Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Микробиологическая защита сельскохо зяйственных культур от фитопатогеннои инфекции как элемент биоценотической регуляции в агро-экосистеме (состояние, проблемы и перспективы развития) (обзор литературы) 12
1.1 История, состояние, проблемы и перспективы развития биологического метода борьбы с фитопатогенами сельскохозяйственных культур 12
1.2 Выявление, изучение и практическое применение антагонистов, гиперпаразитов и их метаболитов для защиты растений 22
1.3 Микробиологический метод борьбы с болезнями подсолнечника 47
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 63
2.1 Условия проведения экспериментов и объекты исследований... 63
2.2 Методы проведения микробиологических исследований 66
2.3 Методика проведения лабораторных, вегетационных, мелкоде-ляночных и производственных испытаний биопрепаратов 78
ГЛАВА 3 Изыскание в природе штаммов антагонистов возбудителей болезней подсолнечника, перспективных для создания на их основе биопрепаратов 83
3.1 Выделение антагонистов возбудителей болезней подсолнечника 83
3.2 Скрининг выделенных микроорганизмов 87
ГЛАВА 4 Биологические особенности перспективных штаммов антагонистов рк-1-3 penicillium vermicu- latumdang., xk-l-4 chaetomiumolivaceumcooke et ellis, б-5 bacillus licheniformis 107
4.1 Штамм PK-1 -3 Penicillium vermiculatum Dangeard 107
4.2 Штамм XK-l-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis 130
4.3 Штамм Б-5 Bacillus licheniformis 148
ГЛАВА 5 Разработка оптимальных препаративных форм биопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов рк-1-3 penicillium vermicula tum dang., xk-l-4 chaetomium olivaceum cooke et ellis, б-5 bacillus licheniformis 162
5.1 Определение оптимальных питательных сред для штаммов продуцентов в условиях стационарного и глубинного культивирования 163
5.2 Технология производства различных препаративных форм биопрепаратов на основе штаммов-антагонистов. 180
ГЛАВА 6 Биологическое обоснование использования биопрепаратов в защите подсолнечника от болез ней 204
6.1 Установление возможности снижения запаса инфекционного начала белой гнили подсолнечника в почве 207
6.2 Определение оптимальных норм применения различных препаративных форм биопрепаратов на основе активных штаммов-антагонистов на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях 213
6.3 Определение оптимальных способов и норм применения биопрепаратов на основе активных штаммов-антагонистов против возбудителя белой гнили в полевых условиях 219
6.4 Определение эффективности биопрепаратов против возбудителя фомопсиса 235
6.5 Определение эффективности биопрепаратов против возбудителей фузариоза 250
6.6 Приживаемость микробов антагонистов продуцентов биопрепаратов в почве 256
6.7 Совместимость биопрепаратов с перспективными пестицидами 260
6.8 Производственные испытания биологического препарата вер-микулена против возбудителей белой гнили и фомопсиса на подсолнечнике. 266
6.9 Система микробиологической защиты подсолнечника от болезней 274
6.10 Испытание биопрепаратов на других сельскохозяйственных культурах 277
Выводы 279
Рекомендации производству 282
Список использованной литературы
- Выявление, изучение и практическое применение антагонистов, гиперпаразитов и их метаболитов для защиты растений
- Методы проведения микробиологических исследований
- Скрининг выделенных микроорганизмов
- Штамм XK-l-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis
Введение к работе
В агроценозе подсолнечника в условиях нарушенных севооборотов и сниженных объемах защитных мероприятий, происходит интенсивное накопление возбудителей болезней: белой гнили - Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Вагу, серой гнили - Botrytis cinerea Pers., фомопсиса - Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Michal., Petr., фузариозов — Fusarium oxysporum var. orthoceras fAppl. et Wr.) Bilai и Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae (Tk) Wr. emend Bilai, вертициллёзного увядания - Verticillium dahliae Kleb. и пепельной гнили - Sclerotium bataticola Taub. Особую опасность для культуры подсолнечника представляют белая гниль, фомопсис, а в последние годы — фузариоз. В годы эпифитотий вредоносность белой гнили достигает 80 - 100%, а масло с собранных семян не пригодно для пищевых целей. Фомопсис может снижать урожай на 50%, а масличность семянок на 35 - 37%. При проявлении фуза-риоза после цветения потери урожая составляют 30 - 40%).
