Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Внеклеточный матрикс соединительных тканей 8
1.1. Общий состав и строение соединительных тканей 8
1.2. Гликозаминогликаны, протеогликаны, протеогликановые агрегаты и методы их определения в ткани. 12
1.2.1. Гликозаминогликаны (ГАГ) 12
1.2.2. Протеогликаны 14
1.2.3. Протеогликановые агрегаты 16
1.2.4. Методы количественного определения гликозаминогликанов 17
1.3. Коллаген как важнейшая составляющая соединительных тканей. Методы определения в ткани. 22
1.3.1. Синтез и посттрансляционная модификация коллагена. 22
1.3.2. Морфологические формы и типы коллагена. 26
1.3.3 Методы количественного определения коллагена в соединительных тканях 32
1.4. Взаимодействие протеогликанов и коллагена. 36
1.5. Роль коллагеновой и протеогликановой подсистем в обеспечении механических свойств хрящевой ткани. 39
ГЛАВА 2. Модификация структуры соединительных тканей лазерным воздействием и ферментативной обработкой 40
2.1. Субабляционное лазерное воздействие на биоткани. 40
2.2. Модификация структуры хрящевой ткани с помощью ферментативной обработки (удаление ГАГ иПГ) 43
2.2.1. Ферменты, действующие на матрикс хрящевой ткани 44
2.2.1.1. Гликозидазы 44
2.2.1.2. Протеазы 45
2.3. Влияние ферментативной обработки на свойства соединительных тканей. 46
ГЛАВА 3. Физико-химические методы, применяющиеся для исследований изменений в соединительных тканях при термическом нагреве и обработке ферментами 53
3.1. Денатурация коллагена. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия — основной метод при исследовании денатурации коллагена. 53
3.1.1. Представление о денатурации коллагена как о фазовом переходе первого рода 53
3.1.2. Представление о денатурации коллагена, как о кинетическом процессе 65
3.1.3. Особенности денатурации коллагена в тканях. Метод ДСК 71
3.2. ИК спектроскопия и спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) соединительных тканей... 75
3.3. Сорбция паров воды биологическими объектами. 80
ГЛАВА 4. Реактивы, приборы, материалы и методики 85
4.1. Образцы тканевых материалов и реактивы 85
4.1.1. Образцы тканевых материалов 85
4.1.2. Реактивы 86
4.2. Методы 88
4.2.1. ИК лазерная обработка. 88
4.2.2. Контроль температуры поверхности хрящевой ткани при ИК — лазерной обработке 89
4.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК) 90
4.2.4. Термомеханический анализ 91
4.2.5. Термогравиметрический анализ 91
4.2.6. Спектроскопия Комбинационного Рассеяния (КР) 91
4.2.7. Изотермы сорбции 92
4.2.8. Гистохимия 92
4.3 Методики. 93
4.3.1. Методика полного аминокислотного анализа. Гидролиз тканей 93
4.3.2. Методика спектрофотометрического определения гидроксипролина в гидролизате 95
4.3.3. Ферментативная обработка тканей и методика определения степени денатурации коллагена. 97
4.3.4. Количественный анализ гликозаминогликанов в растворе 98
4.3.5. Методика исследования деградации протеогликановой составляющей хрящевой ткани 100
Результаты и обсуждение 102
ГЛАВА 5. Состав соединительных тканей. термическая стабильность коллагена в тканях 102
5.1. Определение остаточного количества воды в образцах тканей 103
5.2 Определение содержания коллагена в соединительных тканях. 104
5.2.1 Количественное определение содержания гидроксипролина в различных соединительных тканях. 104
5.2.1.1 Определение аминокислотного состава хроматографическим методом 104
5.2.1.2 Определение Hyp спектрофотометрическим методом 106
5.2.1.3 Изучение влияния хондроитинсульфата на точность спектрофотометрического определения Hyp. 107
5.2.1.4 Сравнение результатов измерений содержания гидроксипролина по двум методикам 108
5.2.2 Количественное определение содержания коллагена в различных тканях 110
5.2.2.1 Вычисление содержания Hyp в коллагенах I и II 110
5.2.2.2 Определение количественного содержания коллагена в различных тканях 112
5.3 Определение содержания гликозаминогликанов в соединительных тканях. 113
5.4 Термическая стабильность коллагена в различных тканях. 114
5.4.1 Термическая стабильность коллагена I в тканях. 115
5.4.1.1 Термическая стабильность коллагена I ФСТ, выделенного из лицевых мышц 115
5.4.1.2 Термическая стабильность коллагена I ФСТ, вьшеленной из связок межпозвоночного диска (МПД).
