Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 5
1.1 Фармацевтические препараты в окружающей среде и способы их инактивации
1.2 Окисление органических веществ пероксидом водорода 15
2 Экспериментальная часть 34
2.1 Характеристики исходных веществ 34
2.2 Методика изучения окислительной деструкции 35
2.3 Методика флуориметрического определения концентрации фенола
2.4 Методика спектрофотометрического определения концентрации субстратов
2.5 Методика определения поверхностного натяжения растворов 43
2.6 Методика кондуктометрического исследования 43
2.7 Методика расчета начальных скоростей деструкции субстратов 43
2.8 Методика расчета химического потребления кислорода субстратов
2.9 Методика оценки биологического действия продуктов деструкции 44
3 Результаты и обсуждение 47
3.1 Окислительная деструкция модельных соединений 47
3.2 Окислительная деструкция фармацевтических препаратов реактивом Фентона
3.3 Окислительная деструкция смесей 79
3.4 Оценка воздействия продуктов окислительной деструкции на живые организмы
Выводы 98
Список литературы
- Окисление органических веществ пероксидом водорода
- Методика флуориметрического определения концентрации фенола
- Методика расчета начальных скоростей деструкции субстратов
- Окислительная деструкция фармацевтических препаратов реактивом Фентона
Введение к работе
Актуальность работы. В последнее десятилетие одной из серьезных экологических проблем стал рост содержания различных фармацевтических препаратов в подземных и поверхностных водах. Число сообщений о негативном воздействии медикаментов на гидробионтов и среду их обитания непрерывно возрастает, более того - некоторые персистирующие медикаменты способны перемещаться непосредственно через воду или по трофическим цепям к птицам, млекопитающим и человеку. При этом биологическое разложение фармацевтических продуктов часто затруднено их токсичностью по отношению к микроорганизмам, особенно в высоких концентрациях; лишь немногие лекарственные препараты в окружающей среде сравнительно легко подвергаются биодеградации. Альтернативой биодеградации может стать химическая деструкция, особенно ведущая к полной минерализации загрязнителей. В связи с этим значительное внимание уделяется так называемым Advanced Oxidative Processes (AOPs - передовым окислительным процессам), однако практическое применение окислительно-деструктивных процессов в водоочистке сдерживается эмпирическим характером существующих в этой области представлений. Определение параметров окисления отдельных классов и групп загрязнителей представляется своевременным и актуальным.
Работа выполнена при поддержке государственных контрактов № П397 и П153 в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Цель работы - определение параметров окисления фармацевтических препаратов пероксидом водорода в присутствии ионов переходных металлов и оценка потенциальной возможности применения этого способа для снижения содержания фармацевтических препаратов в местах их высокого скопления или в случаях их залповых выбросов при авариях.
В связи с поставленной целью в задачи работы входило:
выбор наиболее эффективной окислительной системы;
исследование кинетики окисления фармацевтических препаратов в гомогенных условиях и определение оптимальных соотношений концентраций реагентов для каждого препарата;
установление взаимосвязи строения препаратов и их реакционной способности в процессе окислительной деструкции;
выявление взаимного влияния субстратов при окислении их смеси;
оценка влияния продуктов деструкции некоторых препаратов на гематологические показатели крыс.
Научная новизна. Впервые выполнено систематическое исследование кинетики разложения 12 фармацевтических препаратов реактивом Фентона в широком диапазоне варьирования соотношений концентраций реагентов и установлены оптимальные условия деструкции. Для фармацевтических препаратов - производных фенола с различной степенью замещения установлена взаимосвязь строения молекулы с реакционной способностью препарата. Выявлено взаимное влияние окисляемых субстратов в смесях в ходе окисления.
Практическая значимость. Доказана применимость окислительной деструкции реактивом Фентона для широкого круга фармацевтических препаратов. Данный подход может быть использован для очистки сточных вод медицинских учреждений и фармацевтических предприятий от медикаментов на локальных очистных сооружениях, инактивации просроченных препаратов и для других мероприя-
тий, направленных на снижение загрязнения окружающей среды в местах высокого содержания фармацевтических препаратов и в случае их аварийных выбросов. Разработанная методика прошла испытание в ООО "ЛАБХИМ" (г. Белгород).
Вклад автора. Экспериментальные исследования, освоение методик и подбор оптимальных условий эксперимента проведены лично автором. Планирование эксперимента, обработка и обсуждение результатов выполнены под руководством д.х.н., профессора Лебедевой О.Е.
Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на: XVII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2007), международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2007), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2008» (Москва, 2008), 10і International Symposium on Activation of Dioxygen and Homogeneous Catalytic Oxidation (ADHOC 10, Венеция, Италия, 2008), XII Всероссийской научной конференции по химии органических и элементоорга-нических пероксидов «ПЕРОКСИДЫ-2009» (Уфа, 2009), 6th European Conference on Pesticides and Related Organic Micropollutants in the Environment (Матера, Италия, 2010), the 9th, 10th and 11th European Meetings on Environmental Chemistry (EMEC9, Испания, Жирона, 2008; EMEC10, Франция, Лимож, 2009 и ЕМЕС11, Словения, Порторож, 2010), Х-ой международной научно-практической конференции «Проблемы рационального использования природных ресурсов и охраны окружающей среды (экологические и правовые аспекты)» (Махачкала, 2010), молодежной конференции «Международный год химии» (Казань, 2011).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 15 работах, в том числе - в 3 статьях в журналах из списка ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, включает 34 рисунка, 22 таблицы и 4 приложения. Библиография содержит 171 наименование.
Окисление органических веществ пероксидом водорода
В работах [43-45] также проводили деструкцию диклофенака, эритромицина, карбамазепина, ибупрофена, тетрациклина и других фармацевтических препаратов озонированием, при этом варьировали параметры: рН, температуру, концентрацию озона и время озонирования. Также подтверждается, что использование озонирования с пероксидом водорода улучшает эффективность окисления диклофенака. Однако, недостатком озонирования также может являться формирование побочных продуктов.
Французским ученым Вильет (Vulliet Е.) показано, что в состав сточных вод Франции входят фармацевтические препараты: гормональные средства, анальгин, психотропные средства. Изучение устойчивости данных веществ к различным реагентам проводилось в работе [46].
Изучение сточных вод фармацевтического производства, а также попытка окисления метранидазола, левохлонсацина и ацетаминофена проводились в работе [47] двумя методами: хлорированием и окислением пероксидом водорода под действием УФ-облучения. Достаточно успешно осуществлена фото деградация ибупрофена и кетопрофена [48]. Ультрафиолетовое облучение в обычных дозах (5-30 мДж/см2) неэффективно для деструкции лекарственных средств. Однако известно, что антибиотики распадаются под действием солнечного света, следовательно, можно обновлять очистные сооружения, оснастив их оборудованием для распада антибиотиков под действием ультрафиолета.
В работе [49] изучена фотокаталитическая деградация диклофенака в присутствии Ті02, показано влияние неорганических анионов на фотокаталитические процессы окисления. Концентрация ионов гидрокарбоната варьировалась в пределах от 0 до 100 ммоль/л при рН 8,2.
Исследования отдельных представителей фармацевтических препаратов показали, что коагуляция, отстаивание и фильтрация минимально удаляют данные субстраты. Научные исследования по обезвреживанию отходов фармацевтических препаратов сосредоточены по нескольким направлениям, среди которых встречаются различные способы деструкции негодных средств [50-53]. Анализ литературы показывает, что проблема обезвреживания отходов фармацевтических препаратов весьма актуальна и требует срочного решения.
В настоящей работе химическая деструкция фармацевтических препаратов осуществлялась с помощью продуктов радикального распада пероксида водорода. В связи с этим представляется целесообразным провести более подробный обзор исследований окислительно-деструктивных процессов с участием пероксида водорода.
Пероксид водорода с начала 1980-х годов используется в практике очистки и обеззараживания городских и промышленных сточных вод, в частности стоков пищевой, лакокрасочной, фармацевтической, фотографической, газовой и других отраслей промышленности [54]. К его основным технологическим преимуществам следует отнести высокую растворимость в воде, стабильность, возможность обработки воды в широком диапазоне температур, простоту аппаратурного оформления. Наряду с озоном и кислородом, пероксид водорода является экологически чистым окислителем, образующим в качестве продуктов восстановления кислород и воду.
Заслуживает внимания уникальность пероксида водорода как окислителя и восстановителя: в молекулярной форме он сильный окислитель и восстановитель, надежный и удобный генератор свободных радикалов, а в ионизированной форме - донор электронов [55]. Однако при детоксикации сточных вод пероксидом водорода не всегда удается достигнуть требуемой степени очистки, поскольку многие органические соединения устойчивы к
действию пероксида. В связи с этим в настоящее время широко применяются окислительные методы, основанные на диспропорционировании пероксида водорода с образованием реакционно-способных гидроксильных радикалов ОН (Е0 = 2,38 В), а именно, фотолиз перкосида водорода и его радикальный распад под действием ионов переходных металлов, например железа (реактив Фентона) [56].