Решение проблемы защиты подсолнечника от болезней связано с разработкой комплекса мероприятий, включающих создание устойчивых гибридов и сортов, приёмов и средств химической защиты, разработку технологий возделывания подсолнечника, снижающих вредоносность болезней, а также разработку биологического метода, в том числе микробиосредств.
В арсенале средств защиты подсолнечника от патогенов в настоящее время приоритет остаётся за химическими фунгицидами. Но имеющийся ассортимент последних, не обеспечивает снижения основного запаса инфекции возбудителей болезней в почве и на растительных остатках пораженных растений, что снижает эффективность защитных мероприятий. Альтернативой химическим фунгицидам могут стать микробиологические препараты, преимущество которых состоит в способности восстанавливать и активизировать природные регуляторные механизмы в агробиоценозах. Достоинствами микробиологических средств защиты растений являются специфичность дей ствия, высокая экологичность (действующие агенты биопрепаратов - компоненты природных биоценозов, что объясняет их безопасность для окружающей среды), возможность решения проблемы резистентности популяций фитопатогенов к химическим пестицидам. Поэтому разработка микробиологических средств защиты от фитопатогенов становится важной, неотъемлемой компонентой интегрированной защиты растений в современном растениеводстве.
В связи с этим актуальным является поиск высокоактивных штаммов антагонистов возбудителей болезней подсолнечника в естественных условиях, создание на их основе новых высокоэффективных биопрепаратов, разработка технологии их применения в программе интегрированной защиты культуры.
Цель и задачи исследований.
Цель настоящей работы - дать биологическое обоснование и разработать систему микробиологической защиты подсолнечника от комплекса заболеваний.
В задачу исследований входило:
- осуществить изыскание и скрининг природных штаммов-антагонистов возбудителей белой, серой и пепельной гнилей, фо-мопсиса, фузариоза, вертициллёзного увядания;
- изучить биологические особенности и механизм действия перспективных штаммов-антагонистов;
- осуществить селекцию перспективных штаммов методом ступенчатого моноклонального отбора;
- оптимизировать процессы роста и развития перспективных штаммов по признакам продуктивности и антагонистической активности при стационарном и глубинном культивировании на искусственных питательных средах;
- разработать технологию производства различных препаративных форм биопрепаратов на основе отселектированных, обладающих полифункциональным типом действия и не патогенных к растениям, штаммов-антагонистов в условиях биофабрик МСХ;
- разработать технологию применения биопрепаратов для снижения инфекционного начала в почве, защиты семян и вегетирующих растений подсолнечника от наиболее опасных болезней в интегрированной системе защиты культуры от вредителей и болезней.
Исследования проводили в соответствии с государственными программами НИОКР ВНИИ масличных культур. Государственные номера регистрации: 1981 - 1987 гг. - № 01822 017672 (интегрированная система защиты подсолнечника); 1988 - 1995 гг. -№ 01.8.800 15 407 (новые эффективные химические средства и биологические агенты); и 1995 - 2004 гг. - № 01.9.7000 63 28 (биологические препараты).
Научная новизна и теоретическая значимость.
1. Создана коллекция перспективных штаммов грибов и бактерий антагонистов основных возбудителей болезней подсолнечника - белой, серой, пепельной гнилей, фомопсиса, фузариоза и вертициллёзного увядания, включающая 19 штаммов грибов, относящихся к родам Penicillium, Chaetomium, Trichoderma, Sordaria, Gliocladium, Aspergillus, Fusarium, Coniothyrium, Ta-laromyces и 14 штаммов бактерий, относящихся к роду Bacillus, подавляющих рост нескольких возбудителей болезней, не патогенных к культуре подсолнечника а, напротив, обладающих ростостимулирующей активностью.
2. Разработаны новые, экологически безопасные, эффективные биопрепараты полифункционального типа действия вермикулен, хетомин и бацил-лин на основе отселектированных активных штаммов грибов-антагонистов РК-1-3 Penicillium vermiculatum Dangeard, ХК-1-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis и штамма бактерии Б-5 Bacillus licheniformis.
3. Разработана технология производства различных препаративных форм биопрепаратов в условиях стационарного и глубинного культивирования для производственных биолабораторий и биофабрик МСХ РФ.
4. Разработана технология применения новых биопрепаратов для защиты семян, вегетирующих растений и почвы в интегрированной системе защиты подсолнечника от комплекса вредителей и болезней.
