Содержание к диссертации
Введение
Глава І Обзор литературы 11
1.1 .Ботанико- морфологические характеристики хмеля 11
1 .Распространение и сорта хмеля 12
1.3. Химический состав, методы идентификации и количественного определения действующих веществ соплодий хмеля 15
1.4.Современное состояние стандартизации соплодий хмеля 28
1.5. Фармакологическое действие БАВ соплодий хмеля, а также препаратов на его основе 31
1.6. Хмель в других отраслях народного хозяйства 39
Экспериментальная часть
Глава II. Объекты и методы исследования 41
2.1 .Исследование химического состава соплодий хмеля 47
2.2. Исследование эфирного масла и идентификация компонентного состава 47
2.3. Идентификация и количественное определение производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот) в соплодиях хмеля 52
2.4.Идентификация и количественное определение флавоноидов в соплодиях хмеля 58
2.4.1 . Идентификация флавоноидов в соплодиях хмеля 58
2.4.2.Выбор условий и разработка методики количественного определения флавоноидов 62
2.4.2.1. Исследование влияния концентрации кислоты на оптическую плотность комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом 63
2.4.2.2. Изучение условий проведения реакции флавоноидов с алюминия хлоридом 66
2.4.2.3. Исследование количества экстрагируемых флавоноидов в зависимости от концентрации экстрагента и времени экстракции. 67
2.4.3. Методика определения суммы флавоноидов в соплодиях хмеля 69
2.5. Идентификация и количественное определение лейкоантоцианов в соплодиях хмеля 71
2.6. Определение содержания дубильных веществ в соплодиях хмеля 87
2.7. Идентификация и определение содержания водорастворимых витаминов в соплодиях хмеля 88
2.8. Идентификация и определение содержания жирорастворимых витаминов в соплодиях хмеля 103
2.9. Идентификация и определение содержания органических кислот в соплодиях хмеля 109
2.10. Идентификация и определение содержания аминокислот в соплодиях хмеля 117
2.11. Обнаружение алкалоидов в соплодиях хмеля 129
2.12. Изучение минерального состава соплодий хмеля 131
Выводы к главе II 136
Глава III. Исследование содержания биологически активных веществ в соплодиях хмеля различных сортов
3.1. Сравнительный анализ эфирного масла сортов хмеля методом ТСХ 138
3.2. Сравнительный анализ содержания водорастворимых витаминов в сортах хмеля 143
3.3. Сравнительная характеристика сортов хмеля по содержанию некоторых групп БАВ и физико-химическим показателям 143
3.4. Сравнительная характеристика сортов хмеля по суммарной антиоксидантной активности 146 Выводы к главе III 150
Глава IV. Исследование препаратов соплодий хмеля 151
4.1. Исследование водного извлечения 151
4.2. Исследование экстракта хмеля сухого 153
4.2.1 Качественный анализ экстракта хмеля сухого 154
4.2.2. Количественное определение содержания БАВ в экстракте хмеля сухом 155
Выводы к главе IV 162
Глава V. Стандартизация соплодий хмеля 163
5.1. Разработка характеристик подлинности соплодий хмеля 163
5.1.1. Макроскопический анализ 164
5.1.2. Микроскопический анализ 166
5.1.3. ТСХ-тесты и качественные реакции 174
5.2.Разработка показателей качества соплодий хмеля
5.2.1. Определение содержания эфирного масла 175
5.2.2. Определение содержания суммы флавоноидов 176
5.2.3. Определение содержания суммы производных ацилфлороглюцидов 177
5.2.4. Определение содержания влажности 178
5.2.5. Определение содержания золы общей 178
5.2.6. Определение содержания золы не растворимой в растворе 10% хлористоводородной кислоты 178
5.2.7. Определение содержания осыпавшихся чешуи 179
5.2.8. Определение содержания примесей и измельченности 179
5.2.9. Изучение стабильности соплодий хмеля при хранении 182
Выводы к главе V 184
Общие выводы 186
Литература
- Химический состав, методы идентификации и количественного определения действующих веществ соплодий хмеля
- Идентификация флавоноидов в соплодиях хмеля
- Сравнительный анализ содержания водорастворимых витаминов в сортах хмеля
- Количественное определение содержания БАВ в экстракте хмеля сухом
Введение к работе
з
Актуальность темы.
