Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Распространение, вредоносность и биологические особенности развития фомопсиса 8
1.2 Биологический метод защиты растений от болезней — составляющая часть интегрированной защиты сельскохозяйственных культур 13
1.3 Микробиологический метод борьбы с болезнями подсолнечника и других сельскохозяйственных культур 20
2. Условия и методы исследований 30
2.1 Почвенно-климатические условия 30
2.2 Материалы и методы исследований 31
3. Разработка биологического метода защиты подсолнечника от фомопсиса на основе штаммов грибов-антагонистов 42
3.1 Изыскание в природе и отбор штаммов грибов-антагонистов к возбудителю фомопсиса подсолнечника 42
3.2 Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucositm var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 52
3.3 Физиологические признаки штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 61
3.4 Антибиотическая активность перспективных штаммов грибов- антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 68
3.5 Механизм действия перспективных штаммов антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 79
3.6 Селекция перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 93
3.7 Разработка элементов технологии производства биопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum 94
3.8 Разработка элементов технологии применения биопрепаратов на основе активных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum -веррукозина и фуникулозума ПО
Выводы 132
Рекомендации производству 134
Список литературы
- Биологический метод защиты растений от болезней — составляющая часть интегрированной защиты сельскохозяйственных культур
- Микробиологический метод борьбы с болезнями подсолнечника и других сельскохозяйственных культур
- Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucositm var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum
- Механизм действия перспективных штаммов антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum
Введение к работе
Наиболее прогрессивной формой организации защиты растений от вредных организмов являются системы мероприятий, включающие нехимические способы борьбы. Биологический метод защиты растений в настоящее время стал полноправным компонентом интегрированных программ борьбы со многими вредителями и болезнями для целого ряда сельскохозяйственных культур. Предпосылкой этому является возросший интерес общественности к охране окружающей среды и объективная оценка экологических последствий применения пестицидов.
В настоящее время основная доля средств защиты сельскохозяйственных культур, в том числе и подсолнечника, от патогенов приходится на химические фунгициды. Несмотря на то, что современные фунгициды характеризуются сравнительно низкими нормами расхода, способностью быстро разлагаться в почве и минимальным воздействием на почвенную биоту, они не соответствуют требованиям по получению экологически чистой продукции. Кроме того, они не снижают основной запас инфекции возбудителей болезней, в том числе и фомопсиса, в почве и на растительных остатках, а это, в целом, существенно снижает эффективность защитных мероприятий. Альтернативой таким химическим фунгицидам могут стать биопрепараты, преимущество и достоинство которых состоит в специфичности действия, в высокой экологичности (действующие агенты биопрепаратов - компоненты природных биоценозов, что объясняет их безопасность для окружающей среды) и возможности решения проблемы резистентности популяций фитопато-генов к пестицидам.
В связи с этим проблема защиты подсолнечника от фомопсиса Phomop-sis helianthi Munt.- Cvet., Mihal. et Petr. может быть реализована путем поиска высокоактивных штаммов антагонистов в естественных условиях и создания на их основе новых высокоэффективных биопрепаратов.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - разработать эффективные и экологически безопасные микробиологические препараты для защиты подсолнечника от фомопсиса {Phomopsis helianthi Munt. - Cvet., Mihal. et Petr.).
В задачу исследований входило: осуществить поиск и скрининг природных штаммов-антагонистов возбудителя фомопсиса подсолнечника; изучить биологические особенности и механизм действия перспективных штаммов-антагонистов; осуществить селекцию перспективных штаммов методом ступенчатого моноклонального отбора; оптимизировать процессы роста и развития перспективных штаммов по признакам продуктивности и антагонистической активности при стационарном и глубинном культивировании на искусственных питательных средах; разработать элементы технологии производства различных препаративных форм биопрепаратов на основе отселектированных, обладающих по-лифункциональным типом действия штаммов-антагонистов; разработать элементы технологии применения биопрепаратов для защиты семян, вегетирующих растений подсолнечника и почвы от фомопсиса.
Научная новизна.
Разработаны новые, экологически безопасные, эффективные биопрепараты веррукозин и фуникулозум на основе отселектированных активных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum Dierckx var. cyclopium (Westling) Samson, Stolk et Hadlok и PF-1 Penicillium funiciilosum Thom.
