Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. ГАМК и ишемическое поражение мозга 10
1.1.1. Участие системы ГАМК в регуляции мозгового кровообращения. 10
1.1.2. Влияние ишемического поражения мозга на систему ГАМК 20
1.1.2.1. Вещества, повышающие синтез и выделение ГАМК 27
1.1.2.2. Агонисты ГАМКд - рецепторов 28
1.1.2.3. Производные бензодиазепинов 29
1.1.2.4. Другие модуляторы ГАМКЛ рецептора 30
1.1.2.5. Производные ГАМК и цереброваскулярные расстройства 31
1.2. Афобазол — селективный анксиолитик с нейропротекторной активностью 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Методы исследования мозгового кровообращения 43
2.1.1. Метод лазерной допплеровской флоуметрии 43
2.1.2. Метод ультразвуковой флоуметрии 44
2.2. Моделирование глобальной преходящей ишемии головного мозга 46
2.3. Метод определения продуктов свободнорадикального окисления в ткани мозга 47
2.4. Метод определение активности катал азы 49
ГЛАВА 3. Цереброваскулярные эффекты афобазола, пикамилона и нимодипина
3.1.Афобазол 50
3.2. Пикамилон 58
3.3. Нимодипин 62
ГЛАВА 4. Влияние афобазола и пикамилона на состояние микроциркуляции в коре головного мозга крыс в условиях глобальной преходящей ишемии и выживаемость животных при перевязке сонных артерий
4.1.Афобазол 67
4.2. Пикамилон 72
ГЛАВА 5. Изучение гамк-ергических механизмов действия афобазола и пикамилона 77
5.1.Афобазол 77
5.2. Пикамилон 83
ГЛАВА 6. Влияние афобазола на процесс свободнорадикального окисления и активность каталазы в различных структурах мозга в условиях глобальной преходящей ишемии
Заключение 99
Выводы 110
Список литературы 111
- Влияние ишемического поражения мозга на систему ГАМК
- Афобазол — селективный анксиолитик с нейропротекторной активностью
- Моделирование глобальной преходящей ишемии головного мозга
- Метод определение активности катал азы
Введение к работе
Актуальность темы. Цереброваскулярные расстройства в большинстве развитых стран занимают одно из ведущих мест среди основных причин смертности и инвалидизации населения. В Российской Федерации регистрируется более 450 000 инсультов ежегодно, в мире более 6 млн. В стране по данным Национального регистра инсульта, заболеваемость инсультом в последние годы составляет 336 на 100000 населения в год и отмечается увеличение его распространенности среди людей трудоспособного возраста. Поэтому инсульт является проблемой чрезвычайной медицинской значимости. Согласно международным эпидемиологическим исследованиям, соотношение ишемического и геморрагического инсультов составляет 85% к 15% (Н.В.Верещагин и соавт. 2003; Е.И.Гусев и соавт. 2003; В.И.Скворцова 2004). Ишемический инсульт определяется выраженным и длительным снижением уровня мозгового кровотока. Область мозга с наиболее выраженным снижением кровотока (ниже 10 мл/100г/мин) повреждается в течение 6-8 минут и называется «ядерной» зоной инфаркта. Этот участок мозга окружен ишемизированной, но живой зоной «ишемической полутени» или «пенумбры», где в целом еще сохранен энергетический метаболизм и имеют место лишь функциональные, но не структурные изменения. Указанная область мозга и подлежит фармакологической коррекции, целью которой является восстановление кровоснабжения, метаболизма и функционального состояния поврежденной зоны.
Существенные успехи достигнуты в понимании патогенеза церебральной ишемии и выявлен сложный каскад нейрохимических процессов в центральной нервной системе. Ишемия головного мозга характеризуется значительным высвобождением глутамата и других возбуждающих нейромедиаторных аминокислот, которые играют
ключевую роль в развитии структурного поражения нервной ткани.
