Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Фармакологические способы стимуляции процессов регенерации и репарации 10
1.2. Иммунные реакции и роль цитокинов в регенерационыых и репарационных процессах 21
1.3. «Ронколейкин» как представитель цитокинов, и его применение в медицине 25
1.4. Основные этапы посттравматической регенерации кожи 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Характеристика подопытных животных 33
2.2. Характеристика лекарственного препарата «Ронколейкин» 33
2.3. Методы применения лекарственного препарата «Ронколейкин» 35
2.4. Техника моделирования полнослойных ран кожи 38
2.5. Цитологическое исследование раневого экссудата 38
2.6. Микроскопическое исследование тканей регенерата 39
2.7.Ультраструктурное изучение фибробластов грануляционной
ткани 40
2.8. Биометрическая оценка результатов исследования и статистическая обработка данных экспериментов з собственные исследования 40
ГЛАВА 3. Цитологические изменения в ранах при применении растворов «ронколейкина» 42
3.1. Характеристика цитограмм раневого экссудата при применении «Ронколейкина» в виде аппликации на рану 42
3.2. Анализ клеточного состава раневого экссудата в цитограммах при подкожном введении «Ронколейкина» 50
3.3. Сравнительная характеристика клеточного состава раневого экссудата при сочетанном (аппликации на рану и подкожные инъекции) применении «Ронколейкина» 57
ГЛАВА 4. Морфофункциональные особенности процесса заживления полнослойных ран кожи подвлиянием «ронколейкина» 64 .
4.1. Характеристика гистологических изменений в регенерирующих структурах экспериментальных ран кожи при аппликационном применении «Ронколейкина» 64
4.2. Морфологические изменения и характеристика регенерирующих структур экспериментальных ран кожи после подкожного введения «Ронколейкина» 76
4.3. Морфофункциональная характеристика тканей регенерата призаживлении экспериментальных ран кожи при сочетанном способе (аппликация на рану и подкожное введение) применения«Ронколейкина» 90
ГЛАВА 5. Ультраструктурная организация фибробластов грануляционной ткан заживающей асептической раны после применения «ронколейкина» 100
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 110
Выводы 131
Практические рекомендации 131
Список литературы 132
- Иммунные реакции и роль цитокинов в регенерационыых и репарационных процессах
- Характеристика лекарственного препарата «Ронколейкин»
- Биометрическая оценка результатов исследования и статистическая обработка данных экспериментов з собственные исследования
- Анализ клеточного состава раневого экссудата в цитограммах при подкожном введении «Ронколейкина»
Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная медицина обладает различными способами лечения ран, в том числе и с помощью лекарственных средств. Однако до сих пор ведется постоянный поиск оптимальных методов стимуляции заживления обширных ран, ожогов, трофических язв кожи [Вялов П., 1999; Хомулло Г. В., Базанов Г. А., 2004; Волкова О. В., 2006]. Известно значительное количество веществ природного и синтетического происхождения, обладающих репаративными свойствами.
Вместе с тем предпочтение отдается естественным природным средствам из разных фармакологических групп, которые в отличие от веществ синтетического происхождения чаще всего лишены побочных эффектов [Спиридонова Т. Г., 2001; Решетько О. В. и соавт., 2008; Kubo К., Kuroyanagi Y., 2003].
В связи с этим интерес к веществам биогенной природы, которые позволяют обнаружить новые эффективные фармакологические пути решения проблемы оптимизации процессов регенерации и репарации, вполне объясним. К группе веществ, перспективных для изучения в этом направлении, относятся иммуномодулирующие средства, т. к. установлено непосредственное регулирующее влияние иммунной системы на течение восстановительных процессов в тканях организма [Ершов Ф. И., 1995; Пустовалова Р. А. и соавт., 2008; Stotzem D. et al., 1992]. В частности, как иммунотропное средство в медицинской практике применяют иммуномодулятор «Ронколейкин», созданный на базе интерлейкина-2 [Скороходкина О. В., 2000; Николаева 3. К., 2002]. Лекарственный препарат «Ронколейкин» разработан медико-биотехнологической фирмой ООО «БИОТЕХ», организованной на базе лаборатории биохимической генетики Санкт-Петербургского государственного университета совместно с СПбНИИ вакцин и сывороток. Он разрешён для медицинского применения и промышленного выпуска Приказом Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации № 249 от 31 августа
4. Оценить влияние различных способов назначения «Ронколейкина» на активность репаративных процессов в травматических ранах кожи.