117
5.4.1.3 Термическая стабильность коллагена І в склере и капсуле с имплантантом 118
5.4.2 Термическая стабильность коллагена II 127
5.4.2.1 Термическая стабильность коллагена II, выделенного из хрящевой ткани, пульпозного ядра МПД и ГЗП 127
5.4.2.2 Термическая стабильность коллагена II в хрящевой ткани, пульпозном ядре МПД и ГЗП 135
5.4.2.3. Влияние ГАГ на денатурацию коллагена II в тканях 144
ГЛАВА 6. Лазерное воздействие на биоткани 149
6.1 Лазерное воздействие на фиброзную соединительную ткань 149
6.2 Лазерное воздействие на хрящевую ткань носовой перегородки. 757
6.2.1. Модификация сети коллагеновых фибрилл ИКлазерным излучением. 159
Выводы 174
Список литературы
- Методы количественного определения гликозаминогликанов
- Модификация структуры хрящевой ткани с помощью ферментативной обработки (удаление ГАГ иПГ)
- Представление о денатурации коллагена как о фазовом переходе первого рода
- Контроль температуры поверхности хрящевой ткани при ИК — лазерной обработке
Введение к работе
Локальное термическое воздействие на ткани и органы активно внедряется в медицинскую практику. Возможны различные способы локального нагрева, самыми распространёнными из которых являются ИК лазерное и электротермическое воздействия. Благодаря широкому диапазону параметров ИК излучения (длина волны, диаметр пучка и режим воздействия (энергия и длительность импульса)) можно точно контролировать область и время прогрева ткани. Именно поэтому операции, проводимые с применением ИК лазеров, бескровны и безболезненны. ИК лазеры уже применяют в клинической медицине как новый эффективный метод лечения нестабильности суставов, повреждений и дефектов хрящевой ткани, в оториноларингологии, ортопедии, пластической и реконструктивной хирургии.
Однако, ситуация на сегодняшний день такова, что внедрение новых технологий воздействия на биоткани значительно опережает накопление фундаментальных знаний о происходящих при этом физико-химических процессах и структурных изменениях в тканях. Это ограничивает применение локального нагрева и не позволяет получить оптимальный эффект в медицинской практике при отсутствии долгосрочных нежелательных последствий. Очевидно, что решение данной проблемы лежит в области междисциплинарных исследований. В настоящее время набор экспериментальных данных по изменению свойств биотканей при длительном или кратковременном нагреве получен с помощью морфологических или оптических исследований. Но сами по себе оптические характеристики не могут дать информации о химическом и структурном изменении ткани без сопоставления их с биохимическим и физико-химическим исследованием. Такие исследования до сих пор не проводились.
Наиболее часто в литературе обсуждаются попытки локального термического воздействия на соединительные ткани. Основным структурообразующим компонентом соединительных тканей является коллаген. На протяжении многих лет выделенный из кожи, сухожилий и связок (чаще в разбавленном растворе) коллаген является объектом физико-химических исследований. Было показано, что его термодинамические свойства определяются источником, возрастом и даже историей болезни донора ткани. Интересной является принципиальная возможность использования термодинамических характеристик для определения состояния коллагена в тканях.
Цель данной работы - описать физико-химические процессы, происходящие при нагреве соединительных тканей, обосновать влияние надмолекулярной структуры на термостабильность коллагена в тканях и показать, что такой подход позволяет количественно и качественно предсказать поведение тканей при том или ином режиме локального ИК лазерного нагрева. Таким образом, в рамках поставленной цели предполагалось решение следующих задач:
Исследование термической стабильности коллагена І в фиброзной соединительной ткани, тканях связок и склеры.
Исследование термической стабильности коллагена II в различных хрящевых тканях.
Изучение влияния надмолекулярной организации ткани на термодинамические параметры фазового перехода «фибриллярный коллаген - желатина».
