Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «СОСТАВ КАРОТИНОИДОВ МОРСКИХ ЕЖЕЙ И ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА НЕГО»
1.1 Строение и классификация каротиноидов 8
1.2 Каротиноиды морских ежей. Свойства и функции каротиноидов 9
1.3 Методы анализа каротиноидов 19
1.4 Экологические аспекты репродукции и питания морских ежей 28
1.5 Влияние каротиноидов на качественные характеристики гонад 32
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
2.1 Район исследования 37
2.2 Объекты исследования 37
2.3 Методы исследования 40
2.3.1 Определение пола и стадии зрелости морских ежей 40
2.3.2 Методы подготовки проб к анализу 41
2.3.3 Методы анализа каротиноидов 42
2.3.4 Цветовые измерения 46
2.3.5 Определение общего азота 46
2.4 Статистическая обработка результатов 46
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48
3.1 Исследование качественного состава каротиноидов S. intermedius и S. nudus 48
3.1.1 Каротиноиды гонад 48
3.1.2 Каротиноиды стенок кишечника 51
3.1.3 Каротиноиды панциря и игл 56
3.2 Распределение основных каротиноидов в организме морских ежей 57
3.3 Изменение содержания основных каротиноидов гонад морских ежей в течение репродуктивного цикла
3.3.1 S. intermedius 62
3.3.2 S. nudus 69
3.3.3 Сравнение динамики каротиноидов у S. intermedius и S. nudus 73
3.4 Взаимосвязи между питанием морских ежей и пигментным 78
составом гонад. Цветовые характеристики гонад
3.4. J Исследование пигментного состава некоторых видов водорослей 79
3.4.2 Взаимосвязь между пигментным составом гонад, их цветовыми 86
характеристиками и питанием морских ежей
ВЫВОДЫ 107
ЛИТЕРАТУРА
- Строение и классификация каротиноидов
- Определение пола и стадии зрелости морских ежей
- Сравнение динамики каротиноидов у S. intermedius и S. nudus
Введение к работе
Актуальность. Каротиноиды являются важной составляющей пищи морских ежей. Установлено, что они способствуют росту гонад (de Jong-Westman et al., 1995a) и необходимы для нормального развития гамет и последующего выживания эмбрионов (Tsushima, 1995; George et al., 2001). Качественный состав каротиноидов изучен для ряда видов правильных и неправильных морских ежей (Goodwin, 1984; Tsushima, 1995). В то же время, факторы, оказывающие влияние на содержание этих пигментов в организмах, которое может колебаться в значительных пределах, практически не изучены. Так, сведения о динамике каротиноидов в течение репродуктивного цикла представлены только для самок Strongylocentrotus droebachiensis (Griffiths & Perrott, 1976), а также тропического вида Tripneustes gratila (Shina et al., 1978). Для промысловых видов Strongylocentrotus intermedius и Strongylocentrotus nudus такие данные отсутствуют.
Каротиноиды синтезируются de novo только растениями и микроорганизмами и далее по пищевым цепям поступают на более высокие трофические уровни (Бриттон, 1986). Данные о взаимосвязи качественного и количественного состава каротиноидов гонад морских ежей с видовым составом и фитомассой водорослей в биотопе в литературе отсутствуют.
Качество гонад морских ежей, как промысловых объектов, определяется рядом параметров, одними из главных является величина гонадного индекса и цвет гонад (Kelly et al., 2001). Попытки увеличить размер гонад морских ежей за счет улучшения их кормовой базы неоднократно предпринимались в искусственных условиях и на природных полигонах (Agatsuma et al., 1995; de Jong-Westman et al., 1995a; Klinger et al., 1997; Vadas et al., 2000). Количественные закономерности цветообразования гонад морских ежей не изучены.
В этой связи, изучение пигментного состава морских ежей и факторов, влияющих на него, является составной частью экологических исследований,
5 направленных на поиск условий, оптимальных для существования животных. Выбор оптимальных биотопов для пересадки морских ежей на природный полигон и определение качественного и количественного состава растительной пищи, т.е. факторов, от которых зависит получение продукции наилучшего качества, также напрямую связаны с изменениями содержания каротиноидов. Цель работы. Оценка качественного и количественного состава каротиноидов промысловых видов морских ежей S. intermedius и S. nudus, в зависимости от биологического состояния гонад, видового состава и количества растительной пищи.
Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:
-определить качественный состав каротиноидов и оценить их содержание в органах морских ежей видов S. intermedius и S. nudus;
-оценить изменение содержания каротиноидов гонад в зависимости от пола и стадии зрелости гонад;
-исследовать состав каротинов некоторых видов макрофитов, являющихся основой питания морских ежей;
-выявить взаимосвязи качественного и количественного состава каротиноидов гонад с видовым составом и фитомассой водорослей в биотопе;
-изучить влияние концентрации каротиноидов на цветовые характеристики гонад.
Научная новизна. Установлен состав и содержание каротиноидов в гонадах, стенках кишечника, панцире и иглах у морских ежей S. intermedius и S. nudus. Исследовано изменение содержания каротиноидов гонад в течение репродуктивного цикла. Наибольшее содержание у обоих полов S. intermedius и самцов S. nudus наблюдается для нерестовой стадии, у самок S. nudus на стадии начала развития, наименьшее - на стадии покоя. Показано, что видовой состав фито-ценозов слабо влияет на качественный состав каротиноидов гонад. Выявлена положительная корреляция фитомассы водорослей биотопа и содержания каро-
тиноидов в гонадах S. intermedius. Обнаружено увеличение красного цветового стимула цветового тона гонад с ростом концентрации каротиноидов. Практическая значимость работы. Качественный состав каротиноидов морских ежей должен учитываться при разработке рационального кормления при их искусственном воспроизводстве. Знание состава необходимых каротиноидов и их соотношения в организме животного обуславливает необходимость добавления их в искусственные корма или выбор естественных с аналогичным качественным составом пигментов. Исследование изменения содержания каротиноидов в течение репродуктивного цикла позволяет выделить стадии развития гонад (начала развития и активного гаметогенеза), когда потребности животных в них максимальны. Это важно как для нормальной жизнедеятельности морских ежей, так и для получения гонад с оптимальными цветовыми характеристиками. Модифицированные методики высоко-эффективной жидкостной хроматографии могут быть использованы для анализа каротиноидов морских ежей и водорослей в биохимических и экологических исследованиях. Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Всероссийской конференции «Молодежь и химия» (Красноярск, 1997), региональных конференциях молодых ученых по актуальным проблемам морской биологии и экологии в ДВГУ (Владивосток, 1998), «Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов» в ТИНРО-Центре (Владивосток, 1999), «Проблемы экологии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2000), П региональной научно-практической конференции «Проблемы охраны и рационального использования биоресурсов Камчатки» (Петропавловск-Камчатский, 2000), 6ой Европейской конференции по иглокожим (Баниульс-сюр-мер, Франция, 2001), I международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, 2002).
7 Положения, выносимые на защиту:
Содержание каротиноидов в гонадах морских ежей в течение репродуктивного цикла подвержено закономерным изменениям. Для обоих полов S. intermedius и самцов S. nudus оно возрастает от нулевой до нерестовой стадии, после чего следует резкий спад. У самок S. nudus максимальное содержание каротиноидов отмечено на стадии начала развития.
Абсолютное количество каротиноидов в гонадах S. intermedius и S. nudus увеличивается с ростом фитомассы водорослей в биотопе. Видовой состав фитоценозов слабо влияет на качественный состав каротиноидов гонад.
Строение и классификация каротиноидов
Каротиноиды - это группа пигментов желтого, оранжевого и красного цветов, присутствующая у многих организмов, но образуемая de novo только растениями и фотосинтезирующими бактериями. Из всех классов природных пигментов каротиноиды, по-видимому, наиболее широко распространены и, несомненно, принадлежат к числу важных биологически активных соединений (Бриттон, 1986).
Подавляющее большинство каротиноидов представляют собой тетратер-пены, т. е. CAQ соединения. Их углеродный скелет построен из ВОСЬМИ Сб изо-преновых фрагментов или их производных. На одном или на обоих концах молекулы обычно присутствует шестичленное кольцо, например у Р-каротина, который обычно рассматривается как "прародитель"для всей группы каротиноидов (Carotenoids 1А, 1995).
