Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени известно более 100 видов микоплазм, простейших лишенных клеточной стенки прокариот, способных к самостоятельному воспроизведению. Будучи объединенными в общий таксон - класс Mollicutes, микоплазмы представляют по уровню ДНК-гомологии чрезвычайно гетерогенную группу организмов (опероны генов рРНК являются единственными протяженными гомологичными участками ДНК ряда микоплазм). Этот факт исследователи связывают с высокой скоростью мутационного процесса микоплазм, нестабильностью их генома вследствие частых событий реорганизации ДНК по типу "выщепления-встраивания", в том числе в процессе взаимодействия с клетками высших эукариот (Чернова и др., 1986; Woese et al., 1984; Harasawa et al., 1992). Значительная часть представителей класса Mollicutes "скрыта" в группе некультивируемых на бесклеточных питательных средах микоплазм,
микоплазмоподобных организмов (МПО). Вопрос о происхождении МПО
широкого спектра "штаммов" некультивируемых микоплазм остается пока открытым. В самое последнее время установлено тесное генетическое родство МПО с микоплазмами рода Achokplasma (Namba et al., 1993). Это позволяет предполагать, что МПО являются потомками представителей рода Achokplasma.
Многие виды МПО являются возбудителями более 300 различных заболеваний растений (McCoy et al., 1989). Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного растениеводства, в том числе в основных районах хлебопашества и овощеводства, при этом потери урожая зерна иногда составляют 80-90%, а овощей - 20-30% (Скрипаль, 1988). По вредоносности микоплазменные инфекции растений относят к катастрофическим заболеваниям, часто принимающим характер эпифитотий. Развитие этих инфекций, как правило, обусловлено нарушением симбиотического равновесия экосистем.
Специфичные факторы патогенносте микоплазм до сих пор не установлены. Весьма вероятно, что в основе фитопатогенеза в случае микоплаз-менных инфекций лежат механизмы, обеспечивающие длительную перси-стенцию микоплазм в организме хозяина. Принимая во внимание феноменально высокий уровень гетерогенности ДНК представителей класса
Mollicutes, можно предположить, что эти процессы связаны с геномной изменчивостью микоплазм, обуславливающей ускользание этих микроорганизмов от защитных механизмов растений и их персисгенциго (длительное сохранение) в новых экосистемах.
Решение проблемы управления микоплазменными инфекциями лежит на пути изучения молекулярных механизмов взаимодействия в системе "паразит-хозяин", В этой связи разработка, постановка и исследование модельных (микоплазмы - растительные клетки) систем, могущих отражать природные процессы взаимоотношения паразита и хозяина, представляются весьма целесообразными. Однако в этом направлении сделаны лишь первые шаги. Развитие подобных исследований в значительной мере сдерживается отсутствием эффективных диагностических средств для обнаружения, идентификации микоплазм, инфицирующих растения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение морфофизиологических и молекулярных аспектов взаимодействия клеток микоплазм и растений.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать высокочувствительные диагностические зонды для обнаружения микоплазм в клетках растений на основе ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции;
-
Определить особенности влияния Acholeplasma laidlawii на морфологию, физиологию, геном, а также ультраструктуру клеток растений
(Pisum sativum);
3. Выяснить молекулярные особенности взаимодействия в системе
"паразит-хозяин".
Научная новизна работы. В настоящей работе показано, что ахоле-плазмы (в частности, Acoleplasma laidlawii) могут быть возбудителями заболеваний растений: эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфичные изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов, возникающих у растений в природных условиях спонтанно. Впервые установлено, что колонизация растительных тканей клетками микоплазм (Acholeplasma laidlawii) сопровождается изменением ряда физиологических параметров, связанных с биосинтезом полипептидов, системой вторичных мессенджеров и фосфори-
лированием белков растений. Впервые показано, что микоплазменные инфекции вызывают изменения как ультраструктуры, так и генома клеток растений. Впервые установлено, что при взаимодействии A.laidlawii с клетками растений.. (Pisum sativum) происходит реорганизация генома мико-плазм, сопровождающаяся трансформацией этих микроорганизмов в не-культивируемые формы. Впервые показано, что ответные реакции растений на микоплазменные инфекции связаны с включением классических сигнальных механизмов подавления патогенов. Предполагается, что реорганизация геномов взаимодействующих организмов может играть ключевую роль в специфичных процессах адаптации в системе "наразит-хозяин". На основе полученных в настоящей работе данных выдвинута гипотеза о происхождении микоплазмоподобных организмов (МПО).
Научно-практическая значимость работы заключается в создании высокочувствительных диагностических проб для обнаружения микоплазменных инфекций с помощью ДНК-ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции, которые могут быть использованы для выявления возбудителей заболеваний растений, в сельском хозяйстве для проверки семенного материала, а также в научных лабораториях, где проводятся исследования на растительных культурах и целых растениях.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Создание высокочувствительных диагностических систем для обнаружения микоплазм в клетках растений;
-
Разработка методов искусственного инфицирования микоплазмами растений;
-
Характеристика морфологических, ультраструктурных, физиологических и кариологических параметров растений P.sativum, инфицированных A.laidlawii.
-
Молекулярные особенности взаимодействия в системе "микоплазма-растение".
-
Трансформация клеток A.laidlawii в некультивируемые формы в процессе их взаимодействия с клетками растений.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерии для решения биотехнологических проблем" (Тарту, 1988), 9-ой Всесоюзной конференции "Нуклеазы" (Казань, 1991), Международной конференции по
быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1993), 15-ом Международном ботаническом конгрессе (Токио, Япония, 1993), 3-ем Съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже 21 века" (Москва, 1994), 1-ом Евразийском конгрессе по генной терапии (Анкара, Турция, 1995), 8-ом Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, Израиль, 1996), 2-ой Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1996), 5-ой конференции по фитоплазмам (Пекин, Китай, 1996), Конгрессе "От молекулярных механизмов к растениям" (Италия, 1996), Международной конференции по фитопатологии (Познань, Польша, 1997), а также на 7-ом (Вена, Австрия, 1988), 8-ом (Стамбул, Турция, 1990), 9-ом (Эймс, США, 1992), 10-ом (Бордо, Франция, 1994), 11-ом (Орландо, США, 1996) Конгрессах Международного общества микоплазмологов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 работ, включая 24 статьи в центральных отечественных и зарубежных изданиях, а также 5 авторских свидетельств на изобретения.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН. Экспериментальные результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично, а также совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной генетики, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, теоретическое обобщение получаемых результатов и выводы из работы.
Часть работы по определению физиологических параметров у инфицированных микоплазмами растений выполнена в соавторстве с сотрудниками лаборатории метаболизма белков КИБ КНЦ РАН. Автор приносит благодарность всем коллегам, способствовавшим осуществлению данной работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Экспериментальная часть", "Заключение",
"Выводы" и "Список литературы". В работе представлено 5 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 265 источников.