Разработаны элементы технологии производства различных препаративных форм биопрепаратов в условиях стационарного и глубинного культивирования для производственных биолабораторий и биофабрик МСХ РФ.
Разработаны элементы технологии применения новых биопрепаратов
6 для защиты семян, вегетирующих растений и почвы в интегрированной системе защиты подсолнечника.
Основные положения, выносимые на защиту.
Новые экологически безопасные биопрепараты веррукозин и фуникулозум, эффективные против фомопсиса и других опасных патогенов подсолнечника.
Элементы технологии производства различных препаративных форм биопрепаратов и их применения в интегрированной системе защиты подсолнечника.
Практическая значимость работы. Созданы новые, экологически безопасные биопрепараты веррукозин и фуникулозум эффективные против фомопсиса и других патогенов подсолнечника.
Для биопрепаратов веррукозин и фуникулозум разработаны лабораторные регламенты для малотоннажного производства порошка, пасты и жидкой культуры.
Разработаны элементы технологии применения новых биопрепаратов для защиты семян, вегетирующих растений и почвы в интегрированной системе защиты подсолнечника от комплекса вредителей и болезней.
Биологическая эффективность разработанных биопрепаратов, в зависимости от состояния популяции патогенов и складывающихся погодных условий, против фомопсиса колеблется от 8,3 до 74,7 %, против фузариоза — от 6,1 до 64,3 %, что гарантирует сохранение урожая подсолнечника от 0,1 до 0,6 т/га. Первостепенное значение в борьбе с фомопсисом на подсолнечнике играет снижение запаса инфекционного начала в почве. Осенняя обработка растительных остатков подсолнечника веррукозином обеспечивает снижение образования перитециев фомопсиса на 67,1 %.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на ежегодных конференциях и методических комиссиях ВНИИМК по аттестации аспирантов (1997-2000 гг.); Всероссийской научно-практической конференции «Фитосанитарная ситуация на посевах сельскохозяйственных культур юга России и экологизация систем защиты растений», Краснодар, 2000 г., международной конференции «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», Харьков, 2001; региональной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», Краснодар, 2002 г.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ общим объемом 1,07 печатных листов. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы, приложений, включает 36 таблиц, 28 рисунков. Список библиографических источников включает 218 наименований, в том числе 117 на иностранных языках.
Биологический метод защиты растений от болезней — составляющая часть интегрированной защиты сельскохозяйственных культур
Обсуждая роль биометода в интегрированной системе защиты растений, большинство авторов отмечают, что химическая защита растений от фитопа-тогенов пока занимает ведущее место в арсенале мер борьбы, особенно в системах интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур. Однако она не является экологически безопасной и должна сочетаться с биологическими средствами защиты. Последние следует рассматривать как важную, неотъемлемую компоненту интегрированной системы защиты в современном растениеводстве, а в ряде случаев и как единственное средство контроля фитопатогенов. Например, в защищенном грунте, где по решению Минздрава уже с 1990 г. полностью запрещено применение химических пестицидов (Соколов, Монастырский, Пикушова, 1994).
Определение «биологической борьбы» разные авторы рассматривают неодинаково. Наиболее обобщенное понятие - это использование для защиты растений от вредителей и болезней других живых организмов или продуктов их жизнедеятельности (De Bach, 1964; Горленко, 1973, 1975, 1976; Федорин-чик, 1976).
Биологический метод борьбы с фитопатогенами Бейкер и Кук определяют следующим образом: «биологическая борьба с фитопатогенными микроорганизмами - это уменьшение плотности инокулюма (или вызывающих болезнь активностей) фитопатогена или паразита в его активном или латентном состоянии посредством одного или более организмов, осуществляющих это уменьшение непосредственно действуя на патоген или через манипуляции с окружающей средой, хозяином или антагонистом» (Baker, Cook, 1974).
Соколов сформулировал определение биозащиты так: «биозащита растений от вредных агентов (biological control) - это применение "живого против живого", это использование против них разнообразных биологически активных веществ и метаболитов биоты, а также ее эффективных генов» (Соколов, 2000).
