапсы насекомых особенно важно, поскольку эти синапсы отличаются природой медиаторов. Сопоставление эффектов ядов на центральные - холинергические и нервно-мышечные - і -глутаматэргические синапсы является основой выяснения механизма избирательности и позволяет планировать последующие работы по выделению отдельных фракций ядов. Можно полагать, что использование в нейрофизиологических исследованиях выделенных фракций позволит получить данные о различиях в рецепторных структурах синапсов позвоночных и насекомых и, таким образом, понять механизм избирательности действия отдельных ядов.
Исследование механизма действия ядов на синаптический аппарат насекомых представляет не только теоретический интерес, но важно для решения практических задач изыскания новых инсектицидов избирательного действия. Кроме того, сведения о механизмах специфического действия ядов на функционально различные синапсы создают предпосылки для использования этих ядов и их компонентов в качестве лечебных препаратов (Орлов и др., 1981).
Теоретическая и практическая важность исследования механизма действия ядов и отдельных токсинов позвоночных и беспозвоночных явилась причиной того, что этот круг вопросов был включен в специальные комплексные научные программы АН СССР -"Нервный импульс" и "Ионный канал".
Цель и задачи исследования. Основная цель работы - исследование механизма токсичности и влияния ядов некоторых членистоногих на передачу нервных импульсов в синапсах центральной нервной системы таракана Periplaneta americana L. и в нервно-мышечных синапсах саранчи Locusta migratoria migratorioides H«F« Б ходе исследования решались следующие задачи:
Определение токсичности и исследование влияния цельных ядов на проведение нервных импульсов по гигантским аксонам нервной цепочки таракана.
Изучение механизма действия ядов членистоногих на си-наптическую передачу и на интернейроны ганглия.
Исследование действия цельных ядов на процесс выделения медиатора в нервно-мышечных синапсах саранчи.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. В работе впервые выявлены эффекты ранее неизученных ядов членистоногих Средней Азии на проведение потенциалов действия по нервным волокнам, на центральные холинергические и периферические глутаматэргические синапсы насекомых.
Изучение эффектов цельных ядов показало, что все яды содержат токсические компоненты, специфически нарушающие синап-тическую передачу в церкальных и нервно-мышечных синапсах.
Действие ЯДОВ сколопендры Scolopendra cingulata, паука 3resus niger, лже-каракурта Steatoda paykulliana на холинергические синапсы объясняется их способностью резко ускорять процесс секреции медиатора, приводящий к истощению их запасов.
Действие яда тарантула Lycosa singoriensis трудно объяснить только истощением запасов медиатора; возможно, яд тарантула действует также на мембрану нейронов, вызывая их деполяризацию. ЯД погребного паука Segestria florentina, видимо, прежде всего действует на потенциалзависимые ионные каналы.
Все яды несомненно обладают пресинаптическим действием на глутаматэргические синапсы, вызывая увеличение частоты миниатюрных возбуждающих поотсинаптических потенциалов (МВПСП). Отличительной особенностью обладает яд тарантула Lycosa singoriensis, который в пороговых концентрациях уменьшает частоту и амплитуду МВПСП, что, вероятно, говорит о его взаимодействии с постсинаптической мембраной. Яд черного скорпиона Qrto-chirus scrobiculosus вызывает учащение миниатюрных потенциалов, что, по-видимому, объясняется деполяризацией нервного окончания.
Физиологические данные о механизме действия цельных ядов членистоногих Средней Азии на центральные и нервно-мышечные синапсы насекомых позволили дать рекомендации о перспективности выделения из них отдельных токсических компонентов в связи с возможным их использованием в качестве инструментов при изучении холинергических и глутаматэргических синапсов насекомых.
Г Л А В A I
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЯДОВ ПОЗВОНОЧНЫХ И ЧЛЕНИСТОНОГИХ ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
В последние годы токсины животного и растительного происхождения широко используются для изучения специфических функций возбудимых мембран.
Способность токсинов избирательно взаимодействовать с отдельными компонентами синаптических и аксоналышх мембран позволяет с помощью этих соединений исследовать механизмы выделения медиатора из нервных окончаний, их взаимодействие с синап-тическими рецепторами и особенности функционирования ионных каналов.
В нашем обзоре приводятся данные, касающиеся состава и свойств ядов змей, скорпионов, пауков и ряда перепончатокрылых, а также механизмов действия этих ядов на электрически возбудимые мембраны, на синаптическую передачу позвоночных и беспозвоночных (насекомых).
I.I. Состав ядов и методы их получения
Яды животного происхождения содержат биологически активные вещества, в основном полипептидной природы, ряд ферментов. В настоящее время хорошо изучены отдельные компоненты цельных ядов многих змей (Магазаник, Выскочил, 1972; Магазаник, 1977; Lee, Chang, 1966; Ьее, Chen, 1970; Harvey, Gage, 198I), некоторых пауков (Усманов и др., 1983; Meidoiesi, І982),ряда перепончатокрылых (Туйчибоев и др., 1977; Piek et al.,1982а,Ъ; bpanjer et al., 1982). Выделены в очищенном состоянии и определена структура (аминокислотная последовательность) токсических нейропептидов, цитотоксинов, фосфолипаз. Из ядов разных видов скорпионов выделено около 30 токсинов белковой природы (Miranda, Lissitzky, 1958; Miranda et al., 1970; Ziotkin et al., 1971a, 1972Ъ, 1982; Орлов и др., Б77; Гришин и др., 1978; Lazaroviei, Ziotkin, 1979; Юкельсон, Атакузиев, 1982).
По специфической активности эти токсины подразделяются на несколько групп.
К первой группе относятся токсины, избирательно действующие преимущественно на позвоночных. Эти токсины структурно являются простыми полипептидными цепочками, состоящими из 57-58 аминокислотных остатков с общим молекулярным весом 6000-8000 (Miranda, Lissitzky,1958; Miranda et al.,1964; Darban et al.,
1982). Токсины являются сильноосновными полипептидами и в зависимости от рН среды могут находиться в различных молекулярных формах (Roohat et al., 1967). Обычно цепочки полипептидов свернуты и стабилизированы дисульфидными связями, образованными остатками цистеина.
Во вторую группу входят токсины, избирательно действующие на насекомых - инсектотоксины, которые по своей структуре отличаются от токсинов предыдущей группы (ziotkin et al.,1978, 1982; Darban et al., 1982). В частности, из яда пестрого скорпиона Buthus eupeus выделено Ц- различных инсектотоксина, причем 3 из них имеют молекулярные веса около 4000. Структурный анализ токсина I/Ij показал, что его молекула состоит из 36 аминокислотных остатков и каждый четвертый является цистеином (Гришин и др., 1978). - II -
Представителем третьей группы является полипептид, избирательно токсичный для ракообразных. Этот полипептид выделен из яда скорпиона Androctonus australis и состоит из 69 аминокислотных остатков с общим молекулярным весом 8194 Cziotkin et al., 1972).
В яде скорпионов обнаружены также фосфолипазы А и В, гиа-луронидазы, холинэстеразы, протеазы и биогенные амины - гиста-мин, серотонин и другие (Lazarovici, Ziotkin, 1979; Садыков и др., D80).