В последние годы большое внимание уделяется физико-химическим и фармакологическим исследованиям тех лекарственных растений, которые используются как в официнальной, так и в народной медицине.
Одним из таких растений является хмель обыкновенный - Humulus hjpulns (L.), семейство Коноплёвые - СашаЬасеае. В народной медицине соплодия хмеля используют уже более 2,5 тыс. лет. В настоящее время в официнальной медицине нашей страны соплодия хмеля используются весьма ограниченно. Кроме того, химический состав и вопросы стандартизации соплодий хмеля как лекарственного растительного сырья, в т.ч. отечественного происхождения, с учетом всего комплекса содержащихся, в них биологически активных веществ (БАВ) мало изучены. Между тем в мировой фармацевтической практике около 10% соплодий хмеля используется для производства лекарственных средств.
Существующий нормативный документ на соплодия хмеля (ГОСТ 21946-76) не содержит разделов оценки качества лекарственного растительного сырья для использования в фармацевтической промышленности таких как "Микроскопия", "Качественные реакции", "Микробиологический и радиационный контроль".
В связи с вышеизложенным, актуальным является расширенное комплексное изучение химического состава соплодий хмеля с использованием современных физико-химических методов, совершенствование на этой основе стандартизации и создание современной нормативной документации.
В России возделываются сорта хмеля (используемые и в фармацевтической
промышленности), различающиеся по содержанию производных
ацилфлороглюцидов и эфирного масла, поэтому необходимо выявить различия между соплодиями различных сортов по составу и содержанию некоторых других БАВ (флавоноидов, лейкоантоцианов и др.) для использования этих данных в стандартизации сырья.
Актуальными также являются исследования состава БАВ настоя и экстракта хмеля сухого. Кроме того, представляет интерес оценка их антиоксидантной активности (АОА).
Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является комплексное изучение химического состава соплодий хмеля и препаратов на его основе, разработка методов их стандартизации, а также использование полученных данных для создания нормативных документов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1.Изучить литературные данные по химическому составу и фармакологической активности соплодий хмеля; использованию методов определения биологически активных веществ, стандартизации соплодий хмеля.
2. С использованием современных физико-химических методов провести углубленное изучение химического состава соплодий хмеля, и разработать методики анализа по определению содержания БАВ.
' 3. Провести сравнительное изучение химического состава соплодий хмеля различных сортов.
4. С использованием разработанных методик на основе макроскопических,
микроскопических, хроматографических и др. методов установить характеристики
подлинности соплодий хмеля, а также показатели качества сырья, и создать
Фармакопейную статью (ФС) на соплодия хмеля.
Провести исследования химического состава настоя, экстракта хмеля сухого, и разработать проект ФС на экстракт хмеля сухой.
Провести оценку антиоксидантной активности соплодий, настоя и экстракта хмеля сухого с использованием амперометрического метода.
Научная новизна. С использованием современных физико-химических методов (ГЖХ, ВЭЖХ, ТСХ, ВЭТСХ, УФ-спектрофотометрия, ААС) проведено комплексное изучение состава соплодий хмеля. Определено содержание эфирного
5 масла, флавоноидов, лейкоантоцианов, органических, горьких и аскорбиновой кислот, дубильных и ниягидринактивных веществ, каротиноидов, макро- и микроэлементов. Методом капиллярной ГЖХ с МС-детектором изучен компонентный состав эфирного масла. Выявлены группы БАВ для оценки качества и стандартизации соплодий хмеля - эфирное масло, производные ацилфлороглюцидов, флавоноиды.
Разработаны методики ТСХ для идентификации аминокислот, лейкоантоцианов, антоцианидинов, фенолкарбоновых и аскорбиновой кислот в соплодиях хмеля; методики определения содержания суммы флавоноидов с использованием УФ-спектрофотометрии и определения содержания аскорбиновой кислоты в соплодиях хмеля методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором.