В настоящее время биологическая защита растений это современная фундаментально-прикладная область знаний, предметом исследования которой являются разнообразные биосредства — биоагенты и биорегуляторы - естественные и генетически измененные организмы (включая вирусы) и их генные продукты.
Главная цель биозащиты - получение высококачественной, экологичной продукции и сохранение биоразнообразия агросферы (Соколов, 2000).
В нашей стране и за рубежом уже более сорока лет активно ведутся работы по разработке и применению биологического метода борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур и леса (Бегляров и др., 1983; Исмаилов, Коваленков, Надыкта, 2000). Использование биологического метода защиты растений от болезней не получило пока еще достаточно широкого практического распространения. И только в последнее десятилетие отмечен повышенный интерес учёных к исследованиям в этом направлении.
Стратегия биологического метода защиты растений от болезней не ставит задачу полного уничтожения вредных организмов, а ориентируется на регулирование популяции патогена на уровне ниже экономического порога вредоносности (Cook, 1983). В связи с этим применение микробиологических средств защиты растений требует глубокого изучения биологических особенностей взаимоотношений патогена, растения-хозяина и почвенного микробного ценоза (Соколов, Захаренко, 1995; Соколов, 1997).
Впервые термин «антагонизм» ввел в обращение Роберте в 1874 г. когда продемонстрировал антагонистические взаимодействия между Penicillium glaucum и бактерией (Baker, 1987). Первое упоминание о борьбе с болезнями растений микробиологическим методом было в 1908 г. (Potter, 1908). Гарретом в 1934 г. были сформулированы принципы биологической борьбы с болезнями растений почвенного происхождения, исходя из представлений о динамическом равновесии почвенного населения (Garret, 1934). Начиная с этого времени, исследуется ризосфера, фунгистазис, суппрессивность почв, закладываются основы интегрированной системы защиты растений (Baker, 1987).
Первые публикации по микробиометоду с болезнями в России, принадлежат Худякову (1935), Новогрудскому (1936), Красильникову (1938), Березовой (1939).
В основе биологического метода защиты от фитопатогенов (биологического контроля) лежат природные, естественные явления сверхпаразитизма и антибиоза (антагонизм, фунгистазис, суппрессивность), регулирующие взаимоотношения между сапрофитной, паразитной и патогенной микробиотой. При осуществлении биологического контроля наибольший практический интерес представляют микроорганизмы-антагонисты (в особенности продуценты антибиотиков) и гиперпаразиты (Cook, Baker, 1983; Соколов, 1995).
Явление антагонизма, широко распространенное среди почвенных микроорганизмов, проявляется в виде: продуцирования антагонистами антибиотиков, ферментов и других веществ, вредных для фитопатогенов; конкуренции за использование факторов внешней среды, необходимых для жизнедеятельности патогенов; прямого действия на патогенные грибы - гиперпаразитизмом (Влахов и др., 1974; Ярушин, Чехов, 1975).
Доказано, что многие антагонисты могут обладать двояким механизмом действия. Триходермин, например, ингибирует развитие фитопатогенных грибов за счет способности штаммов рода Trichoderma к синтезу антибиотиков (глиотоксин, виридин, соцукаллин и др.) и экзоферментов, а также к гиперпаразитизму (Baker, Cook, 1974; Егураздова, Каверзнева, 1979; Chet, 1989; Cotes et al., 1992; Bochow, 1992).
Литературные данные свидетельствуют, что в природе существует большое число микроорганизмов, способных подавлять в культуре рост многих грибных и бактериальных возбудителей заболеваний растений. Однако далеко не каждый из них проявляет антагонизм in vivo в лабораторных условиях и только очень незначительное количество из испытанных микроорганизмов сохраняет это свойство при испытаниях в полевых условиях (Faull, 1978; Jordan, 1978; Егураздова, Каверзнева, 1979; Kolb, 1992).