Научная новизна. С помощью комплекса экспериментальных морфологических методик установлено стимулирующее влияние иммуномодулятора «Ронколейкин» на течение различных этапов репаративного процесса. Впервые определена динамика восстановительных процессов при применении препарата на отдельных этапах заживления рай кожи на разных уровнях структурной организации (субклеточном, клеточном, тканевом и органном). Впервые изучены и сопоставлены скорость, характер и специфика заживления ран в эксперименте на модели полнослойного дефекта кожи при различных способах применения «Ронколейкина» (аппликация на кожную рану, подкожное введение и сочетанное воздействие).
Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили выявить пути реализации положительного воздействия иммуномодулятора «Ронколейкина» на репаративные процессы.
Особенности морфофизиологических изменений регенерирующей ткани па всех этапах репаративного процесса в проведенных исследованиях дают возможность обеспечить оптимальное использование препарата для достижения эффекта стимуляции при заживлении полнослойных дефектов кожи. Полученные результаты могут быть использованы для обоснования последующего внедрения в клиническую практику «Ронколейкина» как ранозаживляющего средства.
Апробация работы и внедрение. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Пятой медицинской ассамблее союза городов Заполярья и Крайнего Севера (Москва, 2004); XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006); I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» (Астрахань, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); на совместных заседаниях кафедр фундаментальной и клинической фармакологии и биологии ГОУ ВПО ТГМА (Тверь, 2007, 2008) Публикации. По теме диссертации опубликовано десять научных работ, в том числе две - в изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста. Состоит из следующих разделов: общей характеристики работы, обзора литературы, 3-х глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический список включает 286 источников, из них 187 отечественных и 99 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 65 рисунками (59 микрофотографий, 3 графика и 3' схемы), содержит 18 таблиц.
Иммунные реакции и роль цитокинов в регенерационыых и репарационных процессах
Заживление раны - это сложнейший биологический процесс, в который вовлекаются не только клеточные элементы соединительной ткани, но и все органные системы, в том числе и иммунная, основной задачей которой является разрушение патогена или дефектных структур собственных тканей и их элиминация [Бабаева А. Г., 1985; Sedlacek Н.-Н., Могоу Т., 1995]. Важнейшим компонентом, реализующим эффекты иммунной системы, являются цитокины. Они продуцируются различными клетками организма: стромальными клетками, эндотелиоцитами, фибробластами, макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами, тромбоцитами и др. [Костгочснок Б. М.. Карлов В. А., 1990; Пауков B.C., Серов В.В., 1995; Van Limzen .1. et al., 1999J. Их действие реализуется по следующему принципу: передаваемая клеткой информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных цитокинов. При этом цитокины действуют последовательно и индуцируют выработку друг друга, а так же адаптируют поверхностные рецепторы клеток к другим медиаторам [Черных Е.Р. и соавь. 2001; Измаилович В.К., 2002; Ковшик И. Г., 2004; Степанов А.В. и соавт., 2004]. Стимулирующее или ингибирующее действие цитокинов осуществляется посредством связывания их с большим количеством рецепторов на поверхности клеток. Количество рецепторов к цитокинам на клетке мишени значительно варьирует в зависимости от вида цитокина (от 100 до 100 0000). Одни и те же цитокины могут выполнять различные функции. Этот феномен объясняется плейотропностью и полифункциопальностыо действия этих биологически активных веществ, а также множеством клеток - мишеней, па которые они действуют. Также очевидно, что различные цитокины могут выполнять одну функцию [Варганов М. В. и соавт., 2006; Козлов В .К.. Цыган В.Н., 2007; Симбирцев А.С., 2007]. В 1985 г. А. Г. Бабаевой в эксперименте доказано, что нарушение синтеза цитокинов является одной из главных причин, замедляющих процессы регенерации органов и тканей. В дальнейшем рядом исследователей [Петров Г. А., 2000; Козлов В.К., Цыган В.П., 2007; Zen К., Parkos С, 2003] показана активная роль цитокинов в регуляции функции фибробластов и фагоцитарных клеток. Установлено, что иммунокорригирующее действие цитокинов может быть направлено на клетки, участвующие как в воспалительной реакции (фагоциты,