Исследование устойчивости коллагеновой и протеогликановой подсистем в соединительных тканях с различной надмолекулярной организацией к локальному ИК лазерному воздействию.
5. Оценка возможности применения метода дифференциальной сканирующей калориметрии для определения состояния коллагена в тканях.
Научная новизна работы
Результаты, полученные в настоящей работе, представляют собой новые данные об изменении состояния коллагена I (в тканях склеры, связок и фиброзной соединительной ткани) и коллагена II (очищенного и в составе хрящевых тканей) в условиях традиционного и ИК лазерного нагрева. Установлена идентичность термического поведения выделенных из тканей коллагена I и коллагена П. Впервые получены значения энтальпии денатурации АНД коллагена II.
Впервые показано, что при нагреве хрящевых тканей до 100С, денатурирует лишь 16% находящегося в них коллагена П. Определена причина термической стабильности коллагена II в хрящевых тканях.
Впервые показано, что в случае соединительных тканей, содержащих коллаген I, ИК лазерный нагрев аналогичен обычному нагреву, а в случае тканей, содержащих коллаген II, происходит модификация коллагеновых фибрилл.
Показано, что метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет определить фракции коллагена, отличающиеся типом и количеством сшивок, а также оценить состояние коллагенсодержащей ткани.
Практическая значимость
Полученные в работе данные позволяют предсказать степень деградации соединительной ткани при термическом и ПК лазерном воздействии. На основе найденных закономерностей могут быть подобраны режимы термического и ИК лазерного воздействия, обеспечивающие желаемый терапевтический эффект.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на 10ой международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 2002 г.), конференции «Лазеры, применение и технологии» (Москва, Россия, 2002 г.), международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (Москва, Россия, 2002-2003 гг.), 13ой конференции Международного Общества по биологической калориметрии (Вюрцбург, Германия, 2003 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 4 тезиса докладов.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы и приложений.
Работа изложена на 194 страницах машинописного текста и включает 23 таблицы и 74 рисунка.
Методы количественного определения гликозаминогликанов
Основной протеогликан хрящевой ткани, аггрекан, относится к первой группе [19]. Строение его показано на рисунке 8. Его стержневой белок (Mr = 250000) содержит три глобулярных и два протяженных участка - домена. Глобулярные домены имеют постоянный состав, а протяженные варьируются по длине и составу. Каждая молекула аггрекана содержит около 100 цепей хондроитинсульфата (20 кДа каждая), 40-60 цепей кератансульфата (5—15 кДа каждая), 60-70 цепочек О-связанных олигосахаридов, 6-8 цепочек N-связанных олигосахаридов. Аггрекан обладает свойством полидисперсности, то есть длина стержневого белка, а также количество и длина боковых цепей меняются от молекулы к молекуле. Хондроитинсульфатные цепи присоединены только к протяженному домену стержневого белка между вторым и третьим глобулярными доменами, тогда как цепи кератансульфата более широко распределены по молекуле стержневого белка.
Уникальной особенностью протеогликанов хрящевой ткани является их способность образовывать аггрегаты с молекулярной массой до 50-100 млн. [20]. Схема строения ПГА представлена на рисунке 7. Основу ПГА составляет гиалуроновая кислота (рис. 6), одна цепочка которой связывает большое число мономерных протеогликанов.
По-видимому, движущей силой процесса образования ПГА являются дисперсионные взаимодействия между гиалуроновой кислотой и глобулярной областью стержневого белка протеогликанов. Взаимодействие протеогликанов и гиалуроновой кислоты приводит к увеличению гидродинамического размера и к значительному увеличению вязкости гиалуроновой кислоты [21]. Протеогликановый агрегат стабилизируется с помощью связующего белка.
Гликозаминогликаны, входящие в состав ПГА, являются носителями большого числа отрицательно заряженных групп, в результате, в объеме ПГА наблюдается очень высокая плотность носителей заряда. Это приводит к адсорбции структурой большого количества воды, как предполагается, за счёт осмотического давления [1]. В связи с этим принято говорить о гипергидратированном состоянии ПГА в структуре хрящевой ткани. Понятно, что при таком строении ПГА приобретают значительную жесткость, подобно сильно перекачанной автомобильной камере, что имеет определяющее значение для физико-механических свойств хрящевой ткани.