В соответствии с системой ШРАС, наименование того или иного углеводорода составляется путем добавления в виде приставки к слову «каротин» двух греческих букв, характеризующих две концевые Ср-группы. Так, Р-каротин обозначается по этой системе как р,р-каротин, а его изомер, сс-каротин, у которого двойная связь в положении 5 -6 находится в положении 4 -5 , получил название Р,є-каротин (Carotenoids 1А, 1995)
Каротиноидные углеводороды известны под названием каротинов. Все их производные с кислородсодержащими функциональными группами называются ксантофиллами (Бриттон, 1986). В каротиноидах обнаруживается большинство обычных кислородсодержащих функциональных групп. Например, в них присутствуют гидрокси-, кето-, метокси-, эпокси- группы, иногда альдегидная или карбоксильная группы; при этом соответствующие группы могут быть этерифицированы или гликоли-зированы (Carotenoids 1А, 1995).
Каротиноиды широко распространены среди морских беспозвоночных и часто обуславливают их окраску, высокое содержание этих пигментов обнаружено в репродуктивных органах многих видов (Goodwin, 1984).
В 30-50х годах XX века Ледерером, Гудвиным и др. было установлено, что основным каротиноидами гонад морских ежей являются эхиненон (=микоксантин, афанин) и р-каротин. Было обнаружено также присутствие небольших количеств а-каротина. Данные выводы были сделаны на основании изучения видов, относящихся, в основном, к правильным морским ежам (виды Para(= ylo)centrotus lividus,ylocentrotus droebachiensis, S. purpuraus). Наиболее полный обзор ранних источников приведен в работах Hallenstvet et al. (1978) и Goodwin (1984).
Позднее Galasko et al. (1969) обнаружили, что стенки кишечника морского ежа P. lividus содержат, в основном фукоксантинол и новый каротиноид -парацентротин. Однако другим авторам (Tsushima, 1995) подтвердить существование последнего не удалось. Griffiths & Perrott (1976) обнаружили, что главным каротиноидом стенок кишечника у S. droebachiensis является изофукок-сантин. Однако, исходя из данных частичной характеристики этого пигмента, проведенной авторами, может оказаться, что это также фукоксантинол (Hallenstvet et al., 1978).
Hallenstvet et al. (1978) исследовали вид Psammechinus miliaris и обнаружили, что 68% от суммарного содержания каротиноидов в еже составляет фу 10 коксантинол, содержащийся в кишечнике; на долю содержащихся, главным образом, в гонадах р- и ос-каротинов приходится 15 %, эхиненона - 10%.
Годовая динамика каротиноидов гонад и стенок кишечника была впервые исследована Griffiths & Perrott (1976) для самок вида S. droebachiensis. Было установлено, что содержание каротиноидов в гонадах максимально в феврале-марте, т.е. в месяцы предшествующие нересту. Основываясь на отсутствии эхиненона в бурых водорослях, основном корме морских ежей, был сделан вывод, что эхиненон синтезируется в организме морского ежа из Р-каротина. Так как в гонадах был обнаружен промежуточный продукт окисления Р-каротина -Р-изокриптоксантин, авторы предположили, что конверсия р-каротина в эхиненон осуществляется в гонадах.
Сравнение качественного и количественного состава каротиноидных пигментов у самцов и самок морских ежей было впервые сделано Fox & Scheer в 1941 (Goodwin, 1984). Было установлено, что в мужских гонадах S. francis-canus накапливается больше каротиноидов, чем в женских. Напротив, для вида Tripneustes gratila, обитающего в Красном море, характерно более высокое содержание этих пигментов в гонадах самок (Shina et al., 1978). Авторы данной работы также установили, что в процессе созревания, содержание каротиноидов в яичниках увеличивается с 2.56 до 3.38, а в семенниках - с 1.79 до 2.78 мг/100 г сырой ткани.
Яйцеклетки морских ежей также содержат каротиноиды, в отличие от сперматозоидов. Динамика этих пигментов в процессах раннего эмбриогенеза была исследована для видов P. lividus (Мопгоу & de Nicola, 1952; de Nicola & Goodwin, 1954), S. purpuratus (Griffiths, 1966), P. miliaris (Hallenstvet et al., 1978), S. intermedins (Vershinin & Lukyanova, 1993). Качественный состав пигментов женских гамет в процессе их развития у S. droebachiensis был исследован Griffiths & Perrott (1976). У всех перечисленных выше видов, кроме S. intermedins, где был обнаружен только эхиненон, яйцеклетки содержат и эхиненон (доминирующий каротиноид), и р-каротин (обычно около 10%). По сообщению Monroy & de Nicola (1952), каротиноиды в яйцеклетках и эмбрионах связаны в каротин-белковый комплекс.