Выявлена взаимосвязь между нейротоксичностью глутамата и
транспортом ионов кальция в нервной ткани. Обнаружено нарушение
баланса между возбуждающими и тормозными процессами,
протекающими в центральной нервной системе в условиях
ишемического поражения мозга (A.R. Green et alt 2000; R.D. Schwartz-
Bloom, 2001; Н.Д. Сорокина и соавт,, 2002). При этом усиливается
влияние возбуждающих систем, которое вызвано значительным
высвобождением глутамата. Исследования, направленные на поиск
антагонистов глутаматных рецепторов, обладающих
нейропротекторной активностью, к сожалению, пока еще не увенчались успехом. Так, при клиническом изучении неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов МК-801 (дизоцилпина), который в эксперименте оказывал защитное влияние при ишемии мозга, обнаружились существенные побочные эффекты.
Однако, необходимо отметить, что на протяжении многих лет в нашей стране, а в последние годы и за рубежом, успешно разрабатывается другое направление фармакотерапии ишемических поражений мозга, которое связано со стимуляцией системы ГАМК в стенке мозговых сосудов и в ЦНС и восстановления нарушенного ишемией баланса между возбуждающими и тормозными процессами. Так, была выявлена способность ГАМК понижать тонус сосудов мозга и обнаружены в сосудах мозга ГАМКА - рецепторы, а также ферменты, синтезирующие и метаболизирующие ГАМК (С.А. Мирзоян и В.П. Акопян, 1967; С.А. Мирзоян и соавт., 1970, 1974; D.N. Krause, 1980). Созданный в соответствии с этим в лаборатории фармакологии цереброваскулярных расстройств нашего Института ГАМК-ергический препарат - пикамилон в настоящее время успешно применяется при
цереброваскулярных расстройствах в неврологической практике. (Р.С. Мирзоян, Т.С. Ганьшина, 1989; Р,С. Мирзоян, 1995),
На протяжении последних лет в ГУ НИИ фармакологии им.
В.В.Закусова РАМН разрабатывается оригинальный селективный
анксиолитик афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этил-
тио]бензимидазола дигидрохлорид), обладающий мембранотропной активностью (СБ. Середенин, А.Д. Дурнев, 1992). Согласно данным М.Г. Баласанян (2003) афобазол в условиях локального ишемического поражения, вызванного перевязкой средней мозговой артерии, обладает нейропротекторным эффектом. Он ограничивает зону ишемического поражения и способствует нормализации патоморфологических изменений мозговой ткани. Защитный эффект афобазола был показан также и на культуре нейронов гиппокампа в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода, и глутаматной токсичности (Т.А. Zenina et al., 2005).
Таким образом, полученные в опытах in vivo и in vitro данные убедительно свидетельствуют о наличии у афобазола нейропротекторных свойств. Однако, многие стороны механизма нейропротекторного действия препарата продолжают оставаться невыясненными. В частности, неизвестно какую роль при этом играет мозговое кровообращение, тогда как цереброваскулярный компонент играет существенную роль в нейропротекции. Следует провести анализ нейромедиаторного механизма действия афобазола. Важно также исследовать влияние афобазола на устойчивость мембранных структур коры и стриатума к свободнорадикальным процессам и на активность фермента антиоксидантной защиты — катал азу в условиях глобальной преходящей ишемии головного мозга.
Цель исследования. Провести анализ цереброваскулярных, иейропротекторных и нейромедиаторных эффектов селективного анксиолитика афобазола.
Задачи исследования.
Изучение влияния афобазола и препаратов сравнения -пикамилона и нимодипина на регионарный мозговой кровоток и состояние микроциркуляции в коре головного мозга.
Исследование цереброваскулярных эффектов афобазола и пикамилона в условиях глобальной преходящей ишемии головного мозга.
Определение выживаемости животных под влиянием афобазола в условиях ишемии, вызванной перевязкой общих сонных артерий.
Изучение ГАМК-ергического механизма цереброваскулярного действия афобазола.
Изучение ГАМК-ергического механизма цереброваскулярного эффекта пикамилона.
Исследование влияния афобазола на устойчивость мембранных структур коры и стриатума к свободнорадикальным процессам при глобальной преходящей ишемии.
Изучение влияния афобазола на активность катал азы - фермента антиоксидантной защиты в условиях глобальной преходящей ишемии головного мозга.
