Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Оценка взаимозаменяемости воспроизведенных лекарственных средств. 11
1.1.1. Оценка качества, эффективности и безопасности. 12
1.1.2. Взаимозаменяемость воспроизведенных ЛС. Виды эквивалентности воспроизведенных ЛС. 14
1.2. Оценка эквивалентности in vitro, биофармацевтическая растворимость субстанций и тест сравнительной кинетики растворения лекарственных форм. 21
1.2.1. Теоретические основы – биофармацевтическая классификационная система (БКС). 25
1.3. Выбор объектов исследования и их клиническое значение . 33
Выводы по главе. 37
Экпериментальная часть 38
ГЛАВА 2. Определение растворимости субстанций темозоломида, иматиниба и капецитабина 38
2.1. Материалы и методы. 38
2.1.1. Объекты исследования. 38
2.1.2. Оборудование. 38
2.1.3. Реактивы 39
2.1.4. Субстанции 39
2.1.5. Нормативная документация 39
2.1.6. Среды растворения. 40
2.1.7. Растворы стандартов. 41
2.1.8. Обработка результатов изучения биофармацевтической растворимости субстанций 48
2.2. Изучение растворимости субстанции темозоломида 49
2.3. Изучение растворимости субстанции иматиниба 52
2.4. Изучение растворимости субстанции капецитабина 54
Выводы по главе. 57
ГЛАВА 3. Изучение высвобождения темозоломида, иматиниба и капецитабина из твердых дозированных лекарственных форм в условиях in vitro (тест сравнительной кинетики растворения). 58
3.1. Материалы и методы 58
3.1.1. Объекты исследования 58
3.1.2. Нормативная документация 62
3.1.3. Среды растворения. 62
3.1.4. Растворы стандартов. 63
3.1.5. Обработка результатов изучения теста сравнительной кинетики растворения 68
3.2. Изучение высвобождения темозоломида из капсул в условиях in vitro . 69
3.3. Изучение высвобождения иматиниба из капсул в условиях in vitro. 74
3.4. Изучение высвобождения капецитабина из таблеток в условиях in vitro. 78
Выводы по главе. 81
Общие выводы. 82
Литература. 84
- Взаимозаменяемость воспроизведенных ЛС. Виды эквивалентности воспроизведенных ЛС.
- Выбор объектов исследования и их клиническое значение
- Обработка результатов изучения биофармацевтической растворимости субстанций
- Изучение высвобождения темозоломида из капсул в условиях in vitro
Взаимозаменяемость воспроизведенных ЛС. Виды эквивалентности воспроизведенных ЛС.
Воспроизведенные лекарственные средства имеют равнозначные широ-коупотребимые синонимы – "генерики", "дженерики", "генерические лекарственные средства", "многоисточниковые (мультиисточниковые) лекарственные средства", однако согласно Федеральну Закону № 61-ФЗ именно термин "воспроизведенные лекарственные средства" необходимо применять в первую очередь. В то же время, согласно Всемирной Организации Здравоохранения, основным понятием таких лекарственных средств является термин "многоисточниковые лекарственные средства" (multisource drugs) [35]. "Мно-гоисточниковые" лекарственные средства включают в себя субстанции разных источников и фирм. На современном фармацевтическом рынке большинство ЛП являются воспроизведенными (генерическими), что отвечает требованиям при соблюдении условий: ЛФ такая же как препарат сравнения, качественный и количественный состав активных субстанций совпадает с оригинальным препаратом. Их биоэквивалентность подтверждается соответствующими исследованиями биодоступности. Изучение данных розничного аудита фармрынка РФ показало, что количество таких ЛС (дженериков) составляет не менее 80%. Обеспечение эффективности и безопасности воспроизведенных препаратов и соответствие их высоким требованиям нормативной документации является важной задачей при разработке лекарственных средств [15,32,34].
Генерики, как и препараты сравнения (оригинальные препараты), должны отвечать общим требованиям, установленным в Общем (или едином) техническом документе [68,69,70,71]: эффективность, безопасность, качество[1].
Фармацевтической проблемой является качество, в то время как эффективность и безопасность можно отнести к вопросам медико-биологическим. Следует принять во внимание тот факт, что в дальнейшей судьбе обращения лекарственного препарата фармацевтическая характеристика играет основную роль, ввиду того, что проведение доклинических и клинических исследований практически не представляется возможным после их регистрации, так как такие исследования проводятся долго и трудоемко, что превышает затраты на их проведение по отношению к полученному результату. Поэтому без видимой необходимости клинические исследования не повторяются [1].