Микробиологический метод борьбы с болезнями подсолнечника и других сельскохозяйственных культур
Среднемировой уровень потерь вследствие поражения сельскохозяйственных растений фитопатогенными микроорганизмами в среднем оценивается в 12,0 % (Голышин, 1982; Соколов, Монастырский, Пикушова, 1994). Подсолнечник поражается комплексом болезней, среди которых наиболее распространенные и вредоносные: ложная мучнистая роса {Plasmopara halstedii (Farl.) Berlese et de Toni (синоним - Plasmopara helianthi Novot), белая гниль {Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Вагу), серая гниль (Botrytis cinerea Pers.), пепельная гниль (Sclerotium bataticola Taub.), вертициллезное увядание (Verticil-Пит dahliae Kleb.), фузариоз (Fusarium oxysporum var. orthoceras (Appl. et Wr.) Bilai и Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae (Pk) Wr. emend Bilai.), a также фомопсис (Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Mihal., Petr.). Потери урожая подсолнечника от болезней в среднем составляют - 20,0 - 60,0 % (Kurnik et ah, 1978; Sackston, 1978; Lipps, Herr, 1981; Jimenez-Diaz et al., 1983; Acimovic, Straser, 1982, 1983; Marois, 1984; De Barros, 1985).
Усилия ученых многих стран посвящены разработке биологических мер борьбы с наиболее вредоносной и распространенной болезнью подсолнечника белой гнилью или склеротиниозом (Sclerotinia sclerotiorum). В связи с тем, что основной запас инфекции возбудителя сохраняется в почве в виде склероциев, биологические меры борьбы направлены на уменьшение потенциала почвенной инфекции путём интродукции в почву антагонистов.
Так, канадским учёным Хуангом выявлены несколько видов безопасных для подсолнечника грибов, которые могут заражать и убивать склероции белой гнили Coniothyrium minitans, Gliocladium catenulatum, Trichoderma viride. В тепличных условиях через сто дней количество склероциев уменьшилось до 3,0, 67,0 и 42,0 % в почвах, заражённых С. minitans G. catenulatum и Т. viride соответственно. Полевые испытания в естественно заражённой почве установили, что С. minitans один и комбинация из трёх гиперпаразитов были эффективны против склеротиниозного вилта и способствовали повышению урожая на 2,2 -3,3 ц/га. Установлено, что С. minitans заражает склероции, находящиеся на поверхности корней, что приводит их к гибели (Huang, 1977, 1979,1981,1984).
Механизм проникновения и заражения склероциев Sclerotinia sclerotioriim грибом Coniothyrium minitans описан в работах Хуанга и Гоеса (Huang, Hoes, 1976). С. minitans — деструктивный паразит, который убивает как гифы, так и склероции возбудителя болезни. Паразит проникает через клеточную стенку хозяина без образования специальных структур. Цитоплазма хозяина разрушается и клеточная стенка лопается.
Позже Хуангом и Кокко исследован гиперпаразитизм С. minitans на его хозяине Sclerotinia sclerotiorum с помощью сканирующего электронного микроскопа. Данные подтвердили полученные ранее материалы с помощью световой микроскопии, что кончики гиф С. minitans поражают гифы хозяина прямым проникновением, при этом аппрессории не образуются (Huang, Kokko, 1988).
Американские исследователи (Tiedemann, Hedke, 1994) изучили в тепличных и полевых условиях активность Coniothyrium minitans по отношению к склероциям Sclerotinia sclerotiorum. Установлено, что антагонист подавлял образование апотециев на 100 %.
Исследователями из Германии представлен метод, с помощью которого можно изучать влияние микробных антагонистов на образование апотециев Sclerotinia sclerotiorum. Найдены три антагониста снижающих способность образования апотециев - Trichoderma hamatum, Coniothyrium minitans, Fusa-rium agvaeductuum (Ltith, Pfeffer, Schulz, 1992).
В Румынии получена высокая эффективность применения гриба-гиперпаразита Coniothyrium minitans в условиях теплиц в дозе 250,0 г/м против возбудителя белой гнили на подсолнечнике и сое (Sesan, Csep, 1992).
Высокую антагонистическую активность против белой гнили проявляли не только грибы рода Coniothyrium. Исследователи из Канады Ватсон и Мил-тимор обнаружили паразитирование гриба Microsphaeropsis centaureae на склероциях Sclerotinia sclerotiorum. При совместном культивировании в чаш ках Петри пикниды гриба М. centaureae появлялись вокруг склероциев белой гнили и затем на них через десять - четырнадцать дней. Через месяц склероции были сильно заражены и потеряли жизнеспособность (Watson, Miltimore, 1975).