Научная новизна работы. Впервые проведено изучение влияния селективного анксиолитика афобазола на регионарное мозговое кровообращение и состояние микроциркуляции в коре головного мозга у интактных и ишемизированных животных. Выявлена способность афобазола в значительно большей степени, чем у интактных крыс
усиливать кровоснабжение мозга в условиях глобальной преходящей ишемии головного мозга. Показано, что афобазол повышает выживаемость животных в условиях ишемии, вызванной перевязкой общих сонных артерий. Вместе с тем, препарат сравнения пикамилон увеличивает кровообращение интактного и ишемизированного мозга в одинаковой степени.
Установлен ГАМК-ергический механизм цереброваскулярного эффекта афобазол а. Б локаторы ГАМК-рецепторов — бикукуллин и пикротоксин устраняют или значительно ослабляют влияние афобазола на мозговое кровообращение. Иная картина отмечена при изучении пикамилона, который проявляет цереброваскулярную активность на фоне действия бикукуллина и не оказывает сосудорасширяющего эффекта после введения пикротоксин а.
Новыми являются данные о способности афобазола повышать устойчивость мембранных структур коры и стриатума к свободнорадикальным процессам в условиях глобальной преходящей ишемии головного мозга. В этих условиях афобазол увеличивает в коре активность фермента антиоксидантной защиты - каталазы и снижает накопление продуктов свободнорад и кального окисления.
Научно-практическая значимость работы* Выявленная в диссертационной работе способность афобазола усиливать кровоснабжение ишемизированного мозга и повышать выживаемость животных в условиях ишемии, вызванной перевязкой общих сонных артерий, указывает на выраженную цереброваскулярную и нейропротекторную активность препарата.
Обнаруженные в исследовании цереброваскулярные и нейропротекторные эффекты афобазола свидетельствуют о целесообразности рекомендовать клиническое изучение препарата в
качестве средства для лечения больных с ишемическими поражениями головного мозга.
Влияние ишемического поражения мозга на систему ГАМК
Одним из важнейших этапов развития ишемического повреждения мозговой ткани является активация глутамат-кальциевого каскада, проявляющаяся накоплением внутриклеточного кальция и избыточным выбросом возбуждающих аминокислот (глутамата и аспартата) (D. W. Choi 1994, 1995, P. Lipton, 1999). Ведущая роль в этом процессе принадлежит чрезмерной стимуляции глутаматом его ионотропных NMDA - рецепторов (Ы-метил-О-аспартата) и АМРА - рецепторов (alpha-amіno-3-hydroxy-5-methyl-4-іsoxalepropionate), названиe которых обусловлено химической структурой агонистов, это способствует накоплению в клетках ионов Са+2 и Na+ , которые активируют клеточные процессы, приводящие к гибели клетки.
Имеется доказательство того, что ГАМК оказывает ингибирующее действие на глутаматергическую передачу нервных импульсов (E.D. Kanter, 1996). На срезе коры мозга крыс при введении ГАМК была обнаружена блокада NMDA — стимулированного поступления кальция в клетку (N. Riveros, F. Orrego, 1999). ГАМК - позитивные вещества -пентобарбитон и клометиазол - ингибируют судороги, вызванные NMDA (AJ. Cross et al., 1993). S. Ohkuma и соавторами (1994) было обнаружено, что агонист ГАМК-рецептора мусцимол ингибирует глутаматергическую нейротоксичность и этот эффект устраняется бикукуллином.