В присутствии пероксида водорода фенол подвергается окислению на 8% в течение часа, но его моно- и динитропроизводные не разлагаются, даже при высоких концентрациях пероксида водорода ни в темноте, ни при интенсивном солнечном освещении. Необходим окислитель с более высоким окислительно-восстановительным потенциалом. Таким окислителем могут служить радикальные частицы, генерируемые из пероксида водорода [57].
Жидкофазное свободнорадикальное разложение водных растворов пероксида водорода инициируется под действием различных катализаторов, наиболее эффективными из которых являются ионы переходных металлов. Способность генерировать свободные радикалы из пероксида водорода приписывают большинству катионов металлов переменной валентности, однако наиболее детально изучены ионы железа. Сравнительное исследование различных катионов в сопоставимых условиях необходимо для выбора наиболее эффективного катализа окислительного процесса [57-61].
Непосредственно зафиксировать радикальные частицы, образующиеся при распаде пероксида водорода, достаточно сложно. Однако эти радикалы способны деструктурировать устойчивые органические соединения в кислых растворах, что дает возможность опосредованно охарактеризовать процесс радикального распада.
Методика флуориметрического определения концентрации фенола
Проведенные исследования показали, что окисление моно- и динитрофенолов реактивом Фентона в водных растворах сопровождается изменением электропроводности растворов. Возможно, рост электропроводности связан с появлением и накоплением в растворе продуктов деструкции - карбонат-анионов, нитрат-анионов, либо органических соединений - «осколков» нитрофенолов.
Однако аналогичные измерения электропроводности в ходе окисления фенола практически не фиксируют изменения электропроводности (рисунок 3.6). Вероятно, это связано с тем, что основной процесс окисления фенола протекает в течение первых минут, как и процесс образования ионов в системе. Утроение концентраций реагентов не повлияло на характер кривых.
Вопрос о происхождении частиц-переносчиков тока в реакционной смеси носит принципиальный характер, поскольку использование окислительной деструкции в процессах очистки воды имеет смысл только при обеспечении глубокого окисления субстратов. Для изучения продуктов окисления 4-нитрофенола использовали спектроскопии ПМР. Для исключения влияния протонов растворителя спектры регистрировали в тяжелой воде. Были зарегистрированы спектры чистого 4-нитрофенола и реакционной смеси после нескольких суток окисления.
В спектре исходного 4-нитрофенола получены сигналы с химическими сдвигами порядка 7 и 8 м.д., соответствующие протонам ароматического кольца, а также достаточно интенсивный сигнал от протонов обычной воды (химический сдвиг порядка 5,3 м.д.); добиться исчезновения этого сигнала не удалось, так как в тяжелой воде содержание изотопа дейтерия составляло 99,8 атомных %. В области более низких значений химических сдвигов какие-либо сигналы отсутствовали.
В спектре реакционной смеси сигналы ароматических протонов отсутствовали, не появилось новых сигналов от органических протонов, только сигналы протонов воды. Относительная интенсивность последних многократно выросла, что согласуется с представлением о воде как одном из основных продуктов окисления. Отсутствие сигналов от органических интермедиатов позволяет предположить, что увеличение электропроводности реакционной смеси в ходе процесса окисления вызвана накоплением заряженных частиц, не содержащих протоны - наиболее вероятно, нитрат-ионов. Таким образом, появлялись все основания рассматривать изучаемый процесс как необратимую реакцию полной минерализации субстратов.
Установленные закономерности позволили проводить дальнейшие исследования на субстратах более сложного строения.
Окислительная деструкция фармацевтических препаратов реактивом Фентона В состав фармацевтических препаратов входит ряд вспомогательных веществ, которые придают таблетируемой массе необходимые технологические свойства, обеспечивающие точность дозирования, должную прочность и распадаемость таблеток. В качестве наполнителей используют органические и неорганические компоненты. По фармакологическим стандартам состав таблетки выполнен таким образом, чтобы полный ее распад и растворение действующего вещества проходили в течение 10 минут. Эксперимент, выполненный по методике 2.2, позволял количественно переводить действующее вещество таблеток в раствор и отфильтровывать твердые включения. Поскольку фармацевтические препараты попадают с вспомогательными веществами в окружающую среду, для проведения эксперимента по окислительной деструкции действующего вещества фармацевтического препарата, предварительно было необходимо выяснить влияние растворимых вспомогательных веществ на окисляемость субстрата. Поэтому было проведено сравнение окислительной деструкции анальгина, приготовленного из ампул (раствор для инъекций) и таблеток.
Окислительная деструкция действующего вещества анальгина - 1-фенил-2,3-диметил-4-метиламинопиразолон -5-]М-метансульфоната натрия, раствор которого был приготовлен из ампул, была детально изучена в широком диапазоне концентраций окислительных реагентов в течение часа и 6 суток (рисунок 3.7).
