Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Нефтеокисляющие микроорганизмы в морской среде (обзор литературы) 9
1.1. Современные источники загрязнения нефтью и нефтепродуктами прибрежных вод о. Сахалин 9
1.2. Состав и физические свойства нефти и нефтепродуктов, попадающих в морскую воду 15
1.3. Этапы деградации и окисления нефти в морской воде 18
1.4. НУО микроорганизмы 22
1.5. Факторы среды, влияющие на окисление НУ микроорганизмами 31
1.6. НУО микроорганизмы как индикаторы и ремедиаторы среды 35
ГЛАВА II. Районы работ. Материалы и методы исследований 42
2.1. Характеристика районов работ 42
2.1.1. Физико-географические характеристики и гидрометеорологические условия района исследований 43
2.1.2. Гидрологическая характеристика 44
2.2. Микробиологические методы исследований 48
2.3. Микробиологические среды 54
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА III. Гидролого-гидрохимическая характеристика и микробные сообщества прибрежных вод юга о. Сахалин (2004-2006 гг.) 56
3.1. Гидролого-гидрохимическая характеристика прибрежных вод юга о. Сахалин как среды обитания для НУО микроорганизмов 56
3.2. Микробные сообщества, характеризующие органическое загрязнение прибрежных вод юга о. Сахалин (2004-2006 гг.) 64
ГЛАВА IV. Характеристика НУО способности микроорганизмов, вы деленных из прибрежных вод юга о. Сахалин 81
4.1. Выделение НУО микроорганизмов 81
4.2. Культуральные свойства НУО бактерий 82
4.3. Визуальная оценка разложения НУ исследуемыми штаммами в модельном эксперименте 85
4.4. Молекулярно-генетическая идентификация НУО бактерий 87
4.5. Характеристика НУО способности штаммов разных физиологиче
ских групп 93
ГЛАВА V. Сравнительные исследования биологических свойств НУО бактерий, выделенных из прибрежных акваторий с разным характером загрязнения (южная часть Приморского края и о. Сахалин) 100
Выводы 111
Список Литературы 113
Приложения 139
Список сокращений
НУ - нефтеуглеводороды
НУО - нефтеуглеводородокисляющие
МКД - морская калиево-дрожжевая среда
СММ - среда для морских микроорганизмов
МИК - минимальные ингибирующие концентрации
БПК5 - биологическое потребление кислорода за 5 суток
БГКП - бактерии группы кишечной палочки
КОЕ - колониеобразующие единицы
ПДК - предельно допустимые концентрации
- Современные источники загрязнения нефтью и нефтепродуктами прибрежных вод о. Сахалин
- Физико-географические характеристики и гидрометеорологические условия района исследований
- Гидролого-гидрохимическая характеристика прибрежных вод юга о. Сахалин как среды обитания для НУО микроорганизмов
- Выделение НУО микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность исследования. В общей цепи взаимодействия человека с гидросферой важное звено принадлежит управлению прибрежной зоной моря, где осуществляется высокая хозяйственная активность и сталкиваются потоки загрязняющих веществ, поступающих как со стороны суши, так и со стороны моря. В последнее время прибрежные акватории наиболее сильно страдают от нефтяного загрязнения в большинстве своем антропогенного происхождения. Поскольку нефтяные углеводороды (НУ) являются неотъемлемым природным компонентом морской среды, в процессе эволюции выработался довольно эффективный механизм их деструкции с участием микроорганизмов.
Экологическое значение бактерий, как разрушителей углеводородов нефти в море, очень велико, так как известно, что более высокоорганизованные формы организмов не могут осуществлять их полную деструкцию (Bruns et al., 1993). В прибрежной зоне, постоянно загрязняющейся нефтью и нефтепродуктами, формируются специфические сообщества гетеротрофных микроорганизмов, которые обладают широким спектром окисления углеводородов и продуктов их трансформации (Миронов, 2002). Видовой состав и численное соотношение видов в таких микробных консорциумах постоянно меняется. Однако ядро последних неизменно составляют НУокисляющие (НУО) и НУустойчивые бактерии.