Токсические компоненты яда пауков по своей химической природе также являются полипептидами. Например, из ядовитых желез паука Latrodectus mactans было выделено несколько токсичных для млекопитающих полипептидов, причем наиболее токсичный оС-латротоксин представлял собой одиночную полипептидную цепь с молекулярным весом 130000(Frontaii et al., 197б). Токсический белок был также получен из ядовитых желез паука Ьо~ xosoeies reciusa при использовании ионнообменной хроматографии. Токсин вызывал высокую смертность мышей, Са2+ зависимый гемолиз эритроцитов человека. Молекулярный вес этого белка был около 31000 (Jang et al., 1979; ВаЪооск et al., 1981). В яде восточноафриканского паука Pterinoohiius обнаружены фракции, характеризующиеся высокой гиалуронидазной активностью (А-г-А?) и содержащие токсические (А^-А^) компоненты (Bachmann, 1982). Среди австралийских пауков наиболее опасным является Atrax го-bustus. в состав яда этого паука входит полипептид, получивший название атраксотоксин с молекулярным весом 15000-25000. Кроме этого токсина в состав яда входят также гамма-аминомас-ляная кислота, спермин, гиалуронидаза (Gilbo, Coles, 1964; Sutherland, 1972).
Токсин полипептидной природы был выделен также из цельного яда тарантула Lycosa singoriensis. Показано, что этот полипептид состоит из 104- аминокислотных остатков и имеет 5 внутримолекулярных дисульфидных связей. Молекулярный вес токсина II7800. В цельном яде тарантула не удалось обнаружить фосфоли-пазной, протеолитической и гемолитической активности (Гришин и др., 1979).
У перепончатокрылых наиболее подробно исследован состав яда пчелы Apis meiiifera. Из цельного яда выделены следующие компоненты, обладающие биологической активностью: 1)ферменты -фосфолипаза А, фосфо липаза В и гиалуронидаза; 2) низкоыолеку-лярные полипептиды, обладающие нейротоксическим и цитотоксиче-ским действием- апамин, мелитин, секапин, минимин, тертиапин; 3) биогенные амины - гистамин, допамин, норадреналин (НаЪег-mann, Reiz, 1964-J Lowy et al., 1971).
На долю мелитина приходится 40-505 веса сухого вещества цельного яда. Молекула межтина состоит из 26 аминокислотных остатков, и ее молекулярный вес равен I2080-I2500 (НаЪегшапп, Kawallek, 1970; Gauldie et al., 1976). С ПОМОЩЬЮ гельфильтра-ции из цельного яда была"выделена пептидная фракция, обладающая нейротоксическим действием - апамин, содержание которого в составе сухого яда составляет 2-Зи/о» При подкожном введении он вызывает некоординированные движения животных, приступы судорог, дыхательные спазмы (НаЪегтапп, 1972).
В составе яда осы Vespa orientalis обнаружены высокомолекулярные фракции, обладающие высокой фосфолипазной активностью. Низкомолекулярные фракции оказывают гемолитическое действие (Туйчибоев и др., 1977). Из яда земляной осы Phi- - ІЗ - lanthus trianguium выделены токсические нейропептиды -Ciybyfa % - филаНТОТОКСИНЫ feiek et al*, 1982).
В яде змей содержатся разнообразные ферменты (фосфолипа-за А, гиалуронидаза, фосфатаза, протеаза, ацетилхолинэстераза) и токсические полипептиды. Считается, что токсические свойства змеиных ядов в основном определяются свойствами токсических нейропептидов (Пигулевский, 1966; Туракулов, Сахибов, 1968; Вальцева, 1969; Lee, 1970, 1972; Сахибов и др., 1972; Mebs, 1973; Karisson, 1973). В настоящее время полипептиды, входящие в состав змей, по механизму своего действия подразделяются на пресинаптические нейротоксины (пре-НГ), постсинаптиче-ские нейротоксины (пост-НТ) и мембраноактивные полипептиды (МАП).
Пре-НГ впервые был выделен из яда кобры Bungarus muiti-oinotus И ПОЛУЧИЛ название /Ь-буНГароТОКСИН (Chang,Lee,1963). Он имеет молекулярный вес 6767 и состоит из 61 аминокислотного остатка (Eaker, Porath, 1967; Yang, 1974a). Из яда австралийского тайпана о. scutelatus выделен полипептид, получивший название тайпоксин. Токсин структурно состоит из трех субъединиц, каждая из которых образована 120 аминокислотными остатками, соединенными 7 дисульфидными мостиками (Eaker,1974). Пре-НТ выделен также из яда бразильской гремучей змеи c.auris-sis terrificus и получил название КрОТОКСИН (Fraenkel-Conrat, Singer, 1956). Этот токсин образован оС и б-белковыми компонентами, причем последний обладает фосфолипазной активностью так ЖЄ, как/З -буНГаротоКСИН (Fraenkel-Conrat et al., 1979).
Пост-НТ, обладающие способностью избирательно блокировать рецепторы постсинаптической мембраны выделены из яда нескольких видов кобр (Туракулов и др., 1971; Yang, 1974). Полипептид, Выделенный ИЗ Яда таЙВансКОЙ КОбры Naja naja atra, ПОЛу- - 14 -чил название кобротоксина (Yang, 1974-ъ). По своей структуре он является полипептидной цепочкой, состоящей из 69 аминокислотных остатков с молекулярным весом 6949 (Yang, 1974а). В последние годы из того же яда была выделена высокоочищенная фосфолипаза Ар, являющаяся полипептидной цепочкой, состоящей из 120 аминокислотных остатков и стабилизированной 14 дисуль-фидными мостиками (Tsai et al., 1981). Высокой избирательностью относительно никотиновых холинорецепторов обладает с^-бун-гаротоксин, выделенный из яда Bungarus multicinctus (Lee,1970). Примером мембраноактивных полипептидов могут быть кардио-токсины, выделенные иа яда кобры Bungarus fasoiatus. Структурно они являются полипептидной цепочкой, состоящей из II7-II8 аминокислотных остатков (1ю, Ly, 1979).
1.2. Цитотоксическое действие мембраноактивных пептидов
В настоящее время хорошо известно, что нарушение функции биомембран при действии змеиных ядов определяется активностью фосфолипазы А и мембраноактивными полипептидами (Condrea,1974). МАП в литературе описаны под различными названиями: кардиоток-сины (Sarcar, 1951)» факторы, деполяризующие скелетную мускулатуру (Meldrum, 1965)» ТОКСИН- V (Izard et al.,1969), прямой ЛИТИЧЄСКИЙ фактор и ЦИТОТОКСИНЫ (Takecai, Hayashi, 1972» Louw, 1974). Значительное нарушение искусственных липидных мембран и клеточных мембран происходит при одновременном действии МАП и фосфолипазы (Condrea, 1974). Считается, что МАП является не только модификатором мембран, но и выполняет роль посредника, связывающего фермент с мембранными структурами (Condrea, 1974).