Проведено сравнительное изучение по содержанию БАВ в соплодиях хмеля различных сортов.
На основе полученных результатов проведена стандартизация соплодий хмеля: определены характеристики подлинности и показатели качества с использованием макро- и микроскопических, хроматографических и других физико-химических методов анализа.
Проведены исследования качественного и количественного состава БАВ настоя и экстракта хмеля сухого (определено содержание производных ацилфлороглюцидов, флавоноидов, лейкоантоцианов и др.); разработаны характеристики подлинности и показатели качества для стандартизации экстракта хмеля сухого.
Определена антиоксидантная активность соплодий хмеля различных сортов, настоя и экстракта хмеля сухого.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:
методики определения подлинности микроскопическим методом (порошок соплодий хмеля), с использованием ТСХ (флавоноиды, эфирное масло),
качественная реакция на лейкоантоцианы; методики определения содержания производных ацилфлороглюцидов в соплодиях хмеля, суммы флавоноидов, эфирного масла, которые включены в разработанный нами проект ФС «Хмеля соплодия», переданный на рассмотрение в Государственный Фармакопейный комитет.
методики идентификации флавоноидов и их количественное определение в соплодиях хмеля, которые апробированы в лаборатории ОКК ОАО «Красногорсклексредства» (Заключение по результатам апробации методик от 12.12.04. №1423).
методики определения подлинности (ТСХ) сухого экстракта и количественного определения производных ацилфлороглюцидов в сухом экстракте хмеля (заключение об апробации в ОКК ОАО «Хармс»), которые включены в разработанный нами проект ФС «Экстрактхмеля сухой».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. На защиту выносятся:
Результаты изучения качественного и количественного состава БАВ соплодий хмеля.
Результаты сравнительного изучения химического состава соплодий хмеля различных сортов.
Результаты по разработке характеристик подлинности и показателей качества соплодий хмеля.
Результаты исследований химического состава настоя и экстракта хмеля сухого.
Результаты оценки антиоксидантной активности соплодий, настоя и экстракта хмеля сухого. Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на конференции "Фитотерапия в геронтологии" (Москва, 2000г.), Всероссийской
7 конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000г.),
Научно-технической конференции "Молодые ученые пищевым и
перерабатывающим отраслям АПК" (Москва, 2000г.), Международной
конференции "Генетические ресурсы лекарственных и ароматических растений",
посвященной 50-илетию ботанического садаВИЛАРа (Москва, 2001г.).
Связь задач и исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом НИР лаборатории фармакогнозии НИИ фармации ММА им. И.М.Сеченова по теме: "Разработка новых и совершенствование существующих методов получения, оценки качества и стандартизации лекарственного растительного сырья, лекарственных средств природного, биотехнологического и синтетического происхождения" (регистрационный номер темы 01.200302927).
Объем и структура диссертация. Работа изложена на 198 страницах, содержит 46 таблиц, 27 рисунков, 13 фотографий и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, библиографии из 183 наименований, из которых 50 на иностранных языках и приложений.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе на основании литературных данных обобщены сведения о ботанико-морфологической характеристике видов хмеля, химическом составе, методах анализа основных биологически активных веществ в растительном сырье; изучении макро- и микроскопических признаков соплодий хмеля; их стандартизации; фармакологической активности и использовании соплодий хмеля в производстве лекарственных препаратов и в других отраслях народного хозяйства.
Вторая глава посвящена объектам и методам исследований, разработке методик с использованием современных физико-химических методов
8 анализа и комплексному изучению химического состава соплодий хмеля (эфирное
масло, производные ацилфлороглюцидов, флавоноиды, лейкоантоцианы,
органические кислоты и др)
В третьей главе представлены результаты сравнительного изучения содержания биологически активных веществ (эфирное масло, производные ацилфлороглюцидов, флавоноиды, лейкоантоцианы, органические кислоты и др) и физико-химических показателей (влажность, зола общая, антиоксидантная активность и др) в соплодиях хмеля различных сортов.