В 1978 г. американскими учёными (Wecker et al., 1978) обнаружен новый вид гифомицета Sporidesmium sclerotivorum, паразитирующий на склероциях белой гнили. Этот же гиперпаразит выделен в 1986 г. в Венгрии из перезимовавших склероциев Sclerotinia sclerotiorum на поле подсолнечника (Litkei, 1988).
Хуангом (Huang, 1978) изучен механизм паразитирования на Sclerotinia sclerotiorum и разных видах Fusarium (F. eguiseti, F. oxysporum, F. poae, F. sporotrichioides) гриба Gliocladium catenulatum. В результате близкого контакта гиперпаразита и хозяина клетки хозяина часто разрушались и происходила дезинтеграция клеточных стенок. В основе взаимоотношений хозяина и гиперпаразита лежит положительный хемотропизм.
Учёными из Австралии установлена высокая эффективность Trichoderma viride, Bacillus subtilis, Bacillus sp. против Sclerotium rolfsii возбудителя шейковой гнили на подсолнечнике (Chakraborty, Bhowmnik, 1985).
Исследователями из Польши (Lacicowa, Pieta, 1985) выявлен ряд грибов, способных паразитировать на склероциях Sclerotinia sclerotiorum - Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii. Наиболее высокой гиперпаразитической активностью обладал Trichoderma koningii. Под влиянием этого гриба фитопатоген оказывался не способным образовывать склероции. Обработанные спорами Trichoderma koningii склероции полностью разрушались через 8 недель.
Позже Пиетой (Pieta, 1988) изучено влияние антагонистических грибов Penicillium vermiculatum и Verticillium tenerum на развитие и жизнеспособность ряда фитопатогенных грибов и в том числе Sclerotinia sclerotiorum. Изученные виды антагонистов развивались как микопаразиты на культурах Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthianum, Rhizoctonia solani, Fusarium solani.
Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucositm var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum
Морфолого-культуральные признаки отобранных штаммов грибов-антагонистов изучались на трех питательных средах: Чапека (агаризован-ной), картофельно-сахарозном агаре (КСА) и голодном агаре. Каждая из питательных сред имела свои преимущества и была использована в зависимости от того, какие цели преследовались. На синтетической среде Чапека (стандартная общепринятая среда, используемая для идентификации грибов рода Penicillium) рост грибов был умеренный, что позволило изучить культуральные свойства штаммов в динамике. На органической среде - КСА грибы-антагонисты развивались быстро и пышно. Колонии образовывались правильной формы, конидиальный газон и его край был относительно ровный, морфологические признаки были более выражены. Скудность питательных веществ в голодном агаре ограничивала накопление биомассы грибов, что облегчило изучение строения кисточек. Кроме того, некоторые чашки Петри помещали в термостат в вертикальном положении, т.е. ребром, пометив верх и низ (в одном положении). В этом случае, подчиняясь явлению отрицательного геотропизма, конидиеносцы с кисточками располагались почти горизонтально плоскости агаровой пластинки и хорошо просматривались при микроскопировании.
Используя данные о культурально-морфологических признаках, полученных нами в результате культивирования штаммов на разных питательных средах, в Московском Государственном университете имени М.В. Ломоносова (МГУ) штаммы грибов-антагонистов идентифицировали (Raper, Thom, 1949), как PV-3 Penicillium verrucosum (Dierckx) var. cyclopium (Westling) Samson, Stolk et Hadlok и PF-1 Penicillium funiculosum Thom. Штаммы идентифицировал В.П. Прохоров.
Морфолого-культуральная характеристика штамма PV-3 гриба Penicillium verrucosum (Dierckx) var. cyclopium (Westling) Samson, Stolk et Hadlok, в условиях стационарного культивирования. Штамм PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium выделен из почвы, предварительно обогащенной патогеном (метод ловушек), на опытном поле ВНИИМК и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) (приложение 1).
По данным Федерального государственного учреждения науки «Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства (ФГУН НИЦ ТБП ФМБА России) г. Серпухов, штамм-продуцент биопрепарата невирулентный, нетоксичный, нетоксигенный, не обладает патогенными свойствами для теплокровных животных и относится к IV классу опасности (приложение 2).
Гриб относится к классу Deuteromycetes, порядку Hyphomycetales, семейству МопШасеае, по систематике рода Penicillium (Raper, Thom, 1949 г.) - к секции Asymmetrica.