Цитотоксин яда среднеазиатской кобры Naja oxiana Sich-waid увеличивает проницаемость искусственных мембран для одновалентных катионов, а в присутствии фосфожпазы А укорачивает время жизни этих мембран (Ташмухамедов, Юкельсон,1974). Установлено, что гемолитическое действие ядов змей вызывается фосфожпазой, которая гидролизует лецитин с образованием жирной КИСЛОТЫ И лизолецитина (Neumann, Habermann, 1953)«
Гемолитическое действие фосфолипазы А проявляется только в присутствии свободных фосфолипидов, например, липида плазмы и ионов Саг*, На отмытых эритроцитах она не оказывала литиче-ского действия, поэтому ранее называлась "непрямым гемолизином" (Neumann, Habermann, 1952)* В ОТЛИЧИЄ ОТ фосфолипазы МАП оказывают литическое действие на отмытые эритроциты и были названы "прямым литическим фактором" - ШІФ (Condrea et ai*, 1964; Frykiund, Eaker, 1973). Таким образом, в составе среднеазиатской кобры было доказано существование по крайней мере двух различных по свойствам пожпептидов (Кхоле и др. ,1980а,б). Литическая активность этих пожпептидов относительно эритроцитов убывала в следующей последовательности для разных животных - морская свинка > человек > крыса > лошадь > кролик. ПЛФ тормозит активность дыхательных ферментов в митохондриях печени крысы (Сахибов и др., 1974) и потенцирует гемолитический эффект фосфожпазы А2 (Chang et al., 1972} Орлов,Аратен, 1972; Юкельсон и др., 1974).
МАП присоединяются к клеточным мембранам за счет обилия гидрофобных группировок и взаимодействия поверхностных зарядов, в результате чего эти пептиды проникают в мембранные структуры, взаимодействуя с жпофильными остатками (Condrea, 1974).
Интересно, что мелитин яда пчел подобно цитотоксинам змеиных ядов также усиливает активность фосфолипазы к^ ( Наоег-гаапп, 1972), чем и объясняется его гемолитическая активность. Мелитин также приводит к полному разобщению окислительного фосфорилирования в мембранах митохондрий (oison et ai.,1974).
Состав ядов членистоногих исследован еще крайне мало.Имеющиеся данные не всегда позволяют сделать окончательный вывод какой из полипептидов ответственен за токсическое действие яда. Например, в яде тарантула Lycosa singoriensis не удалось обнаружить протеолитической, фосфолипазной и гемолитической активности (Гришин и др., 1979). Однако, у паука L» reoiusa выделена фракция, обладающая протеолитической активность (Jan-get et ai., 1979). Данные разных авторов о составе яда для представителей одного и того же семейства очень противоречивы. У скорпиона в. eupeus в яде не удалось обнаружить компонентов, обладающих фосфолипазной активностью (Гришин и др.,1978), В ТО же самое время у скорпиона Scorpio maurus palmatus фракция яда избирательно токсичнаядля членистоногих обладает фосфолипазной активностью (Lazorovici et al*, 1979)» Исследования последних лет показали, что яды скорпиона в.eupeus и сколопендры s« arai caspia обладают гиалуронидазной активностью. В ядах этих членистоногих обнаружена также фракция, обладающая избирательной протеолитической активностью относительно гемоглобина (Садыков и др., 1980).
1.3. Влияние ядов и их компонентов на синаптическую передачу позвоночных
Многочисленными исследованиями показано, что цельные яды змей нарушают передачу возбуждения с нерва на мышцу, снижают возбудимость мышечных волокон и деполяризуют их мембрану (Орлов и др., 1970; Cheymol et al., 1966, 1972; Osman et al», 1974). В отличие от цельных ядов постсинаптические НГ избирательно блокируют нервно-мышечную передачу и не влияют на электрические постоянные мембраны мышечных волокон. Эти нейротокси-ны уменьшают амплитуду потенциалов концевой пластинки в холин-ергических нервно-мышечных синапсах позвоночных и снижают амплитуду миниатюрных возбуждающих постсинаптических потенциалов (МВПСП), не влияя при этом на их частоту (chang, Lee, 1966; Lester, 1970; Lee, 1970; Cheymol et al., 1972).
Один и тот же нейротоксин в неодинаковой степени обладает способностью блокировать холинорецепторы постсинаптической мембраны в нервно-мышечных синапсах и в синапсах спинного мозга, что дало основание авторам сделать вывод о различных свойствах рецепторов в этих функционально различных синаптических образованиях (Fulton-ВагЪага, 1980). Из яда таиландской кобры была выделена фракция I, блокирующая холинорецепторы нервно-мышечных синапсов,и фракции П-ІУ, вызывающие деполяризацию и контрактуру волокон соматической и сердечной мышц крысы.Считается, что деполяризация возникает в результате образования в мембране Са каналов и вхождения через них ионов, кальция, которые активируют сократительный механизм (Harvey et al., 1982).
Наиболее подробно в физиологических экспериментах изучен механизм действия оС -бунгаротоксина, который избирательно блокирует хожнорецепторы постсинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов позвоночных, препятствуя деполяризующему действию ацетилхолина и его агонистов (Магазаник, Выскочил,1972; Лукомский, Магазаник, 1974; Захаров, Спиридонов,1974; Chang, - 18 -Lae, 1966; Lester et al., 1972). Избирательность сі -бунгаро-токсина проявляется в том, что он не блокирует никотиновые хо-линорецепторы симпатических ганглиев (Магазаник, 1977; Chiap-pineili et al., 1981), холинорецепторы сердечной мышцы миноги (Лукомская, Магазаник, І974-). Несмотря на высокую избирательность Ы. -бунгаротоксина относительно холинергических нервно-мышечных синапсов позвоночных, механизм его блокирующего действия еще не вполне ясен. Высказывается предположение, что он не находится в конкурентных отношениях с синаптическим ацетил-холином и действует не на активный центр холинорецептора, а на другие компоненты холинорецептирного комплекса, возможно, на ионофоры (Магазаник и др., 1974; Магазаник, 1977;).
Пресинаптическим действием обладайте - бунгаротоксин (Lee, Chen, 1970; Wernike et al., 1974; Spokes, Dolly» 1979), тайПОКСИН (Kamenskaya, Thesleff, 1979; Garatsch et al*, 1981) и текстилтоксин, выделенный из яда австралийской коричневой змеи F. textilis (Su et al., 1983). В общем, характер действия во времени пресинаптических токсинов на параметры МВПСП был сходным. Первоначально происходило незначительное снижение частоты МВПСП, затем частота и амплитуда потенциалов резко возрастали. На последней стадии действия токсинов уменьшалась частота МВПСП и квантовый состав потенциалов концевой пластинки (Kamenskaya, Thesleff, 1979; Hamilton et alt,1980). Электронно-микроскопические исследования показали, что при действии токсинов синаптические пузырьки образуют конгломераты, и количество их в терминалях резко уменьшается (Hamilton et al., 1980). Возникающий под влиянием этих токсинов блок синаптической передачи связывается с истощением запасов медиатора В двигательных терминалях (Caratsoh et al.,1979; Harvey, - 19 -Gage, 1980). Фаза увеличения частоты МВПСП объясняется деполяризующим действием а -бунгаротоксина на мембрану двигательных терминален (Harvey, Gage, 1980; Alderdice, Yolle, 1981).