В четвертой главе излагаются результаты исследований состава и содержания БАВ в настое и экстракте хмеля сухом, приводятся значения их АОА и результаты по разработке показателей качества экстракта хмеля сухого.
В ПЯТОЙ главе приводятся результаты по стандартизации соплодий хмеля, которые включают идентификацию по макро-, микроскопическим признакам и методом ТСХ, а также числовые показатели по действующим веществам (содержание эфирного масла, суммы флавоноидов и производных ацилфлороглюцидов).
Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены и представлены в таблицах, проиллюстрированы графиками и рисунками. В приложениях приведены таблицы БАВ соплодий хмеля, препаратов на их основе, а также разработанные проекты Фармакопейных статей.
Химический состав, методы идентификации и количественного определения действующих веществ соплодий хмеля
Сейчас в основном используют культивируемый хмель. Наибольший процент хмеля от мирового производства выращивается в Германии 32%, США-26%, Чехия и Словакия-8,7%, Великобритания-7,1%, Украина-4,3%, Росеия-2,2%, Польша-1,9%, Бельгия-1,3% (95,110).
В настоящее время производство хмеля в России сосредоточено в 16 административных регионах. В конце 90-х годов заложены хмельники в Башкирии, Удмуртии, Нижегородской, Ульяновской, Омской областях и Хабаровском крае (95,110). Основными районами выращивания хмеля являются республики Чувашия, где находится научно-исследовательский проектно-технический институт хмелеводства, Марийская и Горный Алтай.
Качество соплодий хмеля обусловлено сортовыми особенностями растений, условиями их произрастания и первичной переработки соплодий. Сортовой состав хмеля меняется для отдельных зон и регионов хмелеводства. В настоящее время в мире создано более 300 сортов хмеля, из которых 20 находится в производственном использовании в России.
Среди селекционных сортов в настоящее время выделяют 3 сортотипа хмеля: ароматический, горько-ароматический и горький (11-0). Содержание горысих веществ в соплодиях хмеля значительно различается и зависит от сорта (124). Ароматические сорта хмеля содержат от 3 до 6% альфа-кислот, большое количество (до 3,5%) эфирного масла, и имеют ярко выраженный хмелевой аромат.
Горько-ароматические сорта хмеля совмещают в себе высокое содержание горьких веществ и эфирного масла. Содержание альфа-кислот в них колеблется от 6 до 10%, а эфирного масла от 0,4 до 2,6%, и также обладают ярким хмелевым запахом. У горько-ароматических сортов к эфирному маслу примешиваются смолы и бальзамические соединения, которые тоже определяются при перегонке. Горькие сорта хмеля содержат альфа-кислот более 10%, но обладают менее выраженным запахом хмеля. У горьких сортов большое количество эфирного масла получают в основном за счет смолистых соединений (110). Для отнесения сортов хмеля к группам качества также рекомендуется химический показатель - доля альфа-кислот в общих хмелевых смолах. Для сортов горького сортотипа это соотношение составляет 35% и более, а для сортов ароматического сортотипа - не менее 20%.
Проведенные с помощью различных физико-химических методов, включая газовую и газо-жидкостную капиллярную хроматографию исследования показали, что содержание эфирного масла у этих трех групп различается незначительно, но компоненты эфирного масла и их соотношение специфичны для каждого сорта и остаются постоянным при изменении условий среды. Состав эфирных масел контролируется на уровне генома и является надежным критерием для идентификации сортов (60,110,160), что важно при использовании эфирного масла для приготовления лекарственных препаратов, т.к. позволяет добиваться стабильности качества препаратов, используя для этого определенные сорта хмеля. В настоящее время обнаружено, что содержание в соплодиях флавоноидов, таких как 8-пренилнарингенин, 6-пренилнарингенин, ксантогумол и др. также различается по сортам (155).
К ароматическому сортотипу относят сорта Ранний, Михайловский, Истринский, Клон 18, Урожайный. К горько-ароматическому сортотипу принадлежат сорта Полесский, Крылатский, Сумерь, Смолистый, горькому -Подвязный, Сильный, Гранат (ПО).