Оценка качества производится на основании фармакопейных методик, описанных в соответствующей нормативной документации (НД). Основные параметры, прежде всего, направлены на установление подлинности и количественного определения лекарственного препарата, а также его чистоты. Некоторые методики, описанные в НД, могут включать отдельные специфические, характерные параметры для конкретной лекарственной формы, такие как средняя масса таблеток и однородность дозирования [68-69].
В России и для зарубежных, и для отечественных ЛП, в настоящее время, на каждый воспроизведенный препарат имеется отдельная нормативная документация [8,10]. В ряде случаев производитель может, при отсутствии единых (одинаковых или сопоставимых) требований, вводить в НД на производимый препарат нормы, отражающиеся на качестве препарата, даже основываясь на ОФС, зарубежные фармакопеи и НД других производителей. Именно поэтому необходимо вводить единые стандарты качества - фармакопейные статьи (ФС) на генерики, чтобы уровень качества данных препаратов не уступали таковым инновационных препаратов и соответствовал ФС [1,4,33].
Основным видом медико-биологического контроля дженериков является оценка их биоэквивалентности. Заключение о качестве исследуемых лекарственных препаратов такие исследования позволяют сделать в более сжатые сроки, чем при клинических исследованиях, по относительно меньшему объему первичной информации [15,85,87].
Известны альтернативные методы исследования дженериков, основанные на их биофармацевтических свойствах. В ряде европейских стран данный метод широко применяется для препаратов преимущественно 1-ого и 3-его класса БКС. Биофармацевтические свойства оцениваются параметрами: 1. Растворимости и проницаемости субстанции ЛС. На основании резуль татов растворимости препарат классифицируют по группам БКС. 2. ТСКР (тест сравнительной кинетики растворения) лекарственной формы, позволяет оценить качество самой лекарственной формы и прогнозировать его поведение в организме человека. Условия проведения ТСКР максимально приближены к условиям ЖКТ [31]. Преимущества данного подхода заключается в отсутствии необходимости вовлечения здоровых добровольцев или пациентов, что может серьезно отразиться на времени исследования и связано с этическими сложностями.
Учитывая опыт других высокоразвитых стран, оценивать лекарственные препараты на основании их биофармацевтических свойств можно на этапах разработки ЛП, при выборе наиболее оптимальной ЛФ и т.д. [5,6,7,11].
Взаимозаменяемость воспроизведенных ЛС. Виды эквивалентности воспроизведенных ЛС.
Как такового понятия "эквивалентность", несмотря на его частое употребление, в фармацевтической терминологии, не существует. Согласно Всемирной Организации Здравоохранения, наиболее корректным является употребление термина "взаимозаменяемость" для воспроизведенных лекарственных средств. Данный термин означает терапевтическую эквивалентность лекарственного препарата, которым можно заменить оригинальный препарат в клинической практике [13,29]. Кроме терапевтической эквивалентности выделяют еще фармацевтическую, биологическую и "эквивалентность in vitro " (in vitro equivalence), введенная в употребление в документе "WHO Technical Report Series 937. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations (2006). Annex 7. Multisource (generic) pharmaceutical products: guidelines on registration requirements to establish interchangeability".
Выбор объектов исследования и их клиническое значение
Оценка эквивалентности in vitro основывается на биофармацевтических свойствах сравниваемых препаратов. Проводится это исследование в 3-х сре дах со значениями рН 1,2, 4,5 и 6,8 для определения профилей растворения в каждой среде для обоих препаратов (референтного и тестируемого) или для разных дозировок препаратов одного производителя [23,28,60,63,64,80,85,91,92,100]. Существует разница между проведением теста "Растворения", определяющим качество препаратов твердых дозированных лекарственных форм и оценкой эквивалентности in vitro. Принципиальным различием названных испытаний являются условия их проведения. Тест "Растворение" проводят в соответствии с условиями, приведенными в нормативной документации. Оценка эквивалентности in vitro поводится в условиях, не совпадающих с условиями для теста "Растворение", в частности, среды растворения и скорость вращения мешалок разные. Следует отметить, что значения рН 1,2; 4,5 и 6,8 отражают физиологический диапазон разных отделов рН ЖКТ [30,43,48,50,55,72,98]. Законодательство РФ не регламентирует проведение испытаний in vitro, такие испытания в России применяют только для оценки эквивалентности разных дозировок одного и того же воспроизведенного лекарственного средства [21]. Для получения оценки эквивалентности воспроизведенных лекарственных препаратов и оригинальных препаратов, при их государственной регистрации, согласно законодательству РФ, необходимо проведение исследований биоэквивалентности или клинических исследований. Проведение оценки in vitro за рубежом регламентируется законодательно и применяется при регистрации и внедрении генерических лекарственных средств [32].