Кроме этого, имеется еще несколько сообщений о наличии у морских ежей каротинопротеинов. Так, Nakagava & Fujita (1978) сообщили, что каротиноиды яичников Hemicentrotus pulcherrimus связаны с белком. Czeczuga (1983) выделил из целого ежа каротинопротеин зеленого цвета. Характеристика выделенных комплексов, однако, не проводилась.
Введение в экспериментальную практику методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и обращенно-фазных (ОФ) сорбентов позволило более детально проанализировать качественный и количественный пигментный состав. В первую очередь это связано с увеличением чувствительности метода ВЭЖХ по сравнению с ТСХ и колоночной хроматографией и возросшей селективностью (ОФ сорбенты по сравнению с силикагелем) и эффективностью разделения (ВЭЖХ ..., 1988; Carotenoids 1А, 1995).
Определение пола и стадии зрелости морских ежей
Стадию зрелости гонады определяли на прижизненных мазках с помощью микроскопической техники по шкале, предложенной Хотимченко и др. (1993) и дополненной Викторовской (1998). На основе цитофизиологических характеристик клеток гонады эти авторы разделили репродуктивный цикл морских ежей на пять стадий: 0- стадия покоя, характеризуется посленерестовыми перестройками в гонаде и минимальной гаметогенной активностью. На нулевой стадии развития в ацинусах гонад половые клетки не обнаруживаются и пол животного по этой методике определить невозможно; 1- стадия начала развития, характеризуется процессом пролиферации гамет. На стадии 1 в гонадах у самок присутствуют ооциты малого роста, а у самцов - сперматогонии; стадия 2- активного гаметогенеза, преобладают процессы дифференциации половых клеток, включая вителлогенез. На этой стадии в яичниках наблюдается цитоплазматический и трофоплазматический рост ооцитов (встречаются ооциты большого роста и единичные яйцеклетки), а в семенниках протекают процессы сперматогенеза (присутствуют сперматоциты и некоторое количество сперматозоидов); 3 нерестовая стадия, ацинусы гонады заполнены зрелыми гаметами, готовыми к вымету; 4- посленерестовая стадия, в просветах резко сократившихся ацинусов обнаруживаются остатки невыметанных половых клеток, а по периферии встречаются пристеночные ооциты у самок и сперматогонии у самцов. Экстракция каротиноидов Образцы гонад, извлеченные из живых ежей, замораживали и хранили при -20С до анализа, обычно в течение одного, двух дней. Навеску ткани, массой 0.5-1.0 г, гомогенизировали в ступке с десятикратным объемом ацетона (5-10 мл). Гомогенат фильтровали через фильтр ГЛотта при помощи водоструйного насоса. Для полноты извлечения каротиноидов остаток с фильтра переносили в ступку для повторной экстракции еще 5 мл ацетона. Остаток на фильтре промывали ацетоном до обесцвечивания растворителя. Каротиноиды переводили в гексан, смешивая в делительной воронке объединенные ацетоновые экстракты с 5 мл гексана и осторожно добавляя 150 мл 5% водного раствора NaCl для разделения гексанового и водного слоев. Экстракт промывали небольшим количеством дистиллированной воды (20-30 мл) для удаления следов ацетона, после чего сушили в течении суток безводным сульфатом натрия.
Стенки кишечника аккуратно извлекали из живого ежа, тщательно удаляли содержимое желудка. Взяв навеску «0.3-0.5 г, пробоподготовку проводили, как описано выше.
Панцирь тщательно очищали от внутренних органов, удаляли Аристотелев фонарь (зубы), после чего промывали в пресной воде. Воде давали стечь, лишнюю влагу убирали при помощи фильтровальной бумаги. После этого панцирь грубо измельчали и брали среднюю пробу («8-10 г). Навеску тщательно гомогенизировали до пескообразного состояния, дальнейшую пробоподготовку проводили также, как и для образцов гонад. Отбор яйцеклеток для качественного анализа пигментов проводили, впрыскивая 4.5% раствор КС1 во внутреннюю полость ежа. Для количественного анализа, яйцеклетки, вытекающие из извлеченных зрелых женских гонад, отбирали шприцем. Экстракцию и анализ каротиноидов проводили также как для образцов ткани гонад.