В настоящее время в фармации используются соплодия хмеля независимо от сорта, в т.ч. и от дикорастущих растений. В литературе не обнаружены указания на исследования соплодий различных сортов для приготовления лекарственных препаратов. Поскольку лечебный эффект оказьгеает совокупность БАВ соплодий хмеля, то для получения сырья хмеля не пивоваренных кондиций желательно выявлять среди существующих сортов такие, которые обладали бы определенными параметрами качества (повышенным содержанием флавоноидов, лейкоантоцианов, аскорбиновой кислоты, антиоксидантной активностью и др.). Важно обратить внимание на существование сортотипов хмеля, которые возможно использовать для создания лекарственных препаратов целенаправленного действия. Например, сорта горькой группы - для создания антибактериальных препаратов и увеличивающих секрецию желудочного сока, горько-ароматической - для создания противовоспалительных и мочегонных препаратов, ароматической - для получения эфирного масла, успокаивающих и сердечно-сосудистых препаратов.
Соплодия хмеля богаты биологически активными веществами. Содержание воды в сухих соплодиях хмеля составляет до 13%, золы 7-10% (11), экстрактивных веществ извлекаемых водой 22-28% (136,141,146). Данные по химическому составу соплодий из различных литературных источников приводятся в таблице 1 Приложения к главе I. Эфирное масло хмеля сосредоточено практически полностью в лупулиновых железках (от 0,3 до 1,8 % эфирного масла) и представляет собой прозрачную подвижную жидкость от светло-зеленого до светло-коричневого цвета со специфическим хмельным запахом, практически не растворимую в воде (1:20000), хорошо растворимую в спирте и эфире. Химический состав эфирного масла включает более 200 компонентов (60,131,145,176,177), которые входят в следующие группы органических соединений: алифатические вещества, терпеноиды, ароматические и гетероциклические соединения (5,68,103). На схеме представлены основные группы веществ, присутствующие в эфирном масле хмеля.
Идентификация флавоноидов в соплодиях хмеля
Наиболее специфичными БАВ для соплодий хмеля являются горькие кислоты, которые представляют собой сумму производных ацилфлороглюцидов. Термин «горькие кислоты» признан Всемирной конвенцией пивоваров и используется во всем мире (11), поэтому далее по тексту мы использовали также и этот термин. Но для раздела «Количественное определение» мы предложили термин «Сумма производных ацилфлороглюцидов».
Горькие кислоты обладают широким спектром фармакологического действия (Глава I), достаточно исследованы (1,45,73,95,131), и несомненно имеют большую фармакологическую значимость и как показатель качества при использовании соплодий хмеля в лекарственных препаратах. Поэтому для стандартизации соплодий хмеля идентификация и количественное определение горьких кислот имеет существенное значение.
Идентификация горьких кислот в соплодиях хмеля методом ТСХ. Во многих работах (72,121,131,137,161) представлены результаты исследований и методы идентификации горьких кислот (ВЭЖХ, ТСХ).
В нашей работе мы провели идентификацию горьких кислот в соплодиях хмеля, произрастающего на территории России, используя методику ТСХ, описанную в зарубежных фармакопеях (136,141,146), где гумулон и лупулон идентифицировали по величинам подвижности внешних стандартов: 10% раствора п-диметиламинобензальдегида и 5% раствора Судана І в метаноле соответственно. 1,0 г сырья измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, помещали в колбу на 100 мл с притертой пробкой, прибавляли 20 мл смеси метанол-вода (7:3) и экстрагировали на механической качалке в течение 15 минут. Затем извлечение фильтровали через бумажный фильтр "красная лента".