Многочисленные исследования указывают на то, что во время ишемического поражения наблюдается значительное увеличение внеклеточной концентрации ГАМК в ткани мозга. Это продемонстрировано с использованием микродиализной техники на моделях локальной ишемии мозга, вызванной перевязкой средней мозговой артерии (Н. Harberg at al., 1985), фототромбозом у крыс (Н.А. Baldwin et al., 1994) , и у песчанок на модели глобальной ишемии (А. Shuaib et al., 1994, Т. Mainprize et al., 1995). J. W. Phillis и коллеги (1994) показали увеличение внеклеточного уровня ГАМК на модели временной окклюзии средней мозговой артерии и на модели глобальной ишемии у крыс. На срезах стриатума мозга крыс R.L. Buyukuysal (2004) выявил увеличение содержания ГАМК и глутамата. Аналогичные изменения были обнаружены в ишемизированном участке мозга человека (R. Kanthan et al., 1995). Однако, увеличение внеклеточного содержания ГАМК в ишемизированнои ткани не всегда сопровождается увеличением синтеза ГАМК. A.R. Green (1992) показал, что через 5 минут после постоянной окклюзии у мышей уровень синтеза ГАМК на стороне окклюзии составил 30 % от ее уровня в контралатеральном полушарии. Через 4 часа было выявлено восстановление уровня синтеза ГАМК. A.R. Green (1987) обнаружил, что после кратковременных судорог возникает увеличение внеклеточной ГАМК в мозге крысы, а через 2 часа снижается уровень синтеза ГАМК. Более того, на срезах мозговой ткани, взятых у этих крыс, показано значительное угнетение выделения эндогенного ГАМК, вызванного ионами калия. Таким образом, вслед за первоначальным увеличением концентрации ГАМК, вызванным поражением мозга, следует ингибирование ее синтеза и выделения. A.W. Brown (1979) показал, что при ишемическом поражении происходит каскад реакций, подобный тому, который возникает при судорогах, т.е. ишемия мозга приводит к увеличению внеклеточной концентрации ГАМК с сопуствующим торможением ее синтеза и выделения. Полагают, что во время интенсивного нейронального возбуждения происходит выделение ГАМК, необходимое для уменьшения эффекта внеклеточного глутамата. Однако, высказываются предположения, что это происходит при кратковременных нарушениях, например, при эпилептическом приступе, а при ишемическом поражении ситуация иная, так как нарушается синтез ГАМК. Имеются электрофизиологические доказательства, согласно которым угенетение функции ГАМК-ергической системы возникает в условиях повышенной функции глутаматергической системы. Вероятно, это происходит Са -зависимым путем (A. Marty, I. Llano, 1995).
Большой интерес представляет состояние ГАМКд-рецепторов при ишемическом поражении. В условиях ишемии способность лиганда связываться с рецептором претерпевает существенные изменения. Так, в начальный период ишемии концентрация ГАМК возрастает и высокое содержание агониста обычно ведет к снижению чувствительности рецептора по механизму отрицательной обратной связи (F. Galeffi et al., 2000; R.D. Schwartz-Bloom, R. Sah, 2001). Снижение чувствительности ГАМКд-рецепторов было обнаружено у песчанок в гиппокампе, в коре головного мозга в течение 30 минут после преходящей ишемии мозга (В. Alicke, R.D. Schwarth-Bloom, 1995). В то же время снижается синтез ГАМК. Н. Li (1993) показал, что после транзиторной глобальной ишемии у песчанок в течение 30 минут после реперфузии уменьшается экспрессия матричной РНК (мРНК) й и р2 субъединиц ГАМКА -рецепторов в гиппокампе в СА1, САЗ областях и зубчатой извилине. В области САЗ и зубчатой извилине (менее чувствительных к ишемии) экспрессия мРНК этих субъединиц нормализуется в течение 4 часов, а в нейронах СА1 области не восстанавливается и продолжает снижаться. На моделях in vivo и in vitro показаны также длительные изменения функции ГАМКд — рецепторов в участках, наиболее чувствительных к ишемии. Связывание меченого блокатора ГАМК - зависимых хлорных aте каналов [ S]TBPS с ГАМКд - рецепторами области СА1 гиппокампа и стриатума понижено в течение нескольких дней после транзиторной глобальной ишемии у песчанок и у крыс (В.Е. Mileson et al 1992; R.D. Schwarts et al, 1994, 1995).