Ионы Са + необходимы для активации нейротоксинов. Однако, по- скольку известно, что ионы Са активируют также фосфолипазу, были поставлены контрольные опыты. В этих опытах из раствора устранялись ионы Са , однако, несмотря на их отсутствие пре-синаптический эффект токсина проявлялся. Инактивация фосфолипазы пара-бромфенил ацетатом также не влияла на пресинаптиче-
СКИЙ характер действия тайШТОКСИНа (Kamenskaya, Thesleff,
1979). Таким образом, считается, что пресинаптические эффекты могут быть обусловлены специфическим действием токсинов на процессы выделения медиаторов (Harris, lilac Donell,1979). ЭТО положение подтверждается данными о том, что л -бунгаротоксин не только нарушает выделение ацетилхолина, но и способствует истощению в терминалях запасов других медиаторов - гамма-ами-номасляной кислоты, серотонина, норадреналина и др. (v/ernike ;et al., 1974; Caratscti et al«, 1979; Spokes, Dolly, 1979)*
Выделение цельных ядов и отдельных фракций из ядовитых желез различных видов скорпионов показало, что содеркащиеся в них токсические нейропептиды обладают селективным действием на натриевые каналы возбудимых мембран (Можаева и др., 1979; Catteraii, 1977). В опытах на перехватах Ранвье аксонов лягушки (Можаева и др., 1979), на гигантских аксонах кальмара и рака было установлено, что при действии токсинов нарушается процесс инактивации натриевых каналов и повышается чувствительность каналов к деполяризующему действию тока (Catteraii, 1980). Эти результаты получены в электрофизиологических экспериментах с использованием метода фиксации напряжения на мемб- - 20 -ране, и достоверность их подтверждается тем, что действие токсина блокируется селективным блокатором натриевого транспорта-
ТетродОТОКСИНОМ (Gayffon, 198І).
Под влиянием токсинов в двигательных окончаниях мышц позвоночных также предотвращается инактивация натриевых каналов. В результате деполяризации пресинаптической мембраны увеличивается выброс ацетилхолина, и частота МВПСП возрастает (з?хек, 1981). Например, титиустоксин бразильского скорпиона T.serru-latuss увеличивал освобождение ацетилхолина и стимулировал его синтез в срезах гипоталамуса, полосатого тела и гипокампа крыс. Эффекты зависели от содержания в окружающей среде ионов Са + и На+. Предполагается, что под влиянием токсина увеличивается входящий натриевый ток, что вызывает сопряженное поступление внутрь аксональных терминалей Са + и, как следствие,учащение МВПСП (Moedo, Gome, 1982).
Выделенный из яда паука L» mactans полипептид оС-латро- токсин вызывает высвобождение из срезов мозга млекопитающих медиаторов различной химической природы - ацетилхолина, норад-* реналина, гамма-аминомасляной кислоты (Frontal! et al., 1972; .Cull-Candy et al., 1973 5 Smith et al., 1977; Fritz et al*,
1980; Meidoiesi, 1982). Пресинаптическое действие латротокси-на проявляется также в увеличении частоты МВПСП в нервно-мышечных синапсах лягушки (Магазаник и др., 1982; Longenecker et al., 1970). Действие токсина сопровождается набуханием двигательных терминалей и почти полным исчезновением синаптических пузырьков (Clark et al., 1972, Cull-Candj'- et al., 1973). В основе механизма действия этого токсина, вероятно, лежит увели- -чение проницаемости мембраны для ионов Са2+ (Усманов и др., 1982).
1.4. Функциональные особенности центральных и нервно-мышечных синапсов насекомых
В связи с тем, что задачей нашего исследования являлось изучение влияния членистоногих на синаптическую передачу у насекомых, необходимо характеризовать функциональные и структурные особенности синаптического аппарата этих животных и в частности саранчи Locusta migratoria migratorioides R.F. И американского таракана Peripianeta americana L. - объектах, на которых выполнялась работа. Отсутствие внутреннего скелета,который заменяет плотный наружный хитиновый покров, особенности метаморфоза, разнообразие и сложность форм локомоторного поведения обусловили особенности анатомической и функциональной организации центральной нервной системы и двигательного прибора этих животных,
1.4.I. Иннервация мышц и физиология нервно-мышечных синапсов
Все мышцы насекомых являются поперечно-полосатыми по своей структуре. Мышечные волокна состоят из миофибрилл, имеющих поперечную исчерченность , митохондрий, клеточных ядер, сарко-плазматического ретикулума и системы поперечных трубочек (Мандельштам, Свидерский, 1974; Tiegs, 1955)- В зависимости от размера и расположения миофибрилл мышцы насекомых подразделяются на трубчатые, плотноупакованные и фибриллярные ( Tiegs, 1955; Edwards, 1960). Крыловые мышцы саранчи относятся к плот-ноупакованным мышцам. Миофибриллы располагаются в них очень близко друг к другу, и между ними располагается большое число МИТОХОНДРИЙ (Smith, 1960; Atwood, 1967).
Длительное время считалось, что все мышцы членистоногих однородны по составу образующих их волокон. Однако, за последние десятилетия накопились факты о существовании структурной и функциональной дифференцировки волокон в локомоторных мышцах членистоногих (Wilson, 19625 Neville,1963» Kutsch, Usher-wood, 1970). Гистохимическими, электронно-микроскопическими исследованиями (Шумова, 1973; Мандельштам, Шумова, 1974) показано, что крыловые мышцы саранчи могут состоять из функционально неоднородных волокон. Особенно хорошо изучена тергококса-льная мышца (мышца 120) саранчи. Эта мышца состоит из нескольких пучков, причем ростральный ее пучок состоит исключительно из фазных волокон. Структурная однородность волокон этого пучка явилась причиной использования его в электрофизиологических опытах по изучению физиологии нервно-мышечных синапсов насекомых (Григорьев, 1980). В настоящей работе также использовались волокна этого мышечного пучка.
Отличительной особенностью мышц насекомых является то, что они могут получать полинейрональную иннервацию. Одно и то же мышечное волокно может иннервироваться аксонами быстрых и медленных мотонейронов (Pringie, 1939), а также аксонами тормозных нейронов (Usherwood, Grundfest, 1968). Каждый из аксонов образует большое число синаптических контактов по ходу своего ветвления на волокне, и этот тип иннервации получил название мультитерминальной. Большое число синаптических контактов (100-120), находящихся на волокне сравнительно небольшой длины, позволяет регистрировать миниатюрные потенциалы в любой точке волокна.