На защиту выносятся следующие положения и разработки:
1. Концепция целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты подсолнечника и других сельскохозяйственных культур от основных патогенов.
2. Новые биопрепараты полифункционального типа действия - вермикулен, хетомин и бациллин на основе отселектированных высокоактивных штаммов антагонистов РК-1-3 Penicillium vermiculatum Dang., ХК-1-4 Chaeomium olivaceum Cooke et Ellis, B-5 Bacillus licheniformis, характеризующихся высокой антагонистической активностью, ростостимулирующим эффектом в отношении защищаемых растений, интенсивно растущих на искусственных питательных средах.
3. Система микробиологической защиты подсолнечника от болезней, включающая осеннюю обработку растительных остатков и почвы биопрепаратом хетомином, предпосевное инкрустирование семян и обработку вегетирующих растений биопрепаратами вермикуленом, хетомином и бациллином, обеспечивающая фитосанитарное оздоровление агроценозов культуры.
Практическая значимость работы.
Созданы новые, экологически безопасные, эффективные против наиболее опасных патогенов подсолнечника биопрепараты вермикулен, хетомин и бациллин.
Для биопрепарата вермикулена разработаны лабораторный, технологический регламент и технические условия для производства порошка, пасты и жидкой культуры в условиях биофабрик МСХ РФ.
Для биопрепаратов хетомина и бациллина разработаны лабораторные регламенты производства порошка, пасты и жидкой культуры в условиях биофабрик МСХ РФ.
Разработана технология применения новых биопрепаратов для защиты семян, вегетирующих растений и почвы в интегрированной системе защиты подсолнечника от комплекса вредителей и болезней.
Биопрепарат вермикулен включён Госхимкомиссией МСХ РФ в «Список пестицидов и агрохимикатов, разрешённых к применению на территории РФ» для защиты подсолнечника, колосовых зерновых и винограда от комплекса болезней.
Показаны высокая биологическая эффективность разработанных биопрепаратов против склеротиниоза подсолнечника и сдерживающее влияние на поражение фомопсисом и фузариозом. Биологическая эффективность би-препаратов в отношении возбудителя белой гнили составляет 49,0 - 100 %, возбудителя фомопсиса — 18,0-58,0 %, возбудителя фузариоза - 14,0 -78,0 %; устойчивое снижение инфекционного запаса возбудителя белой гнили в почве составляет 81,8 - 100 % и возбудителя фомопсиса - 48,6 -100 %, что гарантирует сохранение урожая подсолнечника от 0,2 до 0,5 т/га.
Показана эффективность биопрепаратов против комплекса болезней зерновых и винограда.
В условиях Краснодарского края вермикулен ежегодно с 1991 года применяется на площади 8,0 - 10,0 тысяч гектаров. Кроме того, биопрепарат широко испытывался в других регионах РФ - Ставропольском крае, Ростовской, Белгородской, Воронежской, Оренбургской, Омской, Тамбовской, Волгоградской областях и показал высокую эффективность против белой гнили, а также отмечено снижение поражения подсолнечника серой гнилью, фомопсисом, фузариозом и вертициллёзным увяданием.
Апробация работы и публикация результатов исследований.
Результаты исследований докладывались на Межведомственной комиссии ВАСХНИЛ по микробиологическим средствам (1987 г., Минск); всероссийских совещаниях по биологической и экологизированной защите растений (1995 - 1996 гг., Краснодар); годичном собрании РАСХН (отделение растениеводства, 1996 г., Москва); региональной конференции «Биосфера и человек», 1997 г., Майкоп; всероссийской научно-практической конференции «Фитосанитарная ситуация на посевах сельскохозяйственных культур юга России и экологизация систем защиты растений», 1998 г., Краснодар; IV международной, VII всероссийской научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды», 1998 г., Рязань; научно-практической конференции «Научное обеспечение увеличения производства высококачественных маслосемян подсолнечника», 1998 г., Вейделевка, Белгородской области; научно-практической конференции «Фитосанитарная ситуация на посевах сельскохозяйственных культур юга России и экологизация систем защиты растений», 2000 г., Краснодар; международной научно-практической конференции «Биологизация защиты растений: состояние и перспективы», 2001 г., Краснодар; региональной научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», 2002 г., Краснодар; юбилейной конференции посвященной 90-летию со дня основания ВНИИМК, 2002 г., Краснодар; первом съезде микологов «Современная микология в России», 2002 г., Москва; международной научно практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», 2004 г., Краснодар, ежегодных отчётно-плановых сессиях учёного совета ВНИИМК.