Известно, что одна треть остатков аргинина стержневого белка непосредственно участвует во взаимодействии протеогликанов и гиалуроновой кислоты, а одна треть аминокислотных остатков триптофана участвует косвенно [22].
Существуют деструктивные и недеструктивные методы количественного определения гликозаминогликанов.
Деструктивные методы анализа делятся на методы, включающие стадию переведения тканей в раствор и определение гликозаминогликанов с помощью спектрофотометрических реакций, и на методы, включающие, помимо стадии растворения ткани, деструкцию гликозаминогликанов на сахара, разделение смеси с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и последующий спектрофотометрический анализ моносахаров.
В недеструктивных методах количество гликозаминогликанов определяется непосредственно в ткани, минуя стадию её разложения.
Рассмотрим наиболее часто использующиеся деструктивные методы количественного определения гликозаминогликанов.
Как правило, ткань подвергают глубокому кислотному или щелочному гидролизу в достаточно жёстких условиях при t 90-100С, образовавшиеся моно- или дисахариды разделяют на подходящем адсорбенте, например, силикагеле, методом ВЭЖХ Сахаров [23]. Элюат анализируют флюориметрически при длине волны возбуждения 331 нм и длине волны излучения 383 нм. Кроме того, после жёсткого гидролиза возможно проведение спектрофотометрической реакции с образованием окрашенного соединения, например, с п-диметиламинобензальдегидом после модификации ацетилацетоном в этаноле в присутствии КОН [24, 25] или нингидрином в н-бутаноле без предварительной модификации [24]. Карбазол также образует окрашенный комплекс с моно- и дисахаридами [26].
Целая группа методов основана на том, что гликозаминогликаны и протеогликаны образуют комплекс с реагентом, поглощение которого в определенной области спектра отличается от поглощения самого комплекса. Ниже перечислены основные реагенты, использующиеся для спектрофотометрического определения ГАГ.
Модификация структуры хрящевой ткани с помощью ферментативной обработки (удаление ГАГ иПГ)
Воздействие Ho:YAG лазера на хрящевую ткань приводит к частичному разрушению её протеогликановой компоненты, что выражается в увеличении вымывания хондроитинсульфата в буферный раствор, кроме того, существуют косвенные данные, свидетельствующие о том, что молекулы хондроитинсульфата уменьшаются в длине [76].
В температурном диапазоне 60-80С (зависит от типа соединительной ткани) происходит денатурация коллагеновых фибрилл, входящих в состав соединительных тканей. Кроме обычной, термической денатурации, при высоких скоростях нагрева может наблюдаться и термомеханическая денатурация из-за больших градиентов давления, образующихся при интенсивном испарении воды [77]. При денатурации коллагена наблюдается сокращение коллагенсодержащей ткани, её усадка. Величина усадки зависит как от температуры, так и от времени экспозиции, причём наблюдается эффект температурно-временной суперпозиции.
HorYAG лазер используют для артроскопического лечения неустойчивости суставной капсулы. Суставная капсула, как и связки, состоит из фибрилл коллагена I (83% от всего коллагена), ориентированных в строго определённом порядке. В работе [65] изучали изменение морфологии коллагеновых фибрилл суставной капсулы под действием Ho:YAG лазера методом просвечивающей электронной микроскопии. Образцы ткани облучали лазером с различной интенсивностью, при этом с ростом мощности лазера в образцах наблюдались следующие изменения: 1. Сначала фибриллы коллагена теряют свои чёткие очертания и характерную поперечную исчерченность. 2. Затем диаметр фибрилл начинает расти, достигая троекратного размера исходных нативных фибрилл. Такие же изменения были отмечены в работе [ Error! Bookmark not defined.] при облучении коллагенсодержащих тканей Nd: YAG лазером.