Структура нервно-мышечных синапсов насекомых изучена в крыловых мышцах цикад (Edward et al., 1958), жуков (Smith, I960), саранчи и шмеля (Мандельштам, 1965, 1968), в ножных мышцах саранчи (Cochrane et ai., 1972). Двигательные окончания в мышцах насекомых располагаются на выростах саркоплазмы и от окружающей среды отделены лемнобластами и трахеобластами (Hamori, 1963). Базальные мембраны этих клеток сливаются с базальной мембраной сарколеммы и полностью изолируют область синапса от окружающей среды (Мандельштам, 1967; 0бЪогп,197О).
В синапсах различают пре- и постсинаптические части. Пре-синаптическую часть образуют аксоны, которые в месте контакта с сарколеммой лишены лемнобластов. В пресинаптической области находятся митохондрии, мембранные элементы ретикулума, светлые синаптические пузырьки диаметром 40-50 нм. В постсинаптичеокой области находится большое число апосинаптических гранул и отдельные митохондрии (Мандельштам, Свидерский, 1974; Edwards, et al., 1958). Между аксональной мембраной и сарколеммой имеется пространство, получившее название синаптической щели, ширина которой варьирует в различных мышцах от 10 до 25 нм (Smith, 1960; Osborne, 1970).
В мышечных волокнах насекомых величина мембранного потенциала (МП) колеблется В пределах 30-80 MB (Huddart, 1971). У саранчи плазматическая мембрана мышечных волокон ведет себя как калиевый электрод. Другими словами, МП этих волокон определяется соотношением концентраций ионов К+ по обе стороны мембраны и может быть выражен уравнением Нернста (Мандельштам и др., 1968; Захар и др., 1978).
При раздражении двигательных нервов в мышечных волокнах генерируются депо ля ризацио иные потенциалы с ампжтудой 1-100 мВ, которые отражают возбуждение двигательных аксонов. Гиперполяризационные изменения МП, регистрируемые в некоторых волокнах, составляют 0,5-15 мВ и коррежруют с наличием в этих волокнах тормозной иннервации (usherwood, 1967). Фазные волокна терго-коксальной мышцы саранчи иннервируются только двигательными нейронами и поэтому при раздражении сегментарных нервов в ней регистрируются только деполяризационные потенциалы (Григорьев, 1980).
В фазных волокнах позвоночных при достижении критического уровня величины ВПСП генерируется потенциал действия, который распространяется на мембране без декремента (Kata, 1967). В мышцах насекомых величина ответа электрически возбудимой части мембраны зависит от амплитуды ВПСП. Распространение потенциала действия по мембране волокна происходит с декрементом.
Возбуждающим медиатором нервно-мышечной передачи у насекомых в синапсах, образованных аксонами быстрых и медленных мотонейронов, является I -глутаминовая кислота (Gersohenfeid, 1973; Usherwood, Cull-Candy, 1975)* Глутаматные рецепторы располагаются не только на постсинаптической мембране синапсов, НО И внесинаптически (Lea, Usherwood, 1973). В МЫШбЧНЫХ ВОЛОК-нах саранчи по характеру изменений МП в ответ на микроаппликацию -глутамата различают Д- и Н-ответы, соответственно деполяризационные и гиперполяризационные изменения потенциала (Cull-Candy, 1976). Считается, что на постсинаптической мембране преимущественно располагаются Д-глутуматные рецепторы. Д-ответы обусловлены увеличением проницаемости мембраны к ионам Na+, а Н-ответы - к ионам сі". Б растворах без ионов сі" не удается получить Н-ответы (Cull-Candy, 1976).
Опытами с использованием методики фиксации напряжения на мембране было показано, что в нервно-мышечных синапсах мышцы ретрактора коготка саранчи Schistocerca gregaria под влияни- ем медиатора увеличивается проницаемость мембраны к ионам натрия и калия (Anwyi, иsherwood, 1974; Anwyi, 1977а,ъ). Удаление из раствора ионов На+ не приводит к полному исчезновению входящего тока, если в этом растворе находятся ионы Са +. Считается, что ионные каналы постсинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов характеризуются низкой селективностью.Синап-тические токи регистрируются при замене ионов натрия ионами аммония, метиламмония, гуанидина, размер которых больше ионов натрия. Эти факты свидетельствуют об относительно большом диаметре ионных каналов и явились основанием считать, что ионы натрия и калия проходят через один и тот же канал ( Anwyi, 1977а,Ъ).
Спонтанно выделяющиеся молекулы медиатора взаимодействуют с рецепторами постсинаптической мембраны, изменяют ее проницаемость, и это приводит к генерации миниатюрных постсинап-тических потенциалов. МВПСП регистрируются в нервно-мышечных синапсах позвоночных (Fatt, Katz, 1952) и насекомых (Usher-wood, 1961; Piek, Mantel, 1970). в мышечных волокнах насекомых, иннервируемых тормозными аксонами, кроме МВПСП, регистрируются также тормозные миниатюрные потенциалы гиперполяризационного типа (Usherwood, Grundfest, 1965)» Частота МВПСП в мышцах насекомых уменьшается при увеличении в окружающей среде содержания ионов магния (v/asaio, Inouye, 1978). Анализ межимпульсных интервалов показал, что характер распределения МВПСП в мышечных системах насекомых так же, как и в мышцах позвоночных, описывается формулой биноминального распределения (Bliss, Owen, 1958; Ress, 1974). Таким образом, целый ряд факторов позволяет говорить о сходстве процессов выделения медиатора в - 26 -холинергических нервно-мышечных синапсах позвоночных и глута-матэргических синапсах насекомых.
1.4-.2. Анатомия и морфология сегментарных ганглиев
Центральная нервная система насекомых состоит из ряда ганглиев, соединенных между собой коннективными волокнами.Число ганглиев у разных видов насекомых варьирует. Например, у двукрылых (biptera) насекомых имеется мозговой, подглоточный и один слитный грудной ганглий. У представителей прямокрылых (orthoptera) и тараканообразных (Biattoptsra), к которым относятся объекты наших исследований, саранчи L* migratoria mig-ratorioides и американского таракана Periplaneta americana имеются мозговой, подглоточный, 3 грудных и б брюшных ганглиев (Bullock, Horridge, 1965)»
Грудные ганглии наиболее крупные и имеют более сложное строение, поскольку содержат нейроны, координирующие локомоторные реакции насекомых - ходьба, плавание, прыжки и полет (Свидерский, 1980).
Ганглии и соединяющие их конвективные волокна покрыты плотной оболочкой, которая состоит из неврилеммальной пластинки и слоя клеток периневриума. Клетки периневриума принимают участие в активном транспорте питательных веществ, метаболитов И ИОНОВ (Smith, Treheme,1963; Treherne, 3chofield,198l).