Для качественного анализа пигментов бурых водорослей (каротиноидов и хлорофиллов) образцы 3-4 г экстрагировали ацетоном также как описано для образцов гонад и не подвергали омылению. Навески водорослей, фекалий морских ежей (1-2 г), которые в дальнейшем подвергали омылению, экстрагировали этанолом в соотношении 1:10 (вес/объем). Экстракцию и фильтрование проводили также как и для гонад морских ежей, за исключением того, что ацетон заменяли этиловым спиртом. Полученный спиртовой экстракт подвергали омылению, как описано ниже. После этого каротиноиды переводили в гексан, раствор в гексане промывали до нейтральной реакции и сушили как описано выше для образцов гонад.
Омыление экстрактов
К спиртовым экстрактам водорослей, фекалий S. intermedins или раствору индивидуального каротиноида в этаноле приливали равное количество 5% раствора NaOH в этаноле и ставили в темное место на 12 часов (Carotenoids 1А, 1995).
Сравнение динамики каротиноидов у S. intermedius и S. nudus
При сравнении довольно больших выборок морских ежей, были найдены различия в содержании основных фракций каротиноидов в гонадах самцов, самок и животных, находящихся на стадии половой инертности для обоих рассмотренных видов. Причем содержание каротиноидов у самцов обычно выше, чем у самок. Из литературных данных известно, что содержание каротиноидов у самцов вида S. franciscanus также выше, чем у самок (Goodwin, 1984). Напротив, для вида Tripneustes gratila, обитающего в Красном море, характерно более высокое содержание каротиноидов у самок (Shina et al., 1978). Лукьянова и Шмидт (1993) не обнаружили различий в содержании каротиноидов между самцами и самками S. intermedius при сравнении групп по 10 особей, что, вероятно, может быть объяснено небольшим размером исследованной выборки и высокой индивидуальной изменчивостью особей этого вида.
У обоих видов яйцеклетки содержат и эхиненоны, и каротины, однако у S. nudus их суммарное количество на единицу веса примерно в восемь раз ниже, по сравнению с S. intermedius. Также как и у S. droebachiensis (Griffiths & Perrott, 1976), в яйцеклетках рассматриваемых видов накапливается преимущественно эхиненон, причем это более выражено для S. intermedius. В тоже время отметим, что по данным Вершинина и Лукьяновой, яйцеклетки этого вида содержат только эхиненон (Vershinin & Lukyanova, 1993).
При рассмотрении изменения содержания каротиноидов (мг/гонады особи) в процессе созревания (рис. 12 и 14) и изменения средней величины гонадного индекса (рис. 15), видна тесная взаимосвязь между этими величинами, что, несомненно, свидетельствует о взаимосвязи между репродуктивным циклом и колебаниями содержания каротиноидов.
Известно, что животные не могут синтезировать каротиноиды. Морские ежи усваивают Р-, а-каротины из водорослей и окисляют их до соответствующих эхиненонов (Tsushima et al., 1993b). Полная последовательность событий, включающих поглощение и утилизацию питательных веществ половыми клетками для иглокожих не описана, однако для морских ежей установлено важное значение вспомогательных клеток в обеспечении гамет трофическим и энергетическим материалом (Хотимченко et al., 1993). В гонадах морских ежей, кроме гамет, присутствует большое количество вспомогательных клеток. Количественное соотношение вспомогательных и половых клеток в течение полового цикла непостоянно (Вараксина, 1980). На ранних стадиях гаметогенеза основное содержание просвета ацинусов составляют именно вспомогательные клетки. Они содержат хорошо различающиеся по тинкториальным свойствам и химической природе глобулы (Вараксина, 1985, Jondeung & Czihak, 1983). В течение гаметогенеза просвет гонады заполняется гаметами и на нерестовой стадии практически всю площадь ацинуса занимают половые клетки, а на долю вспомогательных приходится незначительная часть. Следует отметить, что по мере роста, созревания и накопления гамет, количество глобул в цитоплазме вспомогательных клеток уменьшается, а интенсивность их окраски снижается. Отметим также, что вспомогательные клетки у обоих полов окрашены в желто-оранжевый цвет, обусловленный, вероятно, каротиноидами. Гаметы же окрашены только у самок. Таким образом, возможно, каротиноиды играют важную роль при развитии не только женских, но и мужских гамет, хотя последние и не содержат каротиноидов. Об этой роли косвенно свидетельствует резкое уменьшение содержания пигментов на 4 стадии у самцов. Если у самок аналогичный спад можно объяснить выметом содержащих каротиноиды яйцеклеток, то у самцов продукты утилизации эхиненона неизвестны.