Афобазол — селективный анксиолитик с нейропротекторной активностью
Производные бензодиазепинов широко используются в клинической практике в качестве анксиолитиков, антиконвульсантов, седативных и снотворных средств (Ю.А. Александровский, 1973). Однако, эти препараты обладают рядом нежелательных побочных эффектов, которые ограничивают их применение. (Ю.И. Вихляев, 1966; А.В. Вальдман и соавт., 1982). В частности, это касается миорелаксантного и гипноседативного эффектов. Кроме того, в больших дозах бензодиазепины могут вызывать амнезию. Важной проблемой при использовании указанной группы средств является опасность развития синдрома отмены, а также психологической и физической зависимости. Учитывая существенные особенности в действии транквилизаторов у различных экспериментальных животных и у пациентов, представляется важным изучение зависимости эффекта препаратов от наследственно контролируемого типа эмоционально-стрессовой реакции и, следовательно, от генетических основ индивидуальной чувствительности (А.В. Вальдман и соавт., 1979, 1987; С.Б Середенин и соавт., 1979, 1982, 1989). Индивидуальные различия в действии транквилизаторов заключаются в том, что у животных с выраженной реакцией страха (с пассивными формами поведения) и у людей с астеническими чертами при эмоционально-стрессовой ситуации эти препараты проявляют анксиолитический и транквило-активирующий эффекты, а у устойчивых к эмоционально-стрессовому воздействию животных и людей - седативный эффект. Так, преимущественно седативное действие феназепама было обнаружено у активных в стрессовых условиях животных (крыс MNRA и мышей линии С57В1/6) и активирующее, анксиолитическое действие у пассивных животных (крыс MR и мышей линии BALB/c). У беспородных высокоактивных «в открытом поле» животных препарат вызывал седативный эффект, а у низкоактивных - активирующий (СБ. Середенин и соавт., 1998). В зависимости от фенотипа животного выявлены наследственные различия биохимических показателей эмоционально-стрессовой реакции, таких как содержание АКТГ, кортикостерона, циклических нуклеотидов, продуктов перекисного окисления липидов (Б.А. Бадыштов и соавт., 1988; СБ. Середенин и соавт., 1982, 1985, 1989,1998; И.С Морозов, 1992). В условиях стресса обнаружены межлинейные выраженные различия в связывании Н диазепама мембранами ткани мозга животных (Середенин и соавт., 1998). Так, у мышей линии BALB/c, в отличие от С57В1/6, отмечается выраженное снижение связывания Н-диазепама, что свидетельствует об уменьшении рецепторнои способности ГАМК-бензодиазепинового комплекса и, следовательно, к аксиогенной направленности эффекта. Таким образом, стресс вызывает изменения физико-химических свойств мембран, изменяющих активность рецептора, и снижающих чувствительность мембран к эндогенным регуляторам рецепции ГАМК. Это, возможно, обусловлено увеличением при стрессе продуктов перекисного окисления липидов в мозговой ткани (Т.А. Воронина и соавт., 1990; Ю.А. Александровский, 1991). Поэтому одним из возможных путей восстановления нарушенной функции ГАМК-бензодиазепинового комплекса является воздействие на мембранные процессы, определяющие изменения рецепторного участка.
На основании этих данных в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН был синтезирован и изучен ряд производных 2-меркаптобензимедазола, обладающих мембранотропной активностью. У соединений этой группы была обнаружена антиоксидантная активность: наличие антирадикальных свойств в бесклеточной системе генерации активных форм кислорода и при индукции их образования перитонеальными макрофагами (СБ. Середенин, А.Д. Дурнев, 1992). Было отобрано наиболее активное соединение СМ-346 — 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этил-тио]бензимидазола дигидрохлорид, получившее в дальнейшем название афобазол (рис 2).
Анксиолитическое действие афобазола было изучено на животных с различными типами поведения (крысах MNRA, MR и мышах BALB/c, С57В1/6), а также на беспородных крысах, разделенных на 3 группы в зависимости от их устойчивости к стрессу. Для этой цели использовался комплекс методических приемов - наказуемое поведение а тесте конфликтная ситуация, «крестообразный лабиринт» и «открытое поле». В результате проведенных исследований была выявлена зависимость действия афобазола от фенотипа экспериментальных животных. Показано, что при изучении поведенческих реакций у мышей BALB/c афобазол вызывал активирующий анксиолитический эффект. В то же время препарат не оказывал седативного действия у мышей С57В1/6. Анксиолитическое действие афобазола начинает проявляться через 15-20 минут после внутрибрюшинного введения препарата и достигает максимума через 40-60 минут, а через 120-150 минут эффект препарата уменьшается. По силе анксиолитического действия афобазол несколько уступает диазепаму и феназепаму. Однако, в диапазоне анксиолитических доз у препарата не были выявлены гипноседативные, миорелаксирующие и амнестические эффекты.