За рубежом взаимозаменяемость генерических лекарственных препаратов оценивается на основании их биофармацевтических свойств и эквивалентности in vitro, что является альтернативой оценкой исследованиям in vivo [21,31,58,59,105]. Для препаратов, исследуемых в работе: темозоломида, има-тиниба и капецитабина изучение биофармацевтических свойств является актуальным, т.к. согласно литературным данным - это препараты 1 класса БКС. Оценка биофармацевтических свойств рекомендована для 1 и 3 класса БКС. Исследования in vivo онкопрепаратов возможно только с участием пациентов, что затруднено из-за этических проблем, поэтому данный подход имеет дополнительные преимущества для противоопухолевых лекарственных препаратов.
Однако в России проводились исследования эквивалентности воспроизведенных лекарственных препаратов на основании их биофармацевтических свойств.
В диссертационной работе Шохина И.Е.[2009 г.] изучена сравнительная кинетика растворения препаратов амлодипина ("Норваск" и "Омелар кар-дио"), препаратов ибупрофена ("МИГ-400" и "Ибупрофен") а также лекарственных средств атенолола отечественных производителей. В результате оценки эквивалентности профилей растворения для препаратов атенолола сделано заключение об их эквивалентности во всех трех средах без математической обработки. Для препаратов амлодипина сделано заключение об эквивалентности профилей растворения при рН 1,2 и 4,5 без математической оценки и эквивалентности профилей при рН 6,8 на основании расчета фактора сходимости f2, который составил 84,75. Для препаратов ибупрофена сделано заключение об эквивалентности профилей растворения при рН 6,8 без математической оценки и неэквивалентности профилей при рН 4,5 на основании расчета фактора сходимости f2, который составил 111,22. На основании комплексной научной оценки полученных данных сделано обоснованное заключение о возможности отказа от фармакокинетических исследований биоэквивалентности для препаратов амлодипина и атенолола и заменой их изучением сравнительной кинетики растворения (процедура "биовейвер") и невозможности подобной замены для генерических лекарственных средств ибупрофена [46].
В диссертационной работе Малашенко Е.А. [2012 г.] изучена кинетика растворения метопролола, бисопролола и индапамида. Профили растворения препаратов метопролола и бисопролола оказались эквивалентны в трех средах растворения (рН1,2; 4,5; 6,8), в то время как профили растворения инда-памида неэквивалентны при рН 6,8. Эквивалентность исследуемых ЛС би-сопролола и метопролола подтверждена результатами фармакокинетических исследований, в то время как неэквивалентность исследуемых ЛС индапами-да, характеризует тест кинетики растворения как более дискриминаторный тест, чем изучение биоэквивалентности, при котором данные ЛС индапамида признаны эквивалентными. Соответственно, эквивалентность изученных воспроизведенных ЛС может быть установлена in vitro [18].
Кулинич Ю.И. [2012г.] в диссертационной работе исследовала препараты ибупрофена, кетопрофена и пироксиками in vitro. Изученные ЛС ибу-профена и ЛС кетопрофена оказались неэквивалентными in vitro согласно процедуре "биовейвер", в отличие от ЛС пироксикама для которых такая эквивалентность была установлена. Качественный состав таблеток ибупрофена, покрытых оболочкой, и капсул исследуемых ЛС пироксикама сходный, в отличие от капсул ЛС кетопрофена. По результатам изучения кинетики растворения при рН 1,2 показано влияние натрия лаурилсульфата на скорость высвобождения кетопрофена из капсул Фламакса. Установлено, что ЛС ибу-профена и кетопрофена при рН 6,8 характеризовались "быстрой" и "очень быстрой" скоростью растворения соответственно. Для ЛС пироксикама была характерна "очень быстрая" скорость растворения в солянокислом и фосфатном буферных растворах, при рН 4,5 наблюдлось "медленное" растворение пироксикама [17].