Т-лимфоциты) и регенерационном процессе (фибробласты, эндотелнальные клетки и др.), так и в развитии иммунного ответа. В этих процессах зкзогепно введенные цитокины выполняют двойственную функцию. С одной стороны, они инициируют миграцию клеток крови в рану, стимулируют кислородный метаболизм и фагоцитоз, ведут к очищению раневой поверхности от гнойно-некротических масс, способствуют ускорению завершения фазы воспаления. С другой стороны, экзогенные цитокины запускают локальный цитокпповый каскад с участием клеток раны, стимулируя синтез коллагена, пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток [Бережная Н.М., 2007; LcRoy К.С. et al., 1990; Ono Let al., 1995]. Осуществление гуморального и клеточного вариантов иммунного ответа, опосредованных цитокинами, тесно связано с фагоцитозом. Фагоцитоз - это многоступенчатый процесс, в котором выделяют хемотаксис (сближение фагоцита и объекта фагоцитоза), прилипание (адгезия) к объекту, активация участка мембраны фагоцита, погружение объекта и формирование фагосомы, слияние фагосом и лизосом и образование фаголнзосом, разрушение (переваривание) объекта, выброс из фагоцита продуктов деградации [Маянский А.Н., Пикуза О.И. 1993; Хаитов P.M., Пинсгпн Б.В., 1995; Ярилин А.А., 1999; Михайленко А.А. и соавт.,2005]. Нарушение каждого из этих этапов может стать одной из причин развития различных патологических процессов. Воспаление является первой линией иммунной защиты и реализуется клетками и гуморальными факторами, для которых стимулом их функциональной активности является само повреждение и компоненты патогена, не свойственные нормальным клеткам. В попытке уничтожения патогена и локализации процесса участвуют компоненты иммунной системы - цитокины. Однако главной действующей фигурой в этом процессе являются клетки-фагоциты (нейтрофилы и .макрофаги). Нейтрофилы периферической крови представляют по существу первую линию защиты организма в ране, так как являются наиболее активными и мобильными клетками. Максимальное нарастание их киллерской активности отмечается в течение первых 3 часов после нарушения целостности ткани [Олиферук Н.С. и соавт., 2005].
Реакция на раздражение, травму или инфекцию выражается в выходе в периферическую кровь не только зрелых нейтрофилов, но и молодых форм этих клеток. Мигрировавшие сквозь стенки сосудов нейтрофилы концентрируются в зоне повреждения и развивают здесь свою фагоцитарную деятельность [Zen К.. Parkos С, 1997; Chen Jing et al., 2000; Scheithauer M., Riechelmami H., 2003]. Они способны оказывать влияние на другие клетки крови, эндотелия и соединительной ткани [Долгушкин И.И. и соавт., 1998; Нестерова И.Еі., Колесникова П.В.,. 1999; Suzuki S. et al., 2002]. Нейтрофилы секретируют широкий спектр регуляторных и противовоспалительных цитокннов, посредством которых воздействуют на другие иммунокомпетентные клетки и регулируют иммунный ответ в целом [Потапнев М.П., 1995; Тугуз А.Р. и соавт., 2002; Швыдченко И.Н. и соавт., 2005; Bernabei P. et al., 1999; Hayashy F. et al., 2003]. На следующем этапе после повреждения тканей организма и процесс воспаления вступают макрофаги. Это клетки, обладающие высокой фагоцитарной активностью. Они захватывают антиген, подвергают его переработке. Макрофаги обладают способностью распознавать чужеродные вещества и с помощью ферментных систем расщепляют эти соединения. Так, частицы антигена, будучи фагоцитированными, подвергаются окончательным морфологическим и химическим превращениям Маянскип Д.Н., 1991; Хилова Ю.К., 1992; Nau G. et al., 2002]. Однако часть фагоцитированных антигенов не подвергается метаболической деградации и
Характеристика лекарственного препарата «Ронколейкин»
Эксперименты выполнены на нелинейных белых крысах-самцах (300 животных средней массой 180±20 г). Животные содержались в виварии, в металлических клетках с выдвижным дном, по 7-8 особей в каждой, в одинаковом световом и температурном режимах. Условия содержания животных и рацион питания соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российски Федерации» (Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. № 267), «Директиве Совета ЕС от 24 ноября 1986 г. о сближении Законов, постановлений и административных положений государств ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (86 / 609 / EEC)», а также согласно руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005). Эксперименты проводились в осенне-зимний период. Лекарственный препарат «Ронколейкин» был разработан медико-биотехнологической фирмой ООО «БИОТЕХ» совместно организованной с СПбНИИ вакцин и сывороток. Способ получения «Ронколейкина» был запатентован (дата приоритета 24.03.1992). В дальнейшем препарат прошел все необходимые стадии доклинических и клинических испытаний, был зарегистрирован в Российской Федерации и разрешён для медицинского применения и промышленного выпуска Приказом Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации № 249 от 31 августа 1995 г. «Ронколейкин» представляет собой современный отечественный биотехнологический продукт, аналог эндогенного цитокина - интерлейкина-2 человека (IL-2).