В опытах с использованием теста «открытое поле» афобазол, введенный за 30 минут до эксперимента в дозе 1 мг/кг мышам линии BALB/c, предотвращает снижение бензодиазепиновой рецепции, восстанавливая чувствительность мембран к ГАМК и ионам СГ. Полученные данные указывают на способность афобазола защищать ГАМК рецепторный комплекс в условиях эмоционально-стрессовой реакции. Авторы полагают, что данный эффект препарата связан с его антирадикальными свойствами. Действительно, на перитонеальных макрофагах афобазол, как и другие производные 2-меркаптобензомедазола инактивирует свободные радикалы. Установлено, что афобазол в концентрациях от 10 до 10 обладает выраженной ингибирующей активностью на продукцию липоперекисных радикалов, генерируемых в бесклеточной системе пероксидазы хрена (СБ. Середенин, 1998).
Моделирование глобальной преходящей ишемии головного мозга
Мы использовали метод ультразвуковой флоуметрии для оценки изменений регионального мозгового кровотока (МК) у крыс и кошек. Приток крови в мозг регистрировали у кошек в системе сонных артерий и крыс во внутренней сонной артерии с помощью ультразвукового флоуметра ТІ 06 фирмы "Transonic Systems 1пс."(США), Датчик устанавливался на общей сонной артерии животных: у крыс после перевязки ее наружной ветви, а у кошек перевязывали все артерии, питающие экстракраниальные ткани, а именно, каудальную и краниальную артерии, мышечные ветви, затылочную, язычную, наружную челюстную, большую ушную, поверхностную височную и нижнюю зубную артерии. Для регистрации артериального давления и введения препарата бедренные вена и артерия отпрепарировались и канюл провались силиконовыми катетерами. Катетер вводился в бедренную артерию до уровня наружной подвздошной артерии. Регистрацию уровня артериального давления проводили электроманометром «BPR-01 Experimetria» (Венгрия).
Данные обрабатывали методом вариационной статистики с помощью t-критерия Стьюдента. Для изучения влияния препарата на микроциркуляцию головного мозга в условиях ишемии нами была выбрана модель глобальной преходящей ишемии головного мозга. Опыты проводились на белых беспородных крысах массой 250-300 г под общей анестезией (хлоралгидрат 400 мг/кг внутрибрюшинно). В течение всего опыта проводили регистрацию локального мозгового кровотока с помощью лазерного допплеровского флоуметра с одновременной регистрацией артериального давления в бедренной артерии. Ишемию у крыс вызывали окклюзией с помощью зажимов обеих общих сонных артерий в течение 10-15 минут. Для нарушения кровоснабжения жизненно важных центров, расположенных в стволовой области мозга мы одновременно методом кровопускания снижали уровень артериального давления до 40-50 мм рт. ст. Спустя 10-15 минут удаляли зажимы и кровь реинфузировали.
Препараты вводили через 40-45 минут после глобальной преходящей ишемии мозга. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с помощью t-критерия Стьюдента.