Обработка результатов изучения биофармацевтической растворимости субстанций
Экспериментальное изучение биофармацевтической растворимости субстанций проводили согласно разработанной методике. Поскольку в РФ отсутствует государственный стандарт и/или фармакопейная статья по валидации аналитических методик, то валидация методик количественного определения проводилась согласно внутренней стандартной операционной процедуре лаборатории, основанной на рекомендациях ICH, USP, FDA и АРФП [4, 26, 94].
Поиск информации по биофармацевтическим свойствам (растворимость, проницаемость) проводили в публикациях в рецензируемых научных журналах и монографиях, а также в базах данных по БКС. 2.1.6. Среды растворения. 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносили 500 мл воды, 8,7 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, доводили объем раствора до 1000 мл водой и тщательно перемешивали. 0,2 М раствор уксусной кислоты В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносили 200 мл воды, прибавляли 11,6 мл уксусной кислоты ледяной, давали раствору охладиться до комнатной температуры, доводили объем раствора до метки водой и тщательно перемешивали.
Ацетатный буферный раствор рН 4,5
В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносили 2,99 г натрия ацетата три-гидрата и растворяли в 200 мл воды. К полученному раствору прибавляли 14 мл 0,2 М раствора уксусной кислоты, доводили объем раствора до метки водой и тщательно перемешивали. Измеряли рН раствора на рН-метре, при необходимости доводили рН до 4,5 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или 0,1 М раствором натрия гидроксида.
Фосфатный буферный раствор рН 6,8 11,790 г натрия гидрофосфата двенадцативодного и 4,609 г калия дигидро-фосфата вносили в мерный стакан вместимостью 1000 мл, прибавляли 400 мл воды, перемешивали с использованием магнитной мешалки в течение приблизительно 30 мин до полного растворения, затем переносили в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводили объем раствора до метки водой и тщательно перемешивали.
Измеряли рН раствора на рН-метре, при необходимости доводили рН до 6,8 раствором фосфорной кислоты или 0,1 М раствором натрия гидроксида. 2.1.7. Растворы стандартов. Приготовление стандартного раствора темозоломида в растворе 0,1 M HCl pH 1,2 а) 0,025 г (точная навеска 0,0251 г) темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 35 мл 0,1 М раствора хлористоводо родной кислоты, помещали в колбу в ультразвуковую баню на 5 минут. По сле охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до метки и перемешивали (рас твор 1). б) 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, при бавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, перемешивали, доводили объем раствора 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до метки и перемешивали (раствор 2). Приготовление стандартного раствора темозоломида в буферном растворе с pH 4,5 а) 0,005 г (точная навеска 0,0057) темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 5 мл буферного раствора с рН 4,5, помещали в колбу в ультразвуковую баню на 5 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем буферным раство ром с рН 4,5 до метки и перемешивали (раствор 1). б) 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, при бавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, перемешивали, доводили объем раствора буферным раствором с рН 4,5 до метки и переме шивали (раствор 2). Приготовление стандартного раствора темозоломида в буферном растворе с pH 6,8 а) 0,005 г (точная навеска 0,0057) темозоломида помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 5 мл буферного раствора с рН 6,8, помещали в колбу в ультразвуковую баню на 5 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем буферным раство ром с рН 6,8 до метки и перемешивали (раствор 1). б) 1 мл раствора 1 помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, при бавляли 40 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, перемешивали, доводили объем раствора буферным раствором с рН 6,8 до метки и переме шивали (раствор 2). Темозоломид в буфере при значении pH 6,8 частично гидролизуется с образованием активного цитотоксического триазена MTIC, что проявляется внешне пожелтением раствора [37].
Приготовление стандартного раствора иматиниба мезилата
Около 50 мг (точная навеска) субстанции иматиниба мезилата вносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 25 мл соответствующей среды растворения, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 1 иматиниба мезилата 0,5 мг/мл). 1 мл полученного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и тщательно перемешивали (концентрация полученного раствора 2 иматиниба мезилата 0,01 мг/мл).
Приготовление стандартного раствора капецитабина Около 20 мг (точная навеска) стандартного образца капецитабина помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в 40 мл спирта 96 %, доводили объем раствора средой растворения до метки и перемешивали (концентрация полученного раствора 1 капецитабина 0,1 мг/мл). 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляли 8 мл соответствующей среды растворения, перемешивали. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводили его объем до метки тем же растворителем, перемешивали (концентрация полученного раствора 2 капецитабина 0,01 мг/мл).
Разработанная методика количественного определения темозоломида была подвергнута процедуре валидации.