Непосредственно под оболочкой находятся клеточные тела мотонейронов и интернейронов, отростки которых идут в центральную часть ганглия - нейропиль. В нейропиле клеточный отросток расширяется, образует мозговое разветвление, от которого отходят дендриты и аксон (Заварзин, B4-I). У мотонейронов аксоны вы- - 27 -ходят из ганглия в составе сегментарных нервов и иннервируют мышцы. Интернейроны выполняют интегративную функцию в центральной нервной системе, и их аксоны образуют синаптические контакты с дендритами нейронов этого же иж других гангжев нервной цепочки насекомых (Мандельштам, 1969; Smith, Treherne, 1963; Osborne, 1965)*
Межнейрональные контакты морфологически очень разнообразны. Электронно-микроскопическими исследованиями показано, что в нейропиле преобладают поляризованные контакты (Trujuiio-Ce* noz, 1959, 1962; Osborne, 19бб). В местах контактов мембраны аксонов имеют примембранные уплотнения и один из аксонов, который считается пресинаптическим, содержит большое число светлых пузырьков (Smith, 1965; Osborne, 19бб)» Размер пузырьков колеблется в пределах 40-50 нм. В синаптической щеж этих контактов гистохимическими методами обычно выявляется хожнэсте-раза (Smith, Treherne, 1965)* Большинство менаксональных контактов в нейропиле имеют такое строение, и их морфологические особенности позволяют их квалифицировать как холинергические синапсы (Мандельштам, 1983). Аксоны могут содержать и другие включения - нейросекреторные гранулы, электронно-плотные пузырьки. В ряде случаев мембраны соседних аксонов плотно прилежат друг к другу, но в местах прилежания мембраны неспециали-зированы (Osborne, 1966; Huddart, 1971). Допускается, что в этих контактах возможна передача нервных импульсов электрическим способом, как это описано для межаксональных контактов сходной морфологической структуры в нервной системе ракообразных (Furshpan, Potter, 1959).
1,4.3. Физиология церкальных синапсов таракана
Осуществление разнообразных и сложных форм двигательного поведения обеспечивается по сравнению с позвоночными у насекомых относительно небольшим числом нейронов (Свидерский, 1980). Практически обязательным элементом всех рефлекторных дуг, связанных С ЛОКОМОЦИЄЙ, ЯВЛЯеТСЯ ИНТернейрОН (Deloomyn, Daley, 1979; Pearson, 1981). Интернейроны координируют активность отдельных групп мотонейронов, обеспечивают "патерн" или, как иногда говорят, "рисунок" двигательной реакции, безспайковые интернейроны регулируют возбудимость мотонейронов (Тыщенко, 1977; Свидерский, 1980). Интернейроны также участвуют в быстрой передаче сигналов от периферических рецепторных нейронов к эффекторам и таким образом обеспечивают выполнение двигательных реакций, имеющих важное значение при уходе насекомых от опасных факторов внешней среды. В связи с необходимостью быстрой передачи сигналов аксоны этих интернейронов имеют обычно очень крупный диаметр - 40-60 мкм (Spira et al*, 1969).
У таракана Peripianeta americana такая группа интернейронов в количестве 14 клеток находится в 6-ом брюшном ганглии нервной цепочки. Сома интернейронов занимает строго определенное положение в ганглии, а аксоны в количестве 7 проходят в каждом коннективном волокне (Spira et ai«, 1969)* Не образуя синаптических контактов, без перерыва аксоны доходят до грудных ганглиев, где сигналы передаются на дендриты мотонейронов. Часть аксонов достигают головных ганглиев и контактируют с клеточными отростками мотонейронов, иннервирующих мышцы антенн (Parnaa, Bagan, 1971)-
Аксоны рецепторных нейронов в составе церкальных нервов, - 29 -X и XI нервы по номенклатуре Roeder (1948а), приходят в 6БГ, где образуют синаптические контакты, получившие название церкальных синапсов, с дендритами описанных выше интернейронов. При раздражении церок сигнал передается на систему гигантских интернейронов и на мотонейроны и таким образом насекомое уходит от опасности. Эта биологически важная реакция получила название "реакции убегания" (escape reaction; Roeder, 1948а).
Морфологические особенности организации описанной нейро-нальной системы явились причиной широкого использования 6БГ в качестве методической модели для изучения физиологии синапти-ческой передачи в центральной нервной системе насекомых (Жуков, Мандельштам, 1982; Callec, Sattelle, 1973).
Первыми нейрофизиологическими исследованиями Редера и соавторов (Roeder et al., 1947) было показано, что медиатором церкальных синапсов у таракана является ацетилхолин. При внеклеточной и внутриклеточной регистрации нейрональной активности в этом ганглии наблюдаж учащение импульсной активности под влиянием ацетилхолина (Callec, Boistel,1967j Boistel,i968). В нейропиле ганглия гистохимическими методами была обнаружена хо-линэстераза, ее активность достаточно высока и составляет 2,5 мкмоль ацетилтиохолина на мг ткани в час (Мандельштам, 1978).
Последний брюшной ганглий использовался для изучения механизма действия антихолинэстеразных соединений на синаптиче-скую передачу у насекомых (Жуков, Мандельштам, 1982; Roeder, 1948Ъ; Narashashi, Yamasaki, 1960). Предложенная Каллеком методика "сахарозного мостика" (Calleo, 1972) способствовала развитию исследований с использованием 6-го брюшного ганглия таракана (Callec, Sattelle, 1973). Была доказана роль никотиновых холинорецепторов в церкальных синапсах и проведен деталь- - зо - ныи анализ свойств холишрецепции этих синапсов с помощью большого набора холинолитических соединений (Жуков,1981; Жуков, Мандельштам, 1982; Мандельштам, 1983).
Таким образом, церкальные синапсы 6БГ таракана являются крайн удобной методической моделью для изучения влияния различных биологически активных соединений на передачу нервных импульсов в холинергических синапсах, В этой связи в нашей работе последний брюшной ганглий таракана был использован как объект для исследования действия цельных ядов членистоногих на холинергические синапсы насекомых, І.4-.4. Влияние ядов и нейротоксинов на нервную систему насекомых
Данных о влиянии ядов и нейротоксинов на нейрональную активность у насекомых сравнительно мало. В опытах на церкаль-ных синапсах был получен блок синаптической передачи при действии яС-бунгаротоксина (Satteiie et ai., 1980)'. Меченный об-бунгаротоксин был выявлен в области локализации церкальных синапсов в 6БГ таракана (Satteiie, 1980). В концентрации 0,1 мкг/мл яд скорпиона L. .quinquestriotus увеличивает квантовый состав ВПСП в нервно-мышечных синапсах краба (Farnas et al., 1970), а при удалении наружных оболочек вызывает вспышки потенциалов действия в тимпанальном нерве саранчи (ziotkin et al*, 1970).
Блок синаптической передачи в церкальных синапсах таракана наблюдался также при действии яда каракурта Latrodectus maotans, причем блоку предшествовали вспышки нейрональной ак- - ЗІ - тивности (D'Ajeiio et al., 1969). Исследование механизма действия отдельных компонентов ядов началось практически недавно, после того как из яда скорпиона A. australua были выделены фракции, избирательно токсичные для млекопитающих и насекомых (ziotkin et ai., 1979). Токсические нейропептиды яда скорпиона увеличивают частоту МВПСП в нервно-мышечных синапсах саранчи, причем в большей степени страдают синапсы, образованные аксонами медленных мотонейронов (waither et al», 1976).