По материалам диссертации опубликовано 44 работы общим объёмом 14,3 печатных листов, в том числе: 2 авторских свидетельства, 1 патент, 4 рекомендации по защите подсолнечника от вредителей и болезней (1996-2004 гг.).
По результатам работы присуждена премия Администрации Краснодарского края (1996 г.).
Структура работы. Диссертация изложена на 377 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, основных выводов, рекомендаций производству, списка литературы, приложений, включает 113 таблиц, 55 рисунков. Список библиографических источников включает 381 наименование, в том числе 246 на иностранных языках.
Автор приносит благодарность научным сотрудникам ВНИИМК, с которыми в разные годы проводила совместные эксперименты: О.А. Лавричен-ко, Е.Ю. Шипиевской, Н.В. Мурадосиловой, СВ. Косовой, Н.П. Ретюнских, к.б.н. О.И. Тихонову, к.б.н. И.И. Шуляку; за помощь в разработке технологии глубинного культивирования вермикулена к.б.н. Г.Н. Наумову; за испытания биопрепаратов на других сельскохозяйственных культурах д.б.н., профессору М.И. Зазимко, к.б.н. Л.Д. Жалиевой, к.б.н. А.И. Талаш; за техническую помощь в работе с компьютером к.б.н. Н.М. Араслановой, к.б.н. СВ. Зеленцо-ву, A.M. Асатуровой; за критические замечания и помощь при подготовке данной рукописи член.-корр. РАСХН В.А. Павлюшину, к.б.н., профессору Э.А. Пикушовой, д.б.н. Н.И. Бочкарёву, д.с.-х.н. А.А. Свиридову, д.б.н. Т.С Антоновой.
Выявление, изучение и практическое применение антагонистов, гиперпаразитов и их метаболитов для защиты растений
Большая часть исследований по интродуцируемым организмам проведена с грибами. Обширные литературные данные во многих странах мира посвящены использованию для биологической защиты растений от грибных болезней препаратов, содержащих грибы из рода Trichoderma (Т. viride, Т. harzianum, Т. koningii, Т. hamatum и др.). Как агенты биологической борьбы они имеют ряд достоинств - широкое распространение в почвах и способность продуцировать активные антибиотики (глиотоксин, виридин, триходермин, соцука-циллин, аламецин, дермадин и др.). В нашей стране разработаны несколько препаративных форм биопрепарата триходермина. Способы получения и использование этих препаратов, а также результаты применения на практике приведены в работах Федоринчика (1976, 1977).
Выделению, изучению и применению грибов рода Trichoderma посвящена монография Сейкетова (1981).
В ВИЗР разработаны формы препарата триходермина, различающиеся составом питательных сред при культивировании гриба. Первоначально предложен препарат триходермин-1. Гриб выращивали на высококонцентрированных белково-углеводных питательных средах (зерновки овса, ячменя, пшеницы, кукурузы). Эта форма использована в качестве маточной культуры для получения других форм биопрепарата (триходермина-2 и триходермина-3), которые получают при массовом выращивании гриба в условиях поверхностной культуры. Для получения триходермина-2 в качестве питательной среды использовали различные растительные субстраты в измельчённом и пропаренном виде (солома, гузапая, разные травы, мякина, отходы зерна). Для приготовления триходермина-3 в качестве субстрата использовали прогретый торф. Разработана технология получения биопрепарата триходерми-на-4 на основе глубинного выращивания штаммов гриба Trichoderma lignorum.
В настоящее время разработаны оптимальные регламенты применения триходермина в условиях закрытого и открытого грунта. Итоги многолетних испытаний биопрепарата приведены латвийскими исследователями (Апсите и др., 1989). По их данным наиболее эффективной оказалась жидкая мицели-альная форма Т. viride. Эффективная доза триходермина для многих сельскохозяйственных культур составляет 20 мл/м2. Перед предпосевным внесением в почву, препарат разбавляется в 25 раз, при этом гриб хорошо приживается и сохраняется в почве до конца вегетации.