Идентификацию горьких кислот методом ТСХ проводили на пластинках размером 16x6 см со слоем силикагеля марки G60 F254 фирмы "Мерк", с использованием подвижной фазы: этилацетат - ледяная уксусная кислота - гексан (38:2:60). На линию старта наносили 50 мкл полученного извлечения и по 5 мкл растворов внешних стандартов. Хроматографирование проводили на высоту 14 см. На хроматограмме отечественного хмеля в УФ - свете (365нм) помимо указанных в зарубежных фармакопеях двух зон с Rf 0,88 с голубой флуоресценцией (гумулон) и с Rr-0,58 с коричневой флуоресценцией (лупулон) напротив зон внешних стандартов, наблюдаются еще 6 зон с различной флуоресценцией с Rf 0,40 (желтоватая), 0,47 (желто-зеленая), -0,68 (голубая), 0,73 (желтая), 0,78 (голубая), 0,81 (красная), -0,94 (желтая). В видимом свете после обработки хроматограммы 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты все зоны сине-зеленого цвета. Схема хроматограммы приведена на рис 4. На рис. 5 представлена цветная хроматограмма водно-метанольного извлечения соплодий хмеля, снятая в УФ-свете при 365нм.
Таким образом, на хроматограмме, по сравнению с опубликованными данными, нами также обнаружены и описаны дополнительные зоны других компонентов. При этом данную методику возможно использовать для стандартизации отечественного сырья хмеля. Схема хроматограммы горьких кислот соплодий хмеля Идентификация в УФ-свете при длине волны 365нм
Считают, что фармакологическое действие соплодий хмеля, учитывая также значительное их количество, обусловлено горькими кислотами (44). Поэтому мы сочли важным определить содержание суммы горьких кислот в соплодиях хмеля.
Горькие кислоты хорошо растворяются в полярных органических растворителях (этиловом эфире, ацетоне и др.) и имеют выраженные кислые свойства, поэтому определяли их методом Винте и Йенсена (50,131).
Сущность метода заключается в экстрагировании горьких кислот и смол из измельченных соплодий хмеля этиловым эфиром или другим полярным растворителем и определение суммы горьких веществ методом кислотно-основного титровании экстракта хмеля 0,01н раствором едкого кали.
Учитывая сильную испаряемость и высокую пожароопасность эфира, М.С. Кондаковым был испытан ряд других растворителей, среди которых был выбран ацетон (50). Ацетон предварительно сушили сульфатом натрия, т.к. он поглощает воду, а в водный раствор ацетона переходят все кислоты соплодий хмеля, что завышает результаты определения содержания горьких кислот.
При расчете содержания горьких кислот количество затраченного едкого кали умножают на величину 0,4, которая принята, исходя из молекулярного веса горьких кислот, определенного экспериментальным путем. Для отдельных смол были даны следующие грам-эквиваленты: 1мл 0,01н КОН - соответствует 0,32г а - кислоты, 0,4г - р-кислоты и 0,6г - у-кислоты. Учитывая среднее значение содержания этих компонентов в соплодиях хмеля, авторы получили величину титрования для общих смол 0,4 (50,131). Содержание горьких кислот в соплодиях определяли по нижеприведенной методике:
Методика. Аналитическую пробу соплодий хмеля измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстием 2 мм. Около 0,2 г (точная навеска) измельченных соплодий хмеля помещают в пробирку с плотно притертой пробкой или навинчивающейся крышкой объемом 20 мл, прибавляют 5 мл просушенного сернокислым натрием ацетона и экстрагируют на механической качалке в горизонтальном положении в течение 15 минут. Затем пробирку ставят вертикально и отстаивают в течение 15 минут. Из отстоявшейся жидкости отбирают пипеткой 1мл в другую пробирку, добавляют 2 капли 0Д% спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,01н спиртовым раствором едкого кали до появления красной неисчезающей окраски.