Особенный интерес представляют данные о влиянии ядов земляных ОС НаЪгаЪгасоп juglandis И Philanthus triangulum на передачу нервных импульсов в нервно-мышечных синапсах насекомых. Избирательное сродство яда этих ос к глутаматэргическим синапсам саранчи (Waither, Rathmayer,1974; Piek et al., 1982) дает основание предполагать, что в процессе эволюции некоторые представители ядовитых членистоногих выработали приспособление, которое позволяет им избирательно влиять на двигательный аппарат своей жертвы. Исследование токсинов яда земляной осы Fhi-lamthus triangulum показало, что некоторые из них нарушают нервно-мышечную передачу у насекомых, а другие оказываются более активными относительно центральных синапсов (piek et al*, 1982; Spanjer et al., 1982).
Систематического исследования и анализа действия ядов на синаптическую передачу и на отдельные звенья синаптического аппарата насекомых, несмотря на приведенные данные, фактически не проводилось. Особый интерес представляют для изучения яды членистоногих, которые охотятся на насекомых. Высокая избирательность компонентов исследованных ранее ядов относительно от- дельных структур возбудимых мембран явилась основанием для изучения механизма действия новых впервые выделенных ядов членистоногих. В этой связи нами и было предпринято изучение влияния выделенных в Институте биохимии АН УзССР ядов на центральные и нервно-мышечные синапсы насекомых.
Состав ядов и методы их получения
Яды животного происхождения содержат биологически активные вещества, в основном полипептидной природы, ряд ферментов. В настоящее время хорошо изучены отдельные компоненты цельных ядов многих змей (Магазаник, Выскочил, 1972; Магазаник, 1977; Lee, Chang, 1966; Ьее, Chen, 1970; Harvey, Gage, 198I), некоторых пауков (Усманов и др., 1983; Meidoiesi, І982),ряда перепончатокрылых (Туйчибоев и др., 1977; Piek et al.,1982а,Ъ; bpanjer et al., 1982). Выделены в очищенном состоянии и определена структура (аминокислотная последовательность) токсических нейропептидов, цитотоксинов, фосфолипаз. Из ядов разных видов скорпионов выделено около 30 токсинов белковой природы (Miranda, Lissitzky, 1958; Miranda et al., 1970; Ziotkin et al., 1971a, 1972Ъ, 1982; Орлов и др., Б77; Гришин и др., 1978; Lazaroviei, Ziotkin, 1979; Юкельсон, Атакузиев, 1982).
По специфической активности эти токсины подразделяются на несколько групп.
К первой группе относятся токсины, избирательно действующие преимущественно на позвоночных. Эти токсины структурно являются простыми полипептидными цепочками, состоящими из аминокислотных остатков с общим молекулярным весом 6000-8000 (Miranda, Lissitzky,1958; Miranda et al.,1964; Darban et al.,
1982). Токсины являются сильноосновными полипептидами и в зависимости от рН среды могут находиться в различных молекулярных формах (Roohat et al., 1967). Обычно цепочки полипептидов свернуты и стабилизированы дисульфидными связями, образованными остатками цистеина.
Во вторую группу входят токсины, избирательно действующие на насекомых - инсектотоксины, которые по своей структуре отличаются от токсинов предыдущей группы (ziotkin et al.,1978, 1982; Darban et al., 1982). В частности, из яда пестрого скорпиона Buthus eupeus выделено Ц- различных инсектотоксина, причем 3 из них имеют молекулярные веса около 4000. Структурный анализ токсина I/Ij показал, что его молекула состоит из 36 аминокислотных остатков и каждый четвертый является цистеином (Гришин и др., 1978).
II Представителем третьей группы является полипептид, избирательно токсичный для ракообразных. Этот полипептид выделен из яда скорпиона Androctonus australis и состоит из 69 аминокислотных остатков с общим молекулярным весом 8194 Cziotkin et al., 1972).
Энтомологическая характеристика исследованных ядовитых членистоногих
Паук Eresus niger И погребной паук Segestria florentina обитают в степных и полупустынных зонах Северного Кавказа, Крыма и Средней Азии. Лже-каракурт steatoda paykulliana наиболее часто встречается в степных зонах Средней Азии и степях Северного Кавказа. Тарантул Lycosa singoriensis обитает преимущественно в лесостепной зоне. Черный скорпион Ortoohirus
scrobicuiosus встречается в песчаных пустыняхи каменистых местностях Средней Азии. Сколопендра Scoiopenura oinguiata относится к классу многоножек (Myripoda), местообитание ее -степные зоны Средней Азии и Крымской области.
Лже-каракурт и другие пауки питаются в основном насекомыми, видовой состав которых очень разнообразен. Это могут быть представители двукрылых (мухи), прямокрылых (саранчевые), чешуекрылых (бабочки и их личинки), а также жуки, клопы и ряд других насекомых (Иванов, 1965; Пигулевский, 1975).
Ядовитые железы у пауков располагаются в основании хели-цер, видоизмененной первой пары конечностей, и заходят в головогрудь. Жертва схватывается хелидерами, на вершине которых находится острый изогнутый в виде коготка концевой членик. На концах когтевидных члеников открываются протоки ядовитых желез. Каждая железа окружена спиралевидной мускулатурой, при сокращении которой происходит выделение яда.
Скорпионы ведут преимущественно ночной образ жизни. Добычей для них являются насекомые и некоторые пауки. Иногда скорпионы нападают на мелких позвоночных животных. Ядовитая железа находится в последнем членике "метасомы" (Иванов, 1965). Этот членик (тельсон) крупнее других и заканчивается кривым заостренным жалом, внутри которого проходит проток ядовитой железы. Жертва схватывается хелицерами и, если она оказывается крупной, скорпион изгибает "метасому" и жалит жертву несколько раз, до полного ее обездвиживания (Иванов, 1965).
У сколопендры первая пара туловищных ног преобразована в хватательные ногочелюсти, заканчивающиеся серповидными коготками. Ядовитые железы находятся в основании концевого членика ногочелюсти и проток ее открывается на вершине коготка. Пищей многоножек являются насекомые, пауки, и, так же как у скорпионов, яд обычно используется в случае крупных размеров жертвы.
Токсичность и вжяние цельных ядов на проведение нервных импульсов по гигантским аксонам нервной цегочки таракана
Как уже было отмечено нами в литературном обзоре, действие нейротоксинов ядов некоторых членистоногих хорошо изучено. Это прежде всего относится к ядам скорпионов, пчел, каракурта. Эффекты ядов членистоногих и механизм их действия отличаются чрезвычайным разнообразием.
Рассматриваемые нами яды ранее почти не изучались. Поэтому в предварительных экспериментах наїли были изучены симптомы отравления у тараканов при введении ядов. Эти наблюдения могут дать некоторую предварительную информацию о действии нейротоксинов ядов.
Общим для всех исследованных ядов явилось то, что они оказывают влияние на двигательное поведение тараканов. Различия между отдельными ядами проявлялись в неодинаковой степени нарушения двигательных реакций и в различии величин ЛД . Интересно сопоставить различия в симптомах отравления, наблюдаемых у тараканов при введении летальных доз.