Препарат получают методами генной инженерии и биотехнологии из клеток продуцентов - рекомбинантного штамма непатогенных пекарских дрожжей вида Saccharomyces cervisiae, в генетический аппарат которых встроен ген человеческого интерлейкина-2. Активной субстанцией «Ронколейкина» является одноцепочечный полипептид из 133 аминокислот молекулярной массой 15,3±0,2 кДа. «Ронколейкин» представляет собой полный структурный аналог пептидного компонента IL-2 человека, и от эндогенного цитокина отличается только отсутствием полисахаридного фрагмента. Форма выпуска: ампулы, порошок лиофилизированный для приготовления раствора для инъекций. Доза в ампуле 0,5 мг (500000 ME). Серия №140705. Перед применением препарат разводится изотоническим раствором хлорида натрия для инъекций. По результатам контроля ГИСК им. Л. А. Тарасевича и паспортным данным, применяемый «Ронколейкин» отвечает требованиям ФПС № 42-0118-0283-00 от 19.04.2005 года. Фармакологическое действие - иммуномодулирующее. Восполняет дефицит эндогенного интерлейкина-2 и воспроизводит его эффекты. Взаимодействуя с рецепторами клеток, индуцирует рост, дифференцировку и пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, олигодендральных клеток, эпидермальных клеток Лангерганса. Вызывает образование лимфокинактивироваыных киллеров, активирует опухоль-инфильтрирующие клетки. Стимулирует цитолитическую активность натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов, повышает устойчивость клеток к программированной клеточной гибели - апоптозу. Обеспечивает иммунную защиту: антибактериальную, противовирусную, противогрибковую и противоопухолевую [«РЛС», 2008]. В наших экспериментах контролем служил изотонический раствор хлорида натрия для инъекций, который применялся в качестве растворителя «Ронколейкина». Препарат имеет паспорт №14 со следующими характеристиками:
Лиофилизированный порошок «Ронколейкин» разводили изотоническим раствором хлорида натрия для инъекций в соответствии с применяемыми объемами и концентрациями. Дозы и концентрации иммуномодулятора «Ронколейкина», используемые в опытах были выбраны на основании собственных предварительных исследований, рекомендаций специалистов фирмы ООО «БИОТЕХ», а так же из экспериментальных данных, взятых из отчетов по доклиническим испытаниям иммуномодулятора [Отчёт НИИ технологии и безопасности лекарственных средств по теме «Доклиническая оценка тератогенного действия интерлейкина», 1989; Отчёт ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН РФ по экспериментальному исследованию «Оценка активности ИЛ-2 в биотесте», 2001; Отчёт отдела НИИЦ (МБЗ) ГНИИИВМ МО РФ «Экспериментальное изучение безвредности препарата «Ронколейкин» на неполовозрелых животных», 2001]. Крысы, взятые в эксперимент, были разделены на 3 группы (по 100 животных в группе), с каждой из которых проводили по 3 серии опытов (рис.1). Животным первой группы (100 крыс) вещества наносили в виде аппликаций. Размер четырехслойного бинта, смоченного раствором и наложенного на рану, составлял 225 мм2, что соответствовало площади наносимого дефекта кожи. Животные 1-ой серии из первой группы служили контролем: у них проводилось наблюдение за спонтанным течением раневого процесса. На раневую поверхность этих крыс для создания идентичных условий опыта наносился 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций; крысам 2-ой серии применялись аппликации 1 мл (50000 ME) раствора иммуномодулятора «Ронколейкина»; 3-ей серии - 1 мл (25000 ME) раствора препарата. Начиная с первого послеоперационного дня, аппликация бинта, смоченного в 1 мл соответствующего раствора - «Ронколейкина» или изотонического раствора хлорида натрия для инъекций, на раны осуществлялась однократно с экспозицией в 15 минут, ежедневно в течение 5 дней.