Лазерный нагрев, как было показано в работе [79], аналогичен обычному термическому нагреву в водяной бане. Так, согласно данным просвечивающей электронной микроскопии, в образцах суставной капсулы, облучённых лазером, наблюдались потеря коллагеновыми фибриллами их строгой цилиндрической формы и аморфизация участков фибрилл с поперечной исчерченностью. С помощью ферментативной обработки трипсином, также было показано, что усадка суставной капсулы происходит из-за денатурации коллагена, в ходе которой регулярные тройные спирали превращаются в случайные полимерные клубки - гель. Это означает, что денатурация коллагена является причиной усадки и сутью терапевтического лазерного воздействия при лечении неустойчивости суставной капсулы [80]. Максимальная усадка (50%) наблюдалась при температуре 65С и времени экспозиции 1 минута.
Лазерное излучение, в общем случае, сводится не только к фототермическому воздействию, но и к фотохимическому и фотоакустическим воздействиям, однако, при лазерном воздействии на коллагенсодержащие ткани, наибольшее значение имеет фототермическое воздействие [81]. Существует мнение, что денатурированные молекулы коллагена являются фундаментом для роста реактивных фибробластов, которые впоследствии инициируют замену повреждённого коллагена новым [82].
При ферментативной обработке хрящевой ткани, как правило, воздействуют на два основных объекта — это коллаген и протеогликановая подсистема. Разрушение коллагена в хрящевой ткани можно провести при помощи коллагеназ различных типов. Для воздействия на протеогликановую подсистему применяют ферменты, которые можно разделить на две группы, гликозидазы и протеазы.
Гликозидазы действуют на полисахариды протеогликановой подсистемы, разрывая О-гликозидные связи между сахарными единицами. К этой группе относятся хондроитиназы (например, хондроитиназа ABC), кератаназы и гиалуронидазы различных типов.
Среди них есть ферменты, обладающие специфичностью к определенным полисахаридам хрящевой ткани, а есть те, которые гидролизуют все гликозидные связи. Например, тестикулярная гиалуронидаза разрушает как гликозаминогликаны, так и гиалуроновую кислоту, тогда как стрептомициновая гиалуронидаза - только гиалуроновую кислоту. Хондроитиназа ABC удаляет, по меньшей мере, 85% хондроитинсульфата и дерматансульфата (измерено по количеству галактозамина), но оставляет нетронутым более 85% кератансульфата [83].
Рассмотрим специфичность некоторых представителей этой группы. Хондроитиназа ABC и хондроитиназа АС относятся к эндоэлиминазам, то есть атакуют гексозаминовые связи хондроитин и дерматансульфатов и дают в итоге ненасыщенные дисахариды. Хондроитиназа АСП имеет ту же субстратную специфичность, что и предыдущие два фермента, но она более активна, так как относится к экзоэлиминазам, то есть удаляет дисахаридные единицы пошагово от невосстановленного конца цепочки гликозаминогликана. Кератаназа атакует эндогалактозные связи кератансульфата, давая в итоге небольшие олигосахариды. Например, при обработке роговицы кератаназой, средний диаметр коллагеновых фибрилл уменьшается с 26 нм до 23 нм. Известно, что коллагеновые фибриллы в роговице взаимодействуют с кератансульфат содержащими протеогликанами, уменьшение диаметра фибрилл свидетельствует о нарушении этого взаимодействия [84]. Стрептомициновая гиалуронидаза разрывает цепь гиалуроновои кислоты на тетрасахариды и гексасахариды [85].
Представление о денатурации коллагена как о фазовом переходе первого рода
Для того, чтобы температурная зависимость степени превращения, рассчитанная исходя из кинетической модели, приблизилась к экспериментально наблюдаемой кривой, величина предэкспоненты А должна быть порядка 1096-1097 сек"1, а энергия активации должна составлять не менее 600 кДж/моль. Такое значение предэкспоненциального множителя не имеет физического смысла, а величина Еа больше энергии разрыва химической связи и никоим образом не соответствует энергии конформационных переходов и энергии водородных связей, составляющих основу перехода спираль— -клубок.
Вторым аргументом, опровергающим кинетическую модель, является обратимость процесса денатурации, обсуждённая ранее. Процесс денатурации обычного белка носит кооперативный характер, коллаген является довольно крупной молекулой, рассчитанный для него размер кооперативного домена составляет примерно 97 трипептидов, что почти в 3 раза меньше его полной длины. Именно поэтому процесс денатурации коллагена обратим лишь частично. Денатурация модельных пептидов, аналогичных коллагену, но имеющих длину цепи меньшую или равную размеру кооперативного домена, обратима полностью и при сравнении кривых денатурации - ренатурации гистерезис не наблюдается [123].