При введении ядов сколопендры s» cinguiata и тарантула L. singoriensis первоначально наблюдается незначительное повышение двигательной активности и только через 4-8 часов отмечается нарушение координации движений. Тараканы переворачиваются дорзально вниз, и в течение длительного времени наблюдаются судорожные подергивания конечностей.
Яд паука я. niger изменял двигательное поведение тараканов значительно быстрее. Через 30-40 минут после введения яда нарушалась координация движений, и наступал паралич.
При инъекции летальной дозы яда черного скорпиона о. soro-bicuiosus усиление двигательной активности происходило через 2-3 минуты. Тараканы сразу же переворачивались на спинку, совершая некоординированные движения конечностями, а затем эти движения переходили в длительный тремор.
Яд погребного паука s« fiorentina не вызывал усиления двигательной активности. После 20-30 минут с момента введения яда движения насекомых замедлялись, и наступал паралич. В отдельных случаях тараканы переворачивались на спинку, и наблюдались единичные подергивания конечностей.
Яд лже-каракурта s. paykuiiiana наиболее сильно влиял на двигательную активность тараканов. Судорожные пробежки чередовались с кратковременными периодами неподвижности. Во время пробежек насекомые часто переворачивались на спинку, и это сопровождалось судорожными движениями конечностей. Полное обездвиживание наступало через 40-50 минут после введения яда.
Время наступления двигательных нарушений и их интенсивность зависели от природы введенного яда и коррелировали с величинами ЛД (рис. б). На приведенных графиках определения токсичности ядов для тараканов видно, что характер действия ядов сколопендры и тарантула отличается от других ядов. Число погибших насекомых увеличивается очень медленно по мере возрастания действующей концентрации. Возможно это объясняется плохим проникновением ядов, так как при внутриполостных инъекциях двигательные нарушения у насекомых наступают также поздно, через несколько часов
class3 ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЦЕРКАЛЬНЬК СИНАП
СОВ ШЕСТОГО БРЮШНОГО ГАНГЛИЯ class3
Потенциал ганглия и синаптические ответы
При помещении 6БГ в экспериментальную камеру и перфузии через нее физиологического раствора потенциал ганглия колеблется. Это вероятно объясняется тем, что необходимо время для установления новых ионных равновесий вблизи нейронов внутри ганглия. После 60-90 минут перфузии потенциал ганглия устанавливается на постоянном уровне и не изменяется в продолжение 5-6 часов. Стабильность потенциала ганглия являлась обязательным условием проведения последующих экспериментов. Раздражение церка-льных нервов одиночными стимулами сопровождалось синаптически-ми ответами, амплитуда которых не менялась в продолжение многих часов (рис. II). От опыта к опыту колебались только пороговые величины тока, вызывающего синаптические ответы. Ампжтуда пост-синаптических ответов зависела от силы раздражения и колебалась в пределах 0,5-1,5 мВ (рис, II). Это объясняется тем, что в опытах регистрировались суммарные синаптические ответы ряда гигантских аксонов. В каждом коннективном волокне проходит 7 гигантских аксонов интернейронов, дендриты которых образуют цер-кальные синапсы (Farnas, Dagan, 1971). По мере увеличения силы раздражающего тока увеличивается число аксонов, участвующих в постсинаптических ответах. При раздражении церкальных нервов током небольшой силы регистрируются только возбуждающие постси-наптические потенциалы (ВПСП). По мере увеличения амплитуды раздражющего тока на фоне суммированных ВПСП появляются потенциалы действия. Амплитуда потенциалов колеблется в пределах 5-8 мВ (рис. ІІБ). На нисходящей фазе суммарного ответа могли появляться низкоамплитудные потенциалы, которые являются результатом возбуждения интернейронов с аксонами меньшего диаметра, чем гигантские аксоны брюшной нервной цепочки.
class4 ВЖЯНИЕ ЯДОВ НА ИНТЕРНЕЙРОНЫ 6-ГО БРЮШЮГО
ГАНГЖЯ ТАРАКАНА class4
Яд сколопендры Scolopendra cingulata
В концентрации 1 Ю""5 г/ыл яд вызывал деполяризацию, которая в течение 20-30 минут увеличивалась до 4-8 мВ. При действии более высоких концентраций (4 10 5 г/мл) деполяризация развивалась быстрее и достигала 15-20 мВ. Деполяризация ганглия до величин порядка 7-8 мВ приводила к возбуждению интернейроюв и в опытах регистрировались потенциалы действия 500 мкВ и частотой следования 40-50 имп/с. По мере увеличения деполяризации частота потенциалов увеличивается. Появляются высокоамплитудные потенциалы 1-1,5 мВ (рис. І5Б), которые вероятно, определяются активностью гигантских аксонов брюшной нервной цепочки.Наличие низкоамплитудных потенциалов позволяет говорить о том, что помимо интернейронов, образующих церкальные синапсы, возбуждается также большое число других нейронов, имеющих аксоны меньшего диаметра. Независимо от концентрации яда во всех опытах в его присутствии происходит реполяризация ганглия и постепенно потенциал возвращается к исходным значениям (рис. 15).
Во время высокоамплитудной деполяризации, вызванной действием яда в концентрации 4 Ю 5 г/мл, синаптические ответы исчезали в результате деполяризационного блока. Сходные нарушения синаптической передачи наблюдались нами при использовании ацетилхолина и карбахолина (см. гл. 4) и были описаны другими авторами для целого ряда холиномиметических соединений (Жуков, Мандельштам, ЗЭ82; Sattelle et al., 1976).
Наибольший интерес представлял блок синаптической передачи, наступавший при действии сравнительно небольших концентраций яда 1 Ю 5 г/мл и при условии возвращения потенциала ганглия к исходному уровню (рис. 15). Длительное отмывание до 1-1,5 часов ни в одном случае не приводило к восстановлению синаптической передачи в церкальных синапсах. Таким образом, этот блок синаптической передачи несомненно был обусловлен специфическим действием компонентов яда сколопендры на синаптический аппарат. Сохранение электротонических потенциалов (рис. I5B) доказывает, что в исследуемых концентрациях яд не нарушает проведения по чувствительным волокнам церкальных нервов.
В специальной серии экспериментов сравнивались деполяризующие эффекты карбахолина до и после действия яда для того, чтобы выяснить не является ли нарушение синаптической передачи результатом блока холинорецепторов интернейронов. Амплитуды деполяризации в ответ на аппликацию карбахолина в концентрации I«I0"" М в физиологическом растворе и на фоне действия яда в концентрации 1-Ю""5 г/мл не отличались (рис. 16). Карбахолин применялся на 90 минуте действия яда, когда синаптическая передача в церкальных синапсах блокирована. Деполяризация в ответ на аппликацию карбахолина так же, как в контроле, сопровождалась вспышками импульсной активности (рис. 16).
В связи с необратимым действием на нейроны ганглия яда сколопендры, а также и других исследованных нами ядов, в опытах невозможно было дважды получить деполяризационные эффекты одной и той же концентрации. Поэтому при изучении действия "магниевого раствора" и арпенала на деполяризационные ответы нейронов, вызванные действием яда,приходилось пользоваться усредненными величинами, полученными при одних условиях, но в разных