Сравнительный анализ содержания водорастворимых витаминов в сортах хмеля
Исходя из этого, используемый в качестве стандарта цианидина хлорид получали восстановлением кверцетина магнием в присутствии соляной кислоты. 1 мл раствора кверцетина в спирте (1 мг/мл) помещают в пробирку, прибавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты и 10-15 мг металлического магния. После окончания реакции раствор красного цвета переносят в делительную воронку вместимостью 10 мл, прибавляют 1-2 мл подкисленного бутанола, содержимое тщательно перемешивают и дают отстояться 10 минут. Смесь расслаивается на две фазы. Нижний, бесцветный слой сливают и отбрасывают, а верхний окрашенный, содержащий цианидин, сливают во флакон оранжевого стекла, плотно укупоривают и хранят в холодильнике. Как было отмечено выше, при обработке пластинки раствором ацетата свинца с последующей обработкой парами аммиака комплекс цианидина окрашивается в фиолетовый цвет, а дельфинидина в синий. Для подтверждения подлинности полученного цианидина, обрабатывали пластинку, на которую он был нанесен в качестве стандарта, раствором ацетата свинца, а затем парами аммиака. Цианидин-стандарт окрашивался в фиолетовый цвет. По имеющимся литературным данным, в соплодиях хмеля содержится лейкоантоцианидин, при гидролизе образующий цианидин. Зона цианидин-стандарта на хроматограмме соответствует зоне имеющейся в пробе экстракта соплодий хмеля, также окрашивающейся в фиолетовый цвет после обработки пластинки проявителем, что свидетельствует о подлинности полученного цианидина-стандарта и наличие в соплодиях хмеля лейкоантоцианидина.
Выбор условий для количественного определения лейкоантоцианов Определение лейкоантоцианов основано на способности бесцветных лейкоантоцианов при нагревании в кислой среде превращаться в окрашенные антоцианидины. Количественное содержание лейкоантоцианов определяли методом спектрофотометрии. При выборе стандарта для расчета содержания лейкоантоцианов в соплодиях хмеля, мы исходили из нескольких возможных вариантов. Например, содержание лейкоантоцианов можно рассчитывать по калибровочному графику, построенному по сумме лейкоантоцианам в комплексе полифенолов хмеля (71), однако данный способ может давать завышенные результаты.
В работе Т.В.Купчака для расчета содержания продуктов кислотного гидролиза лейкоантоцианов в качестве внешнего стандарта предложен хлорид кобальта (ГОСТ 4525-77,чда) высушенный до постоянной массы (56). Хлорид кобальта по своей структуре является кристаллогидратом, который может изменять свой состав в процессе хранения, что влияет на результаты анализа. Для определения возможности расчета антоцианидинов бутанольного раствора соплодий хмеля на хлорид кобальта снят спектр поглощения 1,5% раствора хлорида кобальта в воде. Раствор стабилизировали соляной кислотой из расчета 0,06 мл кислоты на 100 мл раствора согласно ГФ XI. Экспериментально определено, что при изменении рН раствора хлорида кобальта от 2 до 0,5 максимум поглощения не смещается. Максимум поглощения приходится на длину волны 510нм, что не совпадает с максимумом поглощения антоцианидинов (продуктов гидролиза лейкоантоцианов) соплодий хмеля. Поэтому вести расчет по хлориду кобальта нецелесообразно.
По литературным данным максимум поглощения цианидина в 0,01% метанольном растворе подкисленным соляной кислотой отмечается при длине волны 545 нм, а максимум поглощения антоцианидинов бутанольного раствора соплодий хмеля - при 551 нм (115). Близость этих значений, а также как было показано выше, присутствие цианидина в соплодиях хмеля позволяет проводить расчет лейкоантоцианов на цианидин. Однако, ввиду отсутствия стандарта цианидина надлежащей чистоты, возможна замена его на другой стандарт, каким в данном случае является наиболее доступный среди антоцианов - пеларгонидина хлорид.
Для расчета содержания антоцианидинов в подкисленном бутанольном растворе соплодий хмеля на пеларгонидин хлорид в интервале длин волн 450-600 нм снят спектр поглощения пеларгонидина хлорида с концентрацией 8 мкг/мл и продуктов гидролиза лейкоатоцианов соплодий хмеля в подкисленном бутаноле. Максимум поглощения пеларгонидина хлорида наблюдается при длине волны 536,8 нм, а максимум поглощения антоцианидинов бутанольного раствора соплодий хмеля при длине волны 550 нм (рис. 13).
Количественное определение содержания БАВ в экстракте хмеля сухом
Данные таблицы показывают, что соплодия хмеля разных сортов отличаются по содержанию действующих веществ, золе общей и нерастворимой в 10% растворе соляной кислоты.