Сравнение остаточной концентрации 1-фенил-2,3-диметил-4-метиламинопиразолон -S-N-метансульфоната натрия из ампул при окислении реактивом Фентона в течение 1 часа и 6 суток при различных концентрациях окислительных реагентов
На основании полученных данных были рассчитаны начальные скорости деструкции соли, а также степень деструкции 1-фенил-2,3-диметил-4-метиламинопиразолон -5-1\[-метансульфоната натрия (таблица 3.5).
Методика расчета начальных скоростей деструкции субстратов
В группе трудноокисляемых лекарств препараты по своей способности к окислительно-деструктивным превращениям располагаются в следующем ряду: эффералган УПСА дибазол парацетамол диклофенак но-шпа = димедрол.
Не смотря на то, что левомицетин и димедрол в составе не имеют органических вспомогательных веществ и на первый взляд должны иметь самые высокие степени окисления, однако димедрол - один из самых трудноокисляемых. Наибольшее количество органических вспомогательных веществ находятся в составе Эффералган УПСА и карбамазепина, однако карбомазепин - один из самых легкоокисляемых. Фурацилин и фурасемид -таблекти, но являются наиболее легкоокисляемыми, не смотря на наличие крахмала, талька и стеариновой кислоты в составе.
В таблице 3.13 также приведена максимальная степень деструкции фармацевтических препаратов, достигнутая в оптимальных условиях. Как и следовало ожидать, не наблюдается полной корреляции между максимальной степенью деструкции и расчетной величиной ХГ1К (приложение 4). Сопоставление этих величин дает дополнительную информацию об устойчивости субстратов к радикальному окислению: из общей закономерности «выпадают» либо малоустойчивые к окислению вещества (например, карбамазепин), либо, напротив, персистентные (диклофенак). Проведенные исследования показали, что многие фармацевтические препараты подвергаются окислительной деструкции под воздействием реактива Фентона. Этот метод может быть рекомендован для обезвреживания и инактивации лекарственных средств, попавших в сточные воды. 3.3 Окислительная деструкция смесей
Радикальный распад пероксида водорода под действием ионов железа протекает с образованием гидроксильного радикала, который является неселективным активным центром и обладает способностью одинаково успешно атаковать другую сложную молекулу по различным связям. Тем не менее, система Фентона проявляет ограниченную активность и селективность в химических реакциях, в результате чего выходы продуктов реакций невысоки (раздел 1.2).
Ряд исследований показало, что введение в систему Фентона помимо окисляемого субстрата дополнительного реагента влияет на эффективность процесса. Так, ингибиторами окислительного процесса реактивом Фентона могут являться этиловый спирт, хинон или аскорбиновая кислота.
Однако введение в систему Фентона аскорбиновой и этилендиаминтетрауксусной кислот усиливает каталитическую активность ионов железа, а каталитические системы на основе комплексов железа (III) с фенолом, пирокатехином, гидрохиноном дают более высокие выходы, чем в системах Фентона и Уденфрида.
В зависимости от свойств субстратов и вводимых реагентов в химической реакции могут образовываться различные интермедиаты (субстратные радикалы, ионы, пероксо- и металлсодержащие комплексы) способные изменять механизм реакции. Прогнозирование механизмов взаимного влияния субстратов не является возможным, ввиду различной реакционной способности радикальных частиц, образующихся в окислительном процессе в результате взаимодействия первичных радикалов, генерированных из пероксида водорода с субстратом. Изучение интермедиатов в данных системах затруднительно и требует индивидуального подхода.
В связи с этим представляло интерес изучение окисления различных классов ксенобиотиков в смесях. Следовало выяснить, протекают ли процессы окисления в смесях независимо друг от друга, или может идти речь о взаимном влиянии субстратов при их совместном окислении.
К тому же, сточные воды одновременно содержат загрязнители различных классов и ситуации, когда окислению подвергается только индивидуальный загрязнитель, в реальной практике очистки воды достаточно редки.
Для детального изучения из фармацевтических препаратов был выбран анальгин (1 -фенил-2,3 -диметил-4-метиламинопиразол он-5 -N метансульфонат натрия). Его окисление изучали в смесях с двумя различными веществами. Одна из смесей - анальгин с 4-нитрофенолом, окисление которого подробно описано в разделе 3.1. Вторая исследованная смесь - анальгин с поверхностно-активным веществом оксиэтилированным нонилфенолом (Неонолом АФ 9-10).