В литературе в последние годы появляется много данных о том, что широко используемая характеристика состояния мембранных структур клетки по исходному уровню продуктов свободнорадикального окисления часто не отражает истинную картину патологических изменений. В ряде исследований показано, что начальный уровень продуктов свободнорадикального окисления может изменяться очень незначительно даже при острых воздействиях на организм (стресс, ишемия, температурный шок и другие) или может быть ниже, чем в контроле (М. Janssen et al,, 1993; P. Cogrel et al., 1993, F. Sabeh et al., 1995). Наиболее показательным в такой ситуации является изучение скорости накопления продуктов свободнорадикального окисления при его индукции in vitro аскорбиновой кислотой и другими окислителями (Сазонтова Т.Г., 1998). Этот параметр отражает чувствительность ткани к свободнорадикальным процессам в заданных условиях состояния организма. Обнаружена тесная положительная корреляция между степенью повреждения ткани и скоростью индуцибильного накопления продуктов свободнорадикального окисления. По начальному уровню трудно сказать о лабильности и стабильности ткани, что можно выявить лишь после индукции окисления in vitro. Можно предположить, что даже слабая активация свободнорадикального окисления in vivo, которую не всегда можно зарегистрировать имеющимися в наличии методами, приводит к повышению чувствительности ткани к этому процессу, что можно определить по скорости накопления продуктов свободнорадикального окисления с помощью его индукторов in vitro. Любая активация свободнорадикального процесса в ткани при патологии (ишемия, стресс) будет значительно более опасной, чем в норме из-за повышенной чувствительности ткани к нему. Скорость индукции окисления в гомогенате является наиболее важным подходом при оценке состояния прооксидантной и антиоксидантной систем ткани. Подготовка образцов для биохимических исследований.
У белых беспородных крыс под общей анестезией (хлоралгидрат, 400 мг/кг внутрибрюшинно) выделяли кору головного мозга и стриатум. Выделенные ткани замораживали и хранили в жидком азоте. Замороженные образцы измельчали в гомогенизаторе тефлон-стекло в пяти объемах буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4 при 4 С) и 100 мМ NaCl. Гомогенаты фильтровали через 6 слоев марли.
Резистентность различных отделов головного мозга к свободнорадикальному окислению определяли in vitro, индуцируя окисление добавлением в гомогенаты мозга аскорбиновой кислоты (0,2мМ). Далее их инкубировали при 37С с постоянным перемешиванием в среде, содержащей 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 100 мМ NaCl, в течение 60 минут. Отбор проб проводили сразу после добавления 2-тиобарбитуровой кислоты и после 30 и 60 минут инкубации.
Концентрацию продуктов индуцированного окисления оценивали по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) спектрофотометрическим способом (Н. Okhawa et aL, 1979) в модификации (К. Kikugawa, 1992). Реакцию проводили, добавляя к 1,5 мл ТБК-реагента (0,4 % ТБК, 0,54% SDS и 10% уксусную кислоту (рН 3,5)) 0,2 мл инкубационной смеси и 0,3 мл воды. Для развития окраски пробы выдерживали в термостате при 98С в течение 1 часа. Концентрацию малонового диальдегида (вторичного продукта перекисного окисления липидов) и других веществ, реагирующих с ТБК определяли по спектру поглощения при длине волны 532 нм и выражали в единицах оптической плотности на мг белка.
Метод определение активности катал азы
Таким образом, цереброваскулярный эффект афобазола на фоне действия бикукуллина или пикротоксина существенно ослабляется, что свидетельствует о важной роли системы ГАМК в реализации действия препарата. По-видимому, выявленный нами механизм действия афобазола лежит в основе и его нейропротекторной активности. Полученные данные о способности бикукуллина и пикротоксина устранять или существенно ослаблять цереброваскулярное действие афобазола согласуются с результатами опытов ex vivo, указывающих на то, что афобазол предотвращает снижение ГАМК-бензодиазепиновой рецепции у животных с выраженной реакцией страха. (С.Б.Середенин и соавт. 