В условиях теплиц препарат вносили из расчета 200 мл/м почвогрунта за 3 - 4 недели до посева. При этом на огурцах обеспечивалась защита от Pythium debarianum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, F. solani, Verticillium albo-atrum. Прибавка урожая по отдельным культурам составляла 15,5 %. Экономически выгодно использовать триходермин в закрытом грунте, поскольку в почве всегда создаются благоприятные для гриба гидротермические факторы. Препарат используют для защиты растений от корневых гнилей путем обработки семян, внесения в торфоперегнойные горшочки или лунки при высадке рассады. Можно вносить суспензию гриба путем полива в рядки во время вегетации.
Различным способам применения триходермы в закрытом грунте посвящены работы отечественных и зарубежных исследователей (Винокурова, 1991; Рябова, 1994; Гринько, 1995; Georqieva, 1992; Bedian, 1996; Koch, 1996; Sctienberd, 1997; Bedlar, Gerhard, 1997; Свереда, 2000; Марютин, 2000).
Высокая эффективность триходермина даже в пониженной дозе при обработке семян различных сельскохозяйственных культур суспензией спор гриба и его использование при дражировании или микрокапсулировании семян позволяют более широко использовать этот препарат для защиты посевов от болезней в полевых условиях.
Применению препарата триходермы на зерновых посвящены работы отечественных исследователей. Предпосевная обработка семян яровой пшеницы триходермином с белги защищает посевы от корневых гнилей в течение всей вегетации и достоверно повышает урожай (Шкаликов, Шеховцова, 1995). Исследователи из Италии, США, Словении показывают эффективность различных видов триходермы (Т. viride, Т. harzianum, Т. koningii) против Gaeumannomyces graminis var. tritici на зерновых - выпревания пшеницы и ожога ярового ячменя (Tnnocenti, 1991; Duffy, Ownley, Weller, 1997; Kulichova, 1997).
Исследователи из Румынии применяли триходерму (Т. viride, Т. sp.) для защиты винограда от комплекса болезней {Plasmopara viticola, Phomopsis viticola, Uncinula neconor, Botrytis cinered) (Sesan, 1990). Ученые из Турции защищал виноград опрыскиванием черенков, а также внесением опилок со спорами гриба Т. harzianum против серой гнили, фу-зариоза и питиума (Yildiz, Gursoy, 1994).
В Германии применяли Т. harzianum против Cylyndrocladium scoparium цветочных культур (Neubauer, Zinkernagel, 1996).
Отечественые исследователи применили триходерму (Т harzianum) для защиты сеянцев хвойных пород от полегания, вызываехмого грибами из родов Alternaria, Botrytis, Cladosporium, Pythium, Fusarium (Громовых и др., 1998, 1999).
В Англии, Франции, Швеции, Австралии триходерму (Г. viride) применяли для борьбы с млечным блеском плодовых культур, вызываемым Stereum purpureum. Обработка деревьев яблони, груши, сливы, персика в ранней стадии развития болезни снижала потери на 65,0 %. Обработку суспензией три-ходермы совмещали с обрезкой деревьев (Schaffer, 1977).
В Норвегии, Канаде, США, Бельгии, Шри-Ланка проводили исследования по применению различных видов Trichoderma для защиты садовых культур и земляники (Trousmo, 1989; Peng, Sutton, 1990; Smith, Wilcox, Harman, 1990; Hofte et al., 1992; Sivakumar, 2000).
При использовании биологических препаратов на основе грибов из рода Trichoderma возникает ряд вопросов, связанных с развитием интродуцен-тов при внесении их в почву. При попадании в новую среду популяция антагониста должна быстро адаптироваться к обитанию в уже существующем микробиоценозе. Исследованиями Федоринчика установлено, что накопление и активная деятельность Trichoderma sp. наблюдается преимущественно в нормально увлажненных и хорошо прогреваемых почвах, богатых органическими веществами.
Методы проведения микробиологических исследований
Научно-исследовательская работа проводилась на центральной экспериментальной базе Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени B.C. Пустовойта (г. Краснодар) в период 1981 -2004 годов.
Объектом исследований служили: штаммы грибов и бактерий-антагонистов возбудителей белой, серой и пепельной гнилей, фомопсиса, фу-зариозов, вертициллёзного увядания, тест-культуры самих возбудителей болезней подсолнечника, биопрепараты, восприимчивые к болезням сорта подсолнечника - Передовик, Донской низкорослый, ВНИИМК 8883, Р-453, Лидер.