Согласно результатам предыдущих разделов, окисление взятого отдельно 4-нитрофенола протекает с большей скоростью, чем деструкция анальгина. При совместном присутствии субстратов в растворе можно было ожидать, что два окислительных процесса будут протекать параллельно, либо один из субстратов проявит свойства ингибитора / катализатора окислительного процесса другого субстрата.
Кинетические кривые окисления смеси анальгина с 4-нитрофенолом при эквимолярном соотношении субстратов представлены на рисунке 3.21. Соотношение окислительных реагентов было постоянным и соответствовало [H202]:[Fe2+]=32:l (8,0 и 0,25 ммоль/л). В таблице 3.14 приведены результаты окисления смесей разного состава.
Окислительная деструкция фармацевтических препаратов реактивом Фентона
Результаты экспериментов по окислительной деструкции фармацевтических препаратов подтвердили эффективность данного подхода. Продукты полной минерализации лекарственных средств - диоксид углерода, вода, азот - нетоксичны, и возможность их сброса в окружающую среду не вызывает сомнения. Вместе с тем существует вероятность появления устойчивых интермедиатов окисления с нежелательными эффектами воздействия на живые организмы. Кроме того, отходами процесса с использованием реактива Фентона неизбежно являются ионы железа.
С целью оценки токсичности продуктов деструкции была выполнена оценка их воздействия на гематологические показатели теплокровных животных (крыс). Для детального изучения были выбраны продукты деструкции анальгина. Методика эксперимента описана в разделе 2.8. Продукты деструкции использовали после 144 часов окисления; непрореагировавший пероксид водорода из смеси удаляли путем каталитического разложения в присутствии диоксида марганца.
Результаты экспериментов по исследованию биологического действия продуктов деструкции анальгина сведены в таблицу 3.19. При сравнении показателей крови экспериментальной и контрольной групп животных можно заметить достоверное снижение содержания гемоглобина, рост количества лейкоцитов, а также снижение содержания различных форм нейтрофилов у животных экспериментальной группы. Изменение других гематологических показателей находится в пределах статистической погрешности. Таблица Основные гематологические показатели крыс, подвергшихся воздействию продуктов деструкции
Необходимо отметить, что зафиксированное изменение содержания различных клеток крови находится в пределах физиологической нормы, то есть воздействие нельзя считать патологическим. Тем не менее, снижение содержания гемоглобина довольно значительно, и этим фактом не следует пренебрегать. Параллельно аналогичный эксперимент с тождественными условиями был выполнен для оценки воздействия нелекарственного субстрата - Неонола АФ 9-10. Результаты эксперимента также представлены в таблице 3.19. Можно видеть, что и в этом случае, для субстрата иного строения, сохраняется тенденция снижения содержания гемоглобина (при сохранении количества эритроцитов). Вероятно, на содержание гемоглобина в крови экспериментальных групп крыс могли повлиять катионы железа, являющиеся одним из компонентов реактива Фентона. Как уже упоминалось, животные получали их вместе с продуктами деструкции. Однако достоверно утверждать, что именно эти ионы попали в плазму крови невозможно, так как избыток железа, всасываемый в тонком кишечнике млекопитающих остается в энтероцитах и попадает в кровь опосредовано через систему белка апоферритина.
Интересно, что на морфофизиологические параметры лимфоцитов крови крыс гораздо более существенное влияние оказывает интрагастральное введение соли Мора, чем воздействие продуктов деструкции анальгина или Неонола (таблица 3.20): это проявляется и в изменении формы клеток, и в снижении жесткости клеточной мембраны.
Сравнение морфофизиологических показателей лимфоцитов крови крыс после интрагастрального введения раствора соли железа с показателями лимфоцитов после введения продуктов деструкции анальгина и Неонола Группа Содержани е железа в плазме крови,мг/мл Морфология лимфоцитов Упругость, Па Диаметр, мкм Высота, мкм Площадь, мкм Объём, мкм Контроль 0,07±0,01 7,47±0,08 1,42±0,0 44±1 60±1 16,8±0,7 Эксперимент - раствор соли Мора 0,13±0,02 6,60±0,08 1,58±0,0 34,7±0,9 55±2 10,4±0,4 Эксперимент продукты деструкции анальгина не опред 7,74±0,1 1,44±0,0 49±2 70±2 14,6±0,6
Эксперимент -продукты деструкции Неонола АФ 9-Ю не опред. 7,46±0,1 1,28±0,0 44±1 55±2 13,1±0,5 Таким образом, воздействие продуктов деструкции анальгина и Неонола АФ 9-10 на гематологические показатели крыс не является патологическим, а на морфофизиологические параметры лимфоцитов воздействие можно признать малосущественным.