1998) Иная картина наблюдается при изучении ГАМК ергического компонента в механизме действия пикамилона. Цереброваскулярный эффект пикамилона не претерпевает существенных изменений в условиях блокады ГАМК-рецепторов бикукуллином. Вместе с тем, на фоне действия пикротоксина имеет место блокада или значительное снижение цереброваскулярной активности пикамилона. Следовательно, в реализации цереброваскулярного эффекта пикамилона важную роль играет его влияние на проводимость хлорного канала ГАМКА- рецептора (рис.17). Одним из наиболее важных звеньев в развитии ишемического повреждения ткани мозга является окислительный стресс. Как известно, головной мозг является высокочувствительным к свободнорадикальному окислению органом, вследствие того, что его мембранные структуры богаты пол и не насыщенным и жирными кислотами. Они являются прямой мишенью для свободиорадикального повреждения и в тоже время в мозге в сравнении с другими органами и тканями активность антиоксидантний системы ниже. В норме антиоксидантная система уравновешивает действие прооксидантнои, в условиях же ишемического повреждения равновесие этих систем нарушается и смещается в сторону увеличения функции последней. Наблюдается накопление окисленных липидов (гидропероксиды жирных кислот, малоновый диальдегид и другие), и белков (содержащих S- S- связи, карбонилы и другие модифицированные группы), а также фрагментов окисленных нуклеотидов, что в конечном итоге приводит к гибели клетки. Так, согласно данным S. Islekel и соавт. (1999) в условиях модели ишемии с 10 минутной окклюзией сонных артерий имело место увеличение активности каталазы, тогда как активность другого фермента антиоксидантной системы — супероксидисмутазы уменьшалась. Выявлены различия в чувствительности различных структур головного мозга к ишемическому поражению. Наиболее чувствительными оказались стриатум и гиппокамп. В этих зонах исходный уровень ТБК-активных продуктов (продуктов, вступающих в реакцию с тиобарбитуровой кислотой) выше, чем в коре головного мозга, что делает более чувствительными эти структуры к оксидативному стрессу в условиях патологии. (R. Delanche et al., 1999). На модели окклюзии четырех артерий в течение 5 минут было показано, что уровень ТБК-активных продуктов достоверно (на 82%) повышается только в стриатуме (F. Ваге, 2004).
На различных моделях ишемии в стриатуме и гиппокампе, в отличие от коры мозга, обнаружено значительное снижение активности антиоксидантах ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы) (P. Calabresi et ah, 2002; Н. М. Ноті, 2002; S. Bare et ah, 2004). Через 3 часа после глобальной преходящей ишемии (15 минут окклюзии сонных артерий) активность каталазы снижается в стриатуме и гиппокампе (Н.М Ноті, 2002).
Согласно данным А.К.Жанатаева и соавт. (2001) у селективного анксиолитика афобазола выявлены антимутагенные свойства. Авторы на основании полученных данных высказывают предположение о том, что афобазол снижает мутагенные эффекты химических прооксидантов за счет нормализации процессов свободно-радикального окисления. Кроме того, Т.А. ЗениноЙ и соавт. (2005) в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода и воздействием глутамата, был показан защитный эффект афобазола на культуре нейронов гиппокампа.
В соответствии с вышеизложенным, а также на основании полученных нами данных о выраженной цереброваскулярной и нейропротекторной активности афобазола, представляло большой интерес изучить его влияние на состояние свободиорадикального окисления и активность антиоксидантного фермента — каталазы в коре головного мозга и стриатуме в условиях глобальной преходящей ишемии. Исследования проводились совместно с сотрудницей лаборатории фармакогененетики к.б.н. ТЛА. Зениной.
Для оценки накопления продуктов свободнорадикального окисления и активности каталазы животных разделили на 3 группы: 1) контроль - «ложнооперированные» крысы; 2) крысы, перенесшие глобальную преходящую ишемию; 3) животные, которым через 30 минут после ишемии вводили афобазол (5 мг/кг, внутривенно).
У крыс, перенесших ишемию головного мозга, в коре через 30 и 60 минут после индукции свободноради кального окисления наблюдалось статистически значимое увеличение концентрации продуктов окисления в 1,8 раза и в 1,4 раза соответственно по сравнению с контрольными животными (табл. 20, рис Л 8). У животных, которым через 30 минут после ишемии вводили афобазол, наблюдалась тенденция к снижению скорости накопления продуктов свободнорадикального окисления. Полученные данные свидетельствуют о том, что ишемия повышает чувствительность ткани коры головного мозга к свободнорадикальным процессам, что соответствует данным, имеющимся в литературе (М. Gupta, Р.К. Singal, 1989; Т.Г. Сазонтова, 1998). Следовательно, афобазол, введенный после ишемии, снижает ее повреждающее действие на мембраны нейронов головного мозга.
Похожие диссертации на Анализ цереброваскулярных и нейропротекторных эффектов афобазола