В ответной статье Майлза [120] приводятся малообоснованная критика математических выкладок, приведённых в работе Энджела и Бачингера, и ссылки на экспериментальные данные для других белков с аналогичными значениями Еа и А. Что касается главного аргумента, приведённого Энджелом и Бачингером - обратимости процесса денатурации коллагена, то Майлз его попросту не рассматривает.
Приведём результаты ещё одной работы, где термическую денатурацию коллагена I рассматривают в рамках кинетической модели [124]. Образцы коллагена выдерживали в изотермических условиях при разных температурах от 40 до 70С и рассчитывали константы скорости. Результаты расчетов были представлены в координатах Ink - 1/Т. На графике экспериментальные точки расположились в виде двух прямых, пересекающихся при температуре 63С, соответствующей температуре денатурации коллагена I (рис. 26).
Зависимость константы реакции от температуры в координатах Аррениуса (Ink от 1/Т). Изменение угла наклона на подобных графиках означает изменение энергии активации и, как правило, механизма реакции (например, переход из режима диффузионного контроля в режим кинетического контроля). Это подтверждает некорректность рассмотрения процесса денатурации как кинетической реакции первого порядка в широком интервале температур. До температуры 63С, являющейся пороговой для денатурации коллагена, в данном случае, сколь либо значимых количеств денатурированного коллагена не было обнаружено. Авторы считают, что при очень больших временах наблюдения коллаген всё же проденатурирует, однако экспериментального подтверждения этому получено не было.
В заключении отметим, что собранные к настоящему времени экспериментальные данные и теоретические представления позволяют утверждать, что процесс денатурации коллагена следует рассматривать скорее как фазовый переход первого рода, чем как необратимую реакцию первого порядка.
Расширение температурного интервала денатурации частично ренатурированного коллагена аналогично уширению температурного интервала плавления обычного полимера при переходе от образца с большой степенью кристалличности к образцу с меньшей степенью кристалличности. Увеличение объёма авторы работы объясняют плавлением (денатурацией) нативных коллагеновых фибрилл, то есть с переходом тройная спираль — случайный клубок.
Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) является одним из наиболее часто используемых физико-химических методов для исследования термических превращений в тканях, изъятых из животных.
Различное происхождение коллагена и различная степень структурной организации заметно влияют на энтальпию денатурации коллагена. Следует отметить, что величина энтальпии денатурации и температура денатурации коллагена зависят не только от скорости нагрева и количества воды в ткани, но и от способа выделения и очистки, типа соединительной ткани, возраста животного и рН окружающей среды. К примеру, увеличение рН среды, в которой находится коллаген, от 2 до 7, температура денатурации коллагена увеличивается на 4-6С [109]. С ростом содержания в ткани аминокислот пролина и гидроксипролина [125] температура денатурации коллагена растёт.
Разные авторы дают различные границы для теплового эффекта денатурации коллагена, например, в работе [ПО] отмечено, что в зависимости от способа выделения коллагена, AHj может меняться от 54 до 67 Дж/г ткани, а в зависимости от происхождения коллагена и возраста животного, AHd варьируется в интервале 30-85 Дж/г [104, 108, 109]. Тепловые эффекты денатурации коллагена, изъятого из различных тканей, полученные различными авторами сведены в таблице 6. Таблица 6. Величины теплового эффекта денатурации коллагена, изъятого из различных тканей.
Контроль температуры поверхности хрящевой ткани при ИК — лазерной обработке
Термическое поведение образцов соединительных тканей (5-10 мг) изучали методом ДСК на дифференциальном сканирующем калориметре DSC822e (METTLER TOLEDO, Швейцария). Образцы герметично закрывали в стандартных алюминиевых чашках (40 мкл), образцом сравнения служила аналогичная пустая чашка. Начальная, конечная температура и скорость нагрева для калориметрического исследования хрящевой ткани составляли 25С, 100С, 10 К/мин соответственно. Иногда нагрев начинали от 0С.
В некоторых случаях использовали более раннюю модель дифференциального сканирующего калориметра DSC30 ТА4000 (Mettler, Швейцария).