Следует отметить также, что содержание полифенольных соединений, нингидринактивных веществ, суммы каротиноидов, свободных органических и аскорбиновой кислот в анализируемых сортах хмеля различаются незначительно. Это свидетельствует о том, что для изготовления лекарственных средств, в фармацевтическом производстве могут использоваться соплодия различных сортов, с учетом количественного содержания в них БАВ.
Довольно существенны в сортах хмеля различия в содержании горьких кислот и эфирного масла, которые объясняются генетической принадлежностью сортов к различным сортотипам - ароматическому и горькому. Поэтому сорта с повышенным содержанием эфирного масла (более 0,35%) целесообразно использовать для получения эфирного масла, которое входит в состав седативных препаратов ("Валокордина" и др.), а также для получения других спиртосодержащих препаратов и экстрактов.
Сорта хмеля с повышенным содержанием горьких кислот (более 15%) (ПО), являются перспективным сырьем для получения антибактериальных препаратов, препаратов для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и различных экстрактов, обогащенных горькими кислотами.
Заслуживает внимания высокое содержание в соплодиях хмеля всех исследуемых сортов нингидринактивных веществ, свободных органических кислот и полифенольных соединений (флавоноидов, лейкоантоцианов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот), которые обладают антиоксидантной активностью, а следовательно укрепляют антиоксидантную систему организма, также обладая капилляроукрепляющим, гипотензивным, спазмолитическим, противовоспалительным действием. Наряду с культурными сортами, нами исследованы также соплодия дикорастущего хмеля, собранные в Подмосковье. По некоторым показателям (по содержанию дубильных веществ, эфирного масла, флавоноидов) дикорастущий хмель уступает культурным сортам, а по остальным показателям от них не отличается.
Исследования подтвердили, что в настоящее время для получения лекарственных средств правомерно использовать соплодия всех исследуемых сортов хмеля, включая сырье от дикорастущих растений.
При воздействии на организм различных неблагоприятных физических или химических факторов, а также стрессовых ситуаций формируется неспецифическая реакция, которая проявляется в повышении свободно-радикальных процессов вследствие патологического метаболизма кислорода (так называемый синдром пероксидации или свободно радикальная патология) (130,151). В результате патологического взаимодействия с клетками тканей, развиваются такие тяжелые заболевания как атеросклероз, инфаркт миокарда, онкологические заболевания, снижение иммунитета и др. (105,151,171) Одним из способов профилактики и комплексной терапии организма является применение антиоксидантов растительного происхождения (9,101,163).
Практическое использование фитоантиоксидантов в качестве средств антиоксидантной терапии требует тщательного предварительного изучения их эффективности in vitro. Для оценки in vitro антиокислительного действия препаратов применяют различные модельные системы: глицил-триптофановая модель с хемилюминисценцией (метод, отличающийся специфичностью и высокой чувствительностью); по поглощению кислорода при окислении исследуемых веществ; титрование с использованием раствора перманганата калия; электрохимические методы и др. (9,33,62,106,130,151,153). Известно, что и специфическое действие растительных препаратов и их антиоксидантное действие определяется особенностями химической структуры БАВ и их содержанием в сырье (40,628). Известно также, что чем выше содержание горьких кислот и полифенольных соединений в соплодиях хмеля, тем выше их АОА, при этом АОА соплодий различается по сортам (9,164). Для оценки соплодий хмеля нами проведено определение суммарной их антиоксидантной активности с использованием прибора "Яуза-ААА-01" с амперометрическим детектором, который имеет высокую чувствительность и селективность в отношении соединений, у которых имеются функциональные группы, способные окисляться или восстанавливаться (полифенольные или оксифенольные кислоты, витамины, аминокислоты и др.) (91,168).
Методика. 1 г (точная навеска) соплодий хмеля, измельченных до размера частиц 2мм, вносят в коническую колбу, прибавляют 20мл воды и нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Затем колбу снимают с бани и настаивают при комнатной температуре 45 мин. После этого извлечение процеживают через марлю и отжимают сырье в мерный цилиндр, доводят, если нужно, до заданного объема и фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" (раствор А). Перед введением в прибор (раствор А) фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (раствор Б).