Культуральные признаки (табл. 3.5). На среде Чапека формируется бесцветный мицелий, образуя плоскую колонию. По истечении трех-четырех суток колонии начинают окрашиваться (начало образования конидий). Цвет конидиального газона в процессе роста меняется: с лицевой стороны от голубовато-зеленого до серовато-голубовато-зеленого, с обратной стороны от бело-зеленого до оранжевого. Колонии быстрорастущие (средний диаметр за трое суток достигает 3,0 - 5,0 мм, а через десять суток - 25,0 - 35,0 мм), округлые, мучнистые, более или менее радиальнобороздчатые, в начале с белым краем 1,0 - 2,0 мм шириной. Штамм обладает типичным сильным плесневым запахом.
На картофельно-сахарозном агаре формируется бесцветный мицелий, образуя плоскую колонию. По истечении двух суток колонии начинают окрашиваться (начало образования конидий). Цвет конидиального газона в процессе роста меняется только с лицевой стороны от голубовато-зеленого
до серовато-голубовато-зеленого, с обратной стороны оранжевый. Колонии быстрорастущие (средний диаметр за трое суток достигает 5,0 - 8,0 мм, а через десять суток - 30,0 - 50,0 мм), округлые, мучнистые, радиальноборозд-чатые, вначале с белым краем 1,5 - 2,0 мм шириной, обильно спороносящие. Штамм обладает типичным сильным плесневым запахом.
На голодном агаре формируется бесцветный мицелий, образуя плоскую колонию. По истечении пяти суток колонии начинают окрашиваться (начало образования конидий). Цвет конидиального газона в процессе роста меняется только с лицевой стороны от голубовато-зеленого до серовато-голубовато-зеленого, с обратной стороны бледно-зеленый. Колонии растут очень медленно (средний диаметр за пять суток достигает 2,0 - 3,0 мм, а через десять суток - 7,0 - 12,0 мм), округлые, мучнистые, более или менее ра-диальнобороздчатые, вначале с белым или серым краем 1,0 - 1,5 мм шириной, с плесневым запахом.
Морфологические признаки (табл. 3.6). Конидиеносцы поднимаются от воздушного мицелия вертикально вверх независимо от расположения вегетативных гиф (редко по краю колонии, по два-три в пучке). Высота конидие-носцев в среднем 140,0 - 180,0 мкм, на средах Чапека до 200,0 мкм. Поверхность конидиеносцев на среде Чапека и агаризованной воде шероховатая или гладкая, а на КСА бородавчатая. Кисточки несимметричные, состоят из верхушечной мутовки только метул или веточек и метул. Веточки формируются по две в мутовке, очень редко по одной, в зависимости от субстрата шероховатые или бородавчатые, в среднем - 16,0 - 20,0 х 3,0 - 4,2 мкм. Метулы около 10,0 - 14,0 х 3,0 - 4,2 мкм, по три - четыре в мутовке, шероховатые или бородавчатые. На концах метул размещаются по три - пять, редко восемь фиалид (стеригм) 8,0 - 10,0 х 2,5 - 3,6 мкм, с усеченной верхушкой, гладкие. На вершинах фиалид формируются конидии — преимущественно эллиптические до шаровидных, обычно 4,0 - 4,2 мкм, редко 3,5 х 4,5 мкм, гладкие, в переплетающихся, иногда сближенных цепочках.
Механизм действия перспективных штаммов антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum
С целью разработки технологии производства различных препаративных форм биопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов-антагонистов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum нарабатывали опытные партии препаратов при стационарном (в покое) культивировании. Штаммы выращивали в стеклянных баллонах, объёмом 3,0 л, на жидкой питательной среде по 300, мл, при температуре 25,0 С - PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и 30,0 С - PF-1 Penicillium funiculosum, и оптимальных значениях рН среды: -7,0 и 5,0, соответственно.
В условиях покоя все стадии цикла развития антагонистов протекали последовательно и одинаково: сначала прорастали споры, образуя ростовые трубочки, которые через короткое время достигали значительной величины, разветвлялись, занимая все большее пространство. Гифы, разрастаясь, образовывали грибницу, которая всплывала на поверхность питательной жидкой среды, где наибольшая обеспеченность кислородом и начинали формировать воздушный мицелий, а затем и конидиальный газон. Постепенно разрастаясь, грибной газон превращался в сплошную пленку толщиной 3,0 - 4,0 мм.