Во второй группе животным производилось подкожное введение препарата «Ронколейкин» из расчета 20000 МЕ/кг при массе животного 180±20 г. Крысы 1-ой (контрольной) серии делились на 2 подгруппы, в каждой из которых производилось инъецирование различных объемов изотонического раствора хлорида натрия для инъекций (соответственно, по 0,5 или 1 мл). Животные 2-ой серии получали по 0,5 мл раствора «Ронколейкина» в дозе 20000 МЕ/кг; 3-ей серии - по 1 мл раствора препарата в дозе 20000 МЕ/кг. Введение «Ронколейкина» и изотонического раствора хлорида натрия для инъекций животным производилось подкожно в заднюю конечность на 1, 3 и 5 сутки с момента нанесения раны. В третьей группе экспериментов животным производилось подкожное введение «Ронколейкина» из расчета 20000 МЕ/кг в сочетании с местным нанесением препарата на область раны в виде аппликации в разведениях, описанных в первой группе опытов. Крысы 1-ой (контрольной) серии также делились на 2 подгруппы и получали изотонический раствор хлорида натриядля инъекций в виде аппликации на рану и подкожно по 0,5 и 1 мл. У животных 2-ой серии «Ронколейкин» применялся по 0,5 мл подкожно и по 1 мл в виде аппликации растворов на рану; в 3-ей серии - по 1 мл подкожно и по 1 мл в виде наложений на рану салфетки с раствором «Ронколейкина» (рис. 1). При оценке скорости и характера заживления ран у животных учитывались результаты визуального наблюдения, ежедневного измерения
Биометрическая оценка результатов исследования и статистическая обработка данных экспериментов з собственные исследования
Изучение особенностей ультраструктурной организации фибробластов проводилось в грануляционной ткани, биопсию которой у животных получали под эфирным наркозом через 5 и 10 дней после нанесения раны. Измельченные кусочки (0,5x0,5 см) ткани, взятые из средних слоев грануляций или на границе с неповрежденной кожей, фиксировались в 2,5% растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере рН=7,2-7,4 в холодильнике в течение 2 часов. После промывания фосфатным буфером осуществляли постфиксацию в 1% растворе тетраоксида осмия в течение 3 часов. Последующее обезвоживание материала проводилось в этиловых спиртах возрастающей концентрации (50,70, 96, 100) [Харитонова Е. А., 1997]. Пропитка и заливка материала производилась в эпон. Полимеризация осуществлялось в желатиновых капсулах в течение 2 суток в термостате при температуре +30С (сутки) и +60С (сутки). Ультратонкие срезы изготавливались на ультратоме УМТП-6 («SEO», г. Сумы) и наносились на палладированные сеточки без подложки. Контрастирование ультратонких срезов проводили насыщенным раствором уранилацетата на 70 этиловом спирте с помощью специального приспособления в течение 30 минут, после чего отмывали их в 0,01% растворе NaOH, а затем в дистиллированной воде в течение 3-х минут. Ультратонкие срезы изучались и фотографировались на пленку с помощью электронного микроскопа ЭВМ-100 («SEO», г. Сумы) при ускоряющем напряжении 75 киловольт. С целью объективной оценки морфофункциональных изменений в процессе заживления ран кожи нами использовались некоторые количественные критерии.