Деструктивная активность НУО микроорганизмов зависит от многих факторов: температуры, солености, солнечной радиации, наличия питательных субстратов и др. (Клюшникова, 1981; Одум, 1986). В связи с этим необходимо уделять особое внимание изучению динамики численности, видового разнообразия и биологических свойств НУО штаммов в каждом конкретном регионе. Особенно это касается северных акваторий, где в условиях низких температур легкие фракции нефти, образующие пленку на поверхности воды, испаряются и разлагаются микроорганизмами гораздо медленнее. А тяжелые компоненты, которые оседают на дно, становятся источником вторичного загрязнения (Трунова, 1979; Коронелли и др., 1989).
Уникальным полигоном для изучения деятельности НУО бактерий в северных морях являются прибрежные акватории о. Сахалин, поскольку здесь имеются все возможные источники нефтяного загрязнения, как антропогенного, так и природного происхождения (Комплексные исследования..., 1997). В литературе имеются единичные данные, касающихся исследований микробных сообществ, характеризующих органическое загрязнение прибрежных вод о. Сахалин. Все проведенные к настоящему моменту исследования носят эпизодический характер, в связи с чем мало информативны (Журавель и др., 2004; Микробная индикация качества..., 2004, 2005).
Цель исследования - изучить сообщества НУО морских микроорганизмов и биологические особенности их отдельных штаммов из прибрежной зоны юга о. Сахалин.
Задачи исследования:
Выявить доминирующие микроорганизмы прибрежных вод юга о. Сахалин в условиях органического загрязнения на основе анализа численности микробных эколого-трофических групп.
Дать характеристику НУО способности бактерий, выделенных из разных мест прибрежной зоны юга о. Сахалин.
Провести сравнительный анализ биологических свойств микроорганизмов, выделенных из прибрежных акваторий с разным характером загрязнения (южная часть Приморского края и о. Сахалин), как перспективных для биоре-медиации.
Научная новизна. Впервые показано, что в микробных сообществах прибрежных вод юга о. Сахалин доминирующими по численности являются НУО микроорганизмы, обладающие психрофильными свойствами.
Установлено, что сообщество НУО микроорганизмов гетерогенно по характеру роста на НУ и способности к нефтеокислению. Указанные микроорганизмы можно разделить на три физиологические группы: НУО «микроорганизмы-эмульгаторы», НУО «микроорганизмы прямого контакта», НУустойчи-вые.
НУО микроорганизмы прибрежных вод юга о. Сахалин отличаются по видовому составу от таковых, описанных в литературе, и выделенных из других акваторий. Впервые доказана способность к нефтеокислению у микроорганизмов родов: Thalassospira, Halomonas, Oceanisphaera, Pseudoalteromonas.
Установлено, что НУО микроорганизмы, выделенные из районов с разной степенью и характером загрязнения, отличаются способностью выдерживать высокие концентрации тяжелых металлов, НУ, гидролизовать легкоразлагающиеся органические вещества. Поэтому для эффективной биоремедиа-ции, целесообразно использовать аборигенные НУО штаммы, способные адаптироваться к воздействию поллютантов в месте их обитания.
Практическая ценность. В прибрежной зоне юга острова Сахалин собрана коллекция НУО микроорганизмов (67 штаммов), штаммы которой обладают высокой способностью к утилизации основных НУ (алканы, циклоалканы, ароматические соединения) и могут быть использованы для биоремедиации морской среды.
Предложен новый способ скринингового определения НУО активности бактерий морских микробных сообществ по характеру роста бактериальной культуры на плотных питательных средах, содержащих НУ.
Коллекция культур и материалы диссертации используются в лекционном курсе по экологии микроорганизмов, а также большом микробиологическом практикуме для студентов-экологов.
Положения, выносимые на защиту:
В прибрежных водах юга о. Сахалин, особенно в районах с высокой антропогенной нагрузкой, в структуре микробных сообществ по численности доминируют