С целью определения максимального выхода биомассы при поверхностном способе, в зависимости от срока культивирования, штаммы-продуценты биопрепаратов выращивали в течение двадцати суток. Накопление мицелиальной биомассы фиксировали на шестые, десятые, пятнадцатые и двадцатые сутки культивирования (табл. 3.17).
Через шесть суток культивирования мицелиальные газоны штаммов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum были сплошные и занимали всю поверхность питательной среды, на которых обильно формировались конидиеносцы с конидиями. Средняя масса сухого мицелия достигала 2,0 и 2,5 г соответственно. Через десять суток мицелиальные пленки антагонистов становились более толстыми, складчатыми, с обильным спороношением. Масса сухого мицелия, в каждом варианте увеличилась примерно в 1,4 раза. По истечении пятнадцати суток толщина газонов продолжала расти и приблизительно равнялась у штамма PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium — 3,0 мм, а у PF-1 Penicillium funiculosum - 4,0 мм. При этом средняя масса сухого мицелия также увеличивалась в 2 раза и более, до 4,0 и 5,2 г соответственно. Через двадцать суток культивирования существенных изменений в развитии мицелиальных пленок не отмечено, что подтвердилось при определении массы сухого мицелия.
Таким образом, максимальный выход биомассы при поверхностном способе культивирования штаммов-продуцентов биопрепаратов, происходит через пятнадцать суток.
Глубинное культивирование штаммов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum.
Глубинное культивирование штаммов PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium и PF-1 Penicillium funiculosum осуществляли на круговой качалке с оборотом двигателя 200 об./мин., в колбах Эрленмейера, объёмом 750,0 мл, при объёмах среды Рудакова 150,0 мл. Поскольку в процессе такого выращивания жидкость находится в постоянном движении, то культивируемый объект непрерывно обеспечивается кислородом. Известно, что интенсивная аэрация является одним из главных условий быстрого развития микроорганизмов. Вследствие этого, глубинное культивирование способствует более активному развитию грибов-антагонистов и более быстрому накоплению биомассы.
Изучение кинетики развития грибов показало, что уже через 24 часа культивирования большинство конидий посевного материала прорастали и образовывали бесцветный, слабосептированный мицелий, что приводило к незначительному загущению питательной среды. Через 48 часов культивирования отмечено значительное увеличение количества молодого, бесцветного, утолщённого, септированного мицелия. Утилизация среды составила 40,0 % и ее консистенция стала желеобразной. Уровень рН во всех вариантах снизился PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium с 7,0 до 5,0, PF-1 Penicillium funiculosum - с 5,0 до 4,5. Через 72 часа культивирования объем мицелия в жидкости увеличился еще в 4 - 5 раз. Отмечено наличие толстого, слегка потемневшего, септированного и молодого слабосептированного, бесцветного мицелия, рН остался на том же уровне. Утилизация среды составила 70,0 % и она слегка обесцветилась. Через 96 часов культивирования зафиксировано наличие толстого, сероватого, септированного мицелия с гранулированной цитоплазмой. Отмечено начало лизиса старого мицелия. Утилизация среды составила 70,0 %. рН остался на том же уровне.
Таким образом, изучение кинетики развития грибов показало, что наиболее интенсивный рост мицелия происходил в интервале 48 - 72 часов, что приводило к загущению культуры. В этот период происходило снижение рН культуральной жидкости.
При определении титра препаратов установили, что наиболее важным для максимального образования спор в условиях глубинного культивирования оказался температурный фактор. К 96 часу культивирования штамма PV-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium, при температуре 22,0 С, утилизация среды составила 10,0 %. Препарат был неоднородный, и состоял из мицелиальных глобул разного диаметра, от 2,0 Q до 20,0 мм, титр равнялся 8,0 х 10 КОЕ/мл. Тогда как при температуре 25,0 С утилизация среды составила 70,0 %, и титр увеличивался до 7,4 х 1010 КОЕ/мл (табл.3. 18).