Термомеханические свойства хрящевой ткани исследовали на термомеханическом анализаторе (ТМА 40, ТА 4000 Mettler, Швейцария). Образец ткани в виде круглой таблетки (4 мм в диаметре и 0,8 мм толщиной) исследовали в интервале 25С-100С со скоростью нагрева 10 ЇС/мин при нагрузке 0,005 Н.
Для определения остаточного содержания воды, образцы тканей помещали в чашку из оксида алюминия объёмом 70 мкл, чашку помещали на держатель, находящийся в печи прибора для синхронного термогравиметрического и дифференциального термического анализа TGA/SDTA85T (METTLER TOLEDO, Швейцария). Ткани нагревали от 50С до 150С со скоростью 10 К/мин, а затем выдерживали при 150С до постоянной массы (около 20 минут).
С помощью программного обеспечения STAReSW 8.10 рассчитывалось процентное содержание воды в каждом образце ткани.
Для получения спектров КР образцы соединительных тканей с различным содержанием воды зажимали между двумя окнами из CaF2, между которыми помещали резиновую прокладку для предотвращения высыхания или набухания образцов, и с помощью специального держателя помещали в устройство для снятия спектров комбинационного рассеяния, являющееся частью прибора Equinox 55/S фирмы Brucker. Спектр, возбуждаемый излучением Nd: YAG лазера (Х= 1,046 мкм, W=0,1-0,2 Вт, в зависимости от соотношения сигнал/шум) записывался с разрешением 4см", усреднялся по 150 сканам и подвергался обратному Фурье преобразованию. Каждый спектр был откалиброван по интенсивности С-Н колебаний (2932см"1) и подвергнут процедуре Фурье-сглаживания по 4 точкам.
Сорбционные свойства изучали на препаратах, высушенных в эксикаторе с Р2О5 в течение 24 часов. Остаточное содержание воды в таких образцах не превышает 1%. Затем образцы тканей помещали на 24 часа в термостатируемые (21±0,5С) эксикаторы с заданной влажностью (растворы неорганических солей и серной кислоты различных концентраций). Количество сорбированной воды определялось гравиметрическим методом с точностью до 0,0001 г на электронных весах METTLER TOLEDO.
Отметим, что, во-первых, выдерживание образцов в эксикаторах в течение 24 часов оказалось достаточным для достижения адсорбционного равновесия, поскольку увеличение времени выдерживания в эксикаторах не приводило к увеличению массы образцов, и, во-вторых, при десорбции наблюдался гистерезис, который может быть связан с тем, что скорость десорбции воды меньше, чем скорость сорбции. Известно, что с понижением количества воды в тканях, коэффициент её диффузии уменьшается.
Препараты тканей обезвоживали и фиксировали последовательным выдерживанием в водных растворах этанола возрастающей концентрации. После этого их пропитывали специальной смолой и заливали горячим парафином.
Парафиновые срезы толщиной 4-5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином (для выявления ядер и цитоплазмы клеток), пикрофуксином по Ван-Гизону (для выявления коллагеновых волокон), толуидиновым синим (для выявления гликозаминогликанов), комбинированной окраской альциановым синим и пикросириусом красным (для выявления коллагеновых волокон).
Был использован метод хроматографического анализа, описанный в книге [161].
Для проведения аминокислотного анализа высушенные ткани гидролизовали в сухих толстостенных стеклянных ампулах 1,0x7,0 см, предварительно промытых деионизированной водой и смесью (9:1) концентрированных серной и азотной кислот.
Для гидролиза брали образцы коллагенсодержащих тканей массой по 1-2 мг, которые помещали в стеклянные ампулы. К ним прибавляли по 0,2 мл смеси (2:1 по объему) 12н соляной кислоты и 99% трифторуксусной кислоты, содержащей 0,0005% по объему свежеперегнанного фенола. Образцы замораживали, поместив ампулы в жидкий азот, откачивали воздух и запаивали ампулы под высоким вакуумом. Гидролиз проводили при 166С (масляная баня) в течение 60 минут. После этого ампулы вскрывали, растворы количественно переносили в конические колбочки и упаривали досуха в концентраторе LabConco при температуре 65С.