Выполнение исследовательских работ по выбранным направлениям предполагало использование методов лабораторных исследований, закладку вегетационных, мелкоделяночных полевых и производственных опытов. Использованные в работе изоляты возбудителей болезней собраны с посевов подсолнечника в Краснодарском крае.
Выделение штаммов антагонистов возбудителей болезней подсолнечника проводили в разных агроклиматических зонах Краснодарского края: центральная зона (Краснодар и Кореновский район), предгорная зона (От-радненский район), северная зона (Щербиновский район).
Видовой состав грибов-антагонистов определяли по комплексу куль-турально-морфологических признаков и физиолого-биохоимическим свойствам по определителям: Пидопличко (1977); Литвинова (1967); Кириленко (1977), бактерий - по определителю Берги (1997).
Идентификацию перспективных штаммов грибов и бактерий-антагонистов проводили в Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова: Сизова Т.И., Прохоров В.П. и Скворцова И.Н.
Опытные серии биопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов и бактерий были изготовлены в лаборатории биометода ВНИИМК и в Северо-Кавказском НИИ «БИОТЕХХИМ» (г. Краснодар).
Лабораторно-вегетационные методы оценки антагонистической активности выделенных штаммов антагонистов проводили в условиях лаборатории биометода и в фитотроне ВНИИМК на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили на восприимчивых сортах: Передовик, Родник и Донской низкорослый 60.
Полевые мелкоделяночные и производственные опыты по испытанию биопрепаратов, наработанных на основе активных штаммов-антагонистов проводили на фоне искусственного заражения возбудителем белой гнили и при естественном поражении патогенами на центральной экспериментальной базе ВНИИМК, в предгорной зоне Краснодарского края - в Отрадненском районе (ст. Отрадная), в республике Адыгея - в Майкопском районе (ст. Да-ховская), в Белгородской области на Белгородской опытной станции ВНИИМК, в Вейделевском районе (пос. Вейделевская), в Горячеключевском и Усть-Лабинском районах Краснодарского края на восприимчивых сортах: Передовик, Донской низкорослый 60, ВНИИМК 8883, Лидер и Р-453.
На центральной экспериментальной базе (г. Краснодар) и в Усть-Лабинском районе Краснодарского края почвы представлены выщелоченным, слабогумусным, сверхмощным, тяжёлосуглинистым чернозёмом, рН водной вытяжки пахотного слоя 6,5 - 7,2, степень насыщенности основаниями 96,0 - 97,0 %. В пахотном слое содержится: гумуса 3,50 - 4,00 %; азота общего 0,25 - 0,35 %; фосфора общего 0,16 - 0,22 %; калия общего 1,50 -2,00 % (Симакин, 1983).
Усть-Лабинский район относится к зоне с умеренным увлажнением, за год выпадает 600 - 700 мм осадков. Сумма температур за период вегетации составляет 2600 - 3400 С. Зима умеренно мягкая. Средняя температура янва 65
ря - 3,5 С, минимальная температура до - 30 С. Безморозный перид продолжается 185 - 225 дней. Лето жаркое. Средняя температура июля составляет 22 - 26 С, максимальная - может повышаться до 38 - 40 С. Осадки кратковременные, преимущественно ливневые. За период вегетации выпадает 250 - 400 мм осадков.
В Горячеключевском районе почвы бурые, лесные. Верхний горизонт характеризуется слабокислой реакцией (рН 6,2 - 6,5). В пахотном слое содержится 0,70 - 0,80 % гумуса, общего азота — 0,03 - 0,06 %, фосфора - 0,05 -0,12 %, К20 - 6,20 - 8,40 мг/100 г почвы (Соколов, Фридганд, 1984).
Горячеключевской район относится к зоне достаточного увлажнения, за год выпадает 650 - 800 мм осадков. Сумма температур за вегетационный период составляет 2400 - 2800 С. Зима мягкая. Средняя месячная температура января колеблется в пределах от - 4,0 до 0,5 С; минимальная температура может быть до - 30 С. Продолжительность безморозного периода 175 - 195 дней. Средняя месячная температура июля лежит в пределах 18-22 С, максимальная - достигает 36 - 40 С.
Почвенно-климатические условия станицы Даховской Майкопского района республики Адыгея сходны с Горячеключевским районом. Однако, участок, на котором закладывали мелкоделяночные опыты по испытанию биопрепаратов на фоне искусственного заражения корзинок подсолнечника возбудителем белой гнили, расположен в долине между гор, что создавало микроклимат с туманами, благоприятный для заражения.