О ходе заживления дефектов судили по изменению площади открытой раневой поверхности. Для учета скорости заживления повреждений применялась методика Б.Д. Морозова и А.Р. Стригановой [Костюченок Б. М., Карлов В. А., 1990]. Площадь ран определялась ежедневно до полной эпителизации. Для этого контуры дефектов наносились на прозрачную бумагу, наложенную на область повреждения. Затем с помощью миллиметровой бумаги рассчитывалась площадь ран в мм . Цифровые показатели, отражающие динамику площадей, определяли путем сложения целых квадратных миллиметров и среднеарифметического их частей. Для изучения стадии экссудации в течение раневого процесса в мазках-отпечатках раневого отделяемого экспериментальных животных под иммерсионной системой микроскопа «Биолам - ЛОМО» в 10 полях зрения производился дифференцированный подсчет клеток каждого вида (нейтрофилы, макрофаги). Одновременно с помощью сетки окулярного микрометра измерялся диаметр их ядер. На гистологических препаратах определялась величина новообразованных структур заживающей раны: высота струпа, лейкоцитарного вала, толщина грануляционной ткани, пограничной зоны эпителия и протяженность эпителиального регенерата. Все количественные результаты экспериментов подвергались обработке по общепринятой в математической статистике методике в Microsoft Excel ХР (версия 7,0). Статистическая достоверность различий средних величин определялась по критерию Стьюдента, за достоверные принимали отличия при уровне вероятности р 0,001 [Лапач С. Н. и соавт., 2000; Хафизьянова Р. X. и соавт., 2006, Туровцев В.В., 2008]. Цитологическое исследование раневого экссудата широко применяется в экспериментальной практике и является необходимым дополнением к клиническим данным [Данилов, Р. К. и соавт., 1998; Олиферук, Н. С. и соавт., 2005; Полонская Н. Ю., Егорова О. В., 2005], Этот метод исследования считается достаточно простым с технической точки зрения, но одновременно дает важную информацию о различных клеточных популяциях. Динамическое наблюдение цитологической картины в области повреждения позволяет оценить скорость заживления и прогнозировать его течение, своевременно распознавать возникающие осложнения и корригировать лечение [Шапошников Ю. Г. и соавт., 1984; Кузин М. И., Костюченок Б. М., 1990]. Цитологический метод исследования раневого экссудата позволяет оценить в динамике состояние раны по составу и особенностям участвующих в репарационном гистогенезе клеток. В данном разделе обобщены собственные материалы по изучению цитологического состава раневого экссудата у животных, получавших иммуномодулятор «Ронколейкин» и изотонический раствор хлорида натрия для инъекций тремя разными способами (аппликации на рану, подкожное введение и сочетанное применение: аппликации на рану + подкожные инъекции веществ). Анализ мазков-отпечатков поверхности раны, полученных через 6, 12 и 24 часа после нанесения повреждения, позволил выявить существенные различия количественного и качественного состава цитограмм у животных экспериментальных серий всех опытных групп. В эксперименте находились крысы 1-ой подопытной группы (аппликации веществ на рану).
Анализ клеточного состава раневого экссудата в цитограммах при подкожном введении «Ронколейкина»
Подкожные инъекции препаратов (2 группа опытов) вызвали ряд качественных и количественных различий цитологической картины у животных сравниваемых серий. Изотонической раствор хлорида натрия для инъекций и растворы «Ронколейкина» (20000 МЕ/кг) вводились крысам трех серий в объеме 0,5 и 1 мл подкожно в заднюю конечность однократно на 1, 3 и 5 сутки после нанесения дефекта. Через 6 часов после альтерации у крыс 1 (контрольной) серии во 2 группе опытов, как и в предыдущем эксперименте, наблюдается типичная клеточная миграция из кровеносного русла в область повреждения. Нейтрофильные лейкоциты являются основными клеточными представителями в отделяемом ран (табл. 4). Они имеют нормальную структуру с хорошо сегментированным ядром. В цитоплазме нейтрофилов отмечается большое количество элементов бактериального происхождения, что свидетельствует об их повышенной фагоцитарной функции (рис. 10). Макрофаги не обнаруживаются. Через 12 часов после нанесения дефекта у животных этой же серии в мазках-отпечатках наблюдается значительное увеличение количества нейтрофилов (табл. 5) по сравнению с предыдущим сроком (327,0±27,0 против 241,0±22,0). Они являются доминирующими в цитограммах. Отмечается появление первых макрофагов. Качественное изменение клеточных популяций экссудата ран характеризуется нахождением некоторых нейтрофилов в состоянии типичной физиологической редукции. Единичные макрофаги имеют небольшие размеры, ядра неправильной формы, а пищеварительные вакуоли в их цитоплазме содержат слабоокрашенные непереваренные микроорганизмы (рис. 11). Через 24 часа после нанесения раны в цитограммах контрольных животных все еще преобладают нейтрофилы, а популяция макрофагов в этот срок изучения достигает своего максимального объема (табл.6). Большая часть нейтрофильных лейкоцитов находится на стадии физиологической редукции. Об этом процессе свидетельствует ряд структурных изменений: потеря четких контуров цитоплазмы, уменьшение числа сегментов ядра.