Специфичность методики была подтверждена путем снятия спектров сред растворения и соответствующих стандартных растворов. При аналитических длинах волн оптическая плотность сред растворения не отличалась от нуля и не вносила свой вклад в оптическую плотность раствора.
Изучение высвобождения темозоломида из капсул в условиях in vitro
Валидацию методики проводили по следующим валидационным характеристикам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (сходимость и воспроизводимость), аналитический диапазон, устойчивость.
Специфичность методики устанавливали путем снятия УФ-спектров чистых сред растворения (рН 1,2; 4,5; 6,8) и растворов темозоломида (0,01 мг/мл) в соответствующих средах, с последующим сравнением спектров поглощения.
Для установления специфичности методики готовили серию из 6 стандартных растворов темозоломида в диапазоне концентраций 40 % - 140 % в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, которые готовили путем разведения исходного стандартного раствора (Таблица 21) и проводили их количественное определение согласно разработанной методики. На основании значений оптических плотностей был построен калибровочный график линейной зависимости найденных концентраций от введенных концентраций (в нормализованных координатах), рассчитан коэффициент корреляции (r2), угол наклона кривой (slope), значение точки пересечения с осью ординат (y-intercept) и остаточное среднеквадратичное отклонение (residual sum of squares). Таблица 21
Приготовление серии стандартных растворов темозоломида
Объем исходного раствора темозоло-мида (0,25 мг/мл), мл Вместимость мерной колбы, мл Концентрация полученного стандартного раствора, мг/мл Концентрация полученного стандартного раствора, % от номинального
Для оценки правильности методики для 3-х растворов (40 %, 100 % и 140 %), приготовленных для установления линейности, проводили количественное определение и рассчитывали величину относительной погрешности измерения (, %) относительно стандартного раствора.
Прецизионность – это степень близости (степень дисперсии) между сериями измерений, полученных при параллельных измерениях однородного образца в установленных условиях. Прецизионность может определяться на нескольких уровнях – повторяемость/сходимость (repetability), промежуточная прецизионность (intermediate precision) и воспроизводимость (reproduci-bility). При определении воспроизводимости методики испытания необходимость в определении промежуточной прецизионности отсутствует [16,33].
Для оценки прецизионности методики (на уровне сходимости) для 3-х растворов (40 %, 100 % и 140 %), приготовленных для установления линей 68
ности, проводили количественное определение (по 3 раза) для каждого раствора и рассчитывали величину относительного стандартного отклонения (RSD, %).
Для оценки прецизионности методики (на уровне воспроизводимости) для одного раствора с концентрацией 100 %, приготовленного для установления линейности, проводили количественное определение (по 6 раз) в двух лабораториях для каждого раствора и рассчитывали величину межлабораторного относительного стандартного отклонения.
Аналитический диапазон методики устанавливали на основании результатов оценки линейности, правильности и прецизионности методики.
В нашем случае таким критическим внешним параметром, подвергаемым изменению, является рН среды растворения. Нами были приготовлены по 3 стандартных раствора с концентрациями 40 %, 100 % и 140 % от номинального в каждой из 3-х сред растворения. Для растворов в ацетатном буферном растворе рН 4,5 и фосфатном буферном растворе рН 6,8 была проведена оценка правильности и сходимости согласно методикам, приведенным выше.
Обработка результатов изучения теста сравнительной кинетики растворения Статистическую обработку результатов эксперимента осуществляли с использованием пакета Microsoft Office Excel 2007 путем расчета среднего значения количества высвободившегося вещества и относительного стандартного отклонения (RSD, %).
В корзинку помещали по одной капсуле каждого из препаратов темозо-ломида. Последовательный отбор проб проводили через 10, 15, 20, 30 мин по 5 мл, причем такой же объем соответствующего буферного раствора добавляли в среду растворения для сохранения объема. Полученным пробам давали охладиться при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин, затем фильтровали через мембранный фильтр "CHROMAFIL". Для получения статистически достоверных результатов исследование проводили 6 раз для каждого препарата.
Количественный анализ проводили методом УФ-спектро фотометрии [39,41]. Оптическую плотность проб измеряли на спектрофотометре Cintra 101, GBC, при длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандарта темозоломида с концентрацией 0,01 мг/мл в соответствующем буфере. В качестве раствора сравнения брали тот же буферный раствор, который использовался в качестве среды растворения. Результаты высвобождения активного ингредиента в раствор при рН 1,2; 4,5; 6,8 приведены в Таблицах 22-30.