Скрининг выделенных микроорганизмов
Ступенчатый скрининг выделенных микроорганизмов включал первичную оценку антагонистической активности штаммов in vitro на большом количестве тест-объектов, затем биологическую активность отобранных штаммов определяли на фоне искусственного заражения патогенами во влажной камере в лабораторных условиях. Активные штаммы оценивали на фитотоксичность и ростостимулирующую активность. Наработанные опытные партии биопрепаратов испытывали в мелкоделяночных опытах и производственных условиях.
Скрининг вели к возбудителям основных болезней подсолнечника белой гнили - Sclerotinia sclerotiorum, серой гнили - Botrytis cinerea, пепельной гнили - Sclerotiam bataticola, фомопсиса — Phomopsis helianthi, фузариозов - Fusarium oxysporum var. orthoceras и Fusarium sporotrichiella var. poae, вертициллёзного увядания — Verticillium dahliae методами двойных культур и инфекционной капли.
При определении антагонистической активности выделенных грибов методом двойных культур их взаимоотношения с возбудителями болезней подсолнечника сводились к нескольким типам: первый - нарастание колонии антагониста на колонию патогена и прекращение роста последнего. Данное взаимоотношение с патогеном характерно для грибов из родов Penicillium, Gliocladium, Trichoderma. Эти грибы отличались быстрым ростом в чистой культуре. Их мицелий быстро занимал основную поверхность площади питания и затем разрастался на мицелии патогена; второй - замедление роста колонии одного гриба на некотором расстоянии от колонии другого гриба (антибиотическая зона). Такая зона от 0,1 до 1,2 см отмечена при взаимодействии с грибами из родов Penicillium, Sordaria, Trichoderma, Chaetomium, Trichothecium и грибов из класса Basidiomycetes; третий - выросшие колонии патогена и антагониста при соприкосновении имели равные размеры. Такой тип антагонизма проявлялся при взаимодействии непатогенных штаммов рода Fusarium с высокопатогенным представителем этого рода Fusarium sporotrichiella var. poae; четвертый — при одновременном посеве антагониста и патогена в начальный период наблюдался более интенсивный рост патогена, который занимал 70,0 - 75,0 % поверхности питательной среды. Затем наблюдалось постепенное изменение окраски и структуры мицелия патогена и на 15 - 20 день культивирования все образовавшиеся склероции были покрыты плодовыми телами антагониста. Такой тип взаимоотношений характерен для возбудителя белой гнили и антагонистов из рода Coniothyrium и Chaetomium.
Результаты испытания антагонистической активности перспективных штаммов грибов из коллекции выделенных микроорганизмов к возбудителям белой гнили, фомопсиса, фузариоза, пепельной гнили и вертициллёзного увядания методом двойных культур представлены на рис. 3.3 - 3.7.
Максимальную антагонистическую активность к возбудителю белой гнили при одновременном посеве в чашки Петри проявили грибы из рода РепісіШит (рис. 3.3, приложение 2). Мицелий этих грибов быстро занимал основную поверхность площади питания и затем разрастался на колонии белой гнили, не давая образовываться склероциям. Особенно выделялся гриб РепісіШит vermiculatum, в двойной культуре с которым мицелий патогена успевал обрасти только посевной блок, и полностью подавлялся антагонистом. У остальных выделенных представителей этого рода колония патогена успевала занять 26,7 - 33,3 % площади питания, при этом у РепісіШит verrucosum она затем зарастала мицелием антагониста. Также высокую антагонистическую активность к возбудителю белой гнили проявили грибы из рода Trichoderma. Площадь зарастания поверхности питательной среды в чашке Петри в двойных культурах составляла 60,0 - 93,3 %, а патоген успевал занять от 20,0 до 50,0 % поверхности. Максимальная антагонистическая активность у грибов этого рода отмечена у Trichoderma hamatum — площадь зарастания поверхности питательной среды у антагониста составила 93,3 %, у патогена — 33,3 %, а зона нарастания антагониста на патоген составила 26,6 %. Высокую скорость роста и антагонистическую активность показали грибы Aspergillus flavus, Gliocladium roseum и Sordaria macrospora Auersw. — площадь зарастания поверхности питательной среды в чашке Петри составила 80,0 - 100 %. Особого внимания заслуживает гриб Sordaria macrospora Auersw., у которого патоген успевал обрасти только посевной блок, и при этом антагонист образовывал антибиотическую зону в 2,0 мм. Антагонист Trichothecium roseum не занимал большую поверхность площади питания, но образовывал максимальную у испытанных грибов антибиотическую зону - 5,0 мм.