Строение макрофагов характеризуется наличием ядра бобовидной или неправильной формы и мелкоячеистой цитоплазмы (рис. 12). Клеточный состав раневого отделяемого у животных 2-ой и 3-ей серий, как и в предыдущем эксперименте, имеет ряд отличий от контрольной серии. Через 6 часов после нанесения дефекта для цитограмм животных этих серий характерно увеличение количества нейтрофилов (337,0±24,0 и 312,0±25,0 соответственно против 327,0±27,0 в 1-ой контрольной серии). Присутствие в цитоплазме этих клеток остатков переваренных элементов Нейтрофильные лейкоциты располагаются большими скоплениями, хорошо прокрашены и имеют нормальную структуру. Обращает на себя внимание появление в экссудате у крыс, получавших инъекции «Ронколейкина» зрелых макрофагов (табл. 4). Клетки характеризуются базофильной цитоплазмой с четко очерченными краями и крупным, овальным или бобовидным ядром (рис. 13,15). Основным признаком макрофагов является наличие в их цитоплазме пищеварительных вакуолей с остатками фагоцитированного материала. Через 12 часов цитограммы животных, которым подкожно вводили 0,5 мл либо 1 мл растворов «Ронколейкина» (20000 МЕ/кг), нейтрофилы находятся на различных стадиях физиологической редукции. Одновременно в экссудате сохраняются лейкоциты, имеющие нормальную структуру с сегментированным ядром. Численность нейтрофильной популяции значительно увеличена по сравнению с контрольной группой (386,0±22,0 и 379,0±28,0 против 327,0±27,0 в контрольной 1-ой серии). Для макрофагов характерно нарастание количества и размеров клеточных элементов (табл. 5).
Ядра этих клеток просветленные, округлой формы, а цитоплазма содержит большое количество пищеварительных вакуолей (рис. 14, 16). Через 24 часа в цитограммах животных, получавших 1 мл (20000 МЕ/кг) раствора «Ронколейкина», увеличивается количество дегенеративно измененных форм нейтрофилов. Количество макрофагов в цитограммах незначительно уменьшается по сравнению с другими сроками наблюдения (табл. 6). Однако их фагоцитарная активность остается высокой, о чем свидетельствует слияние вакуолей в цитоплазме, которая приобретает вид слабо окрашиваемого ажурного кружева (рис.17). У животных 2-ой серии после инъекций 0,5 мл (20000 МЕ/кг) раствора «Ронколейкина», получить отпечатки в данный срок исследования не удалось. На всей поверхности раны образовался тонкий струп. Статистически достоверных различий в проявлении стимулирующего эффекта после введения различных объемов «Рокнолейкина» не отмечается, но тенденция к более активной стимуляции воспалительной реакции выявляется после введения объема вещества 0,5 мл (20000 МЕ/кг) по сравнению с 3-ей серией, животным которой вводился подкожно 1 мл «Ронколейкина» (20000 МЕ/кг). В ходе исследования крысы 3 группы получали препараты в виде комбинации аппликационного нанесения и подкожного введения в соответствии с дозировками и сроками применения, описанными в главе 2. Через 6 часов после операции нейтрофильная популяция в экссудате животных контрольной сети при сочетанном способе введения препарата по своей структуре не имеет отличий от таких же популяций в тот же срок при аппликации на рану или подкожном введении изотонического раствора хлорида натрия для инъекций (табл. 7).
Макрофаги также не обнаруживаются (рис. 18). Через 12 часов после нанесения дефекта цитограммы крыс 1-ой серии характеризуются значительно увеличенным количеством клеточных элементов нейтрофильной популяции по сравнению с предыдущим сроком (342,0±23,7 против 243,0±26,1 через 6 часов после операции). Некоторые нейтрофильные лейкоциты превращаются в дегенеративно измененные формы с набухшим и фрагментированным ядром. Появляются первые макрофаги, которые характеризуются наличием крупного ядра неправильной формы, а в вакуолях цитоплазмы содержится огромное количество фагоцитированного материала (рис. 19). Через 24 часа после нанесения повреждения в цитограммах контрольных животных преобладающей клеточной фракцией все еще являются нейтрофилы (389,0±12,6), а популяция макрофагов в этот срок достигает своей максимальной численности. Набухание, гомогенизация, пикноз и фрагментация ядер свидетельствует о физиологической редукции части нейтрофильных лейкоцитов. Для макрофагов характерны ядра неправильной формы и мелкоячеистая цитоплазма. Некоторые вакуоли цитоплазмы все еще содержат непереваренные микробные остатки (рис. 20).