Штамм XK-l-4 Chaetomium olivaceum Cooke et Ellis
Селекция штаммов гриба-антагониста Penicillium vermiculatum Dang. При разработке технологии производства биопрепарата проводили исследования по селекции штамма РК-1-3 Penicillium vermiculatum Dang, с целью стабильного повышения активности исходного штамма, так как в результате многолетнего хранения и многократных пересевов он ослабил свою антагонистическую активность.
Исследования включали следующие этапы: - определение характера взаимодействия ультрафиолетовых (УФ) лучей на штамм; - получение спектра морфологических мутантов воздействием на штамм физического мутагена; - стабилизация и изучение свойств полученных мутантов с целью отбора из них штаммов с повышенной антагонистической активностью для последующей селекции; - усиление антагонистических свойств отобранных штаммов методом ступенчатого стабилизирующего отбора.
Наличие среди РК-1-3 биохимических мутантов исследовалось методом отпечатков. Биохимических мутантов не выявлено. В качестве мутагена мы использовали УФ-излучение (источник излучения - ртутная лампа низкого давления БУВ - 30).
Поскольку частота появления мутантов для каждого объекта исследо вания строго индивидуальна, мы провели предварительные эксперименты по подбору расстояния между источником излучения и объектом облучения. Удалённость источника излучения от объекта в наших исследованиях составляла 20,0, 40,0 и 60,0 см. Наиболее оптимальным оказалось расстояние в 20,0 см. Дозы облучения измерялись в секундах. Интервал между дозами был взят узкий для большей точности исследований. Использовались экспозиции от 1 до 240 секунд. Воздействие УФ-лучей осуществлялось методом облучения водной стандартизированной взвеси спор, равномерно распределённой по поверхности картофельно-сахарозного агара в чашках Петри. Во избежание явления фотореактивации, облучение проводили в тёмном боксе. Сопоставление количества колоний, выживших после облучения и выросших в не-облучённых чашках Петри, позволило выявить зависимость выживаемости спор от дозы облучения.
В результате облучения получено большое количество морфологических мутантов, большинство из которых оказались крайне нестабильными, поэтому подвергались дальнейшему стабилизирующему отбору (методом пересева мутантных секторов колоний на картофельно-сахарозный агар).
Выявлено, что при различных дозах облучения появляются идентичные по морфологии мутанты, активность которых может совпадать, но может и отличаться друг от друга. Зависимость между морфологией мутантов и активностью не выявлена.
В итоге, после объединения идентичных мутантов, полученных в процессе облучения, выделено 34 морфологических мутанта исходного штамма РК-1-3, из них восемь характеризовались стабильностью.
Активность всех стабильных мутантов исследовали методом двойных культур. В качестве тест-культуры использовали возбудителя белой гнили -Sclerotinia sclerotiornm. Наши наблюдения показали, что мутанты, резко отличающиеся по морфологии от исходного штамма РК-1-3 и полученные, как правило, при большой дозе облучения, обладают активностью ниже, чем у штамма РК-1-3.
При малой дозе облучения в течение 10 секунд получен мутант, внешне идентичный РК-1-3, но превосходящий его по активности. Этому мутанту присвоен шифр М-24 и он оставлен для ступенчатого стабилизирующего отбора.
При облучения в течение 60 секунд получен мутант, отличающийся от исходного морфологически и обладающий отличным от РК-1-3 механизмом взаимодействия с патогеном. Он может существовать в двух формах: в первом случае - выделяя в питательную среду антибиотик, что выражается в большой антибиотической зоне (12,0 мм), во втором - существуя как гиперпаразит. Мутантам присвоен шифр М-1 и М-1а.
Оценка возможности повышения антагонистической активности гриба Penicilliumvermiculatum Dang, изучалась на исходном штамме РК-1-3.
Из моноконидиального рассева отбирали изоляты, морфологически выровненные, показавшие высокую антагонистическую активность в двойных культурах с возбудителем белой гнили для последующего моноконидиального рассева. Культуры, отличные от исходной, с низкой антагонистической активностью, отбраковывали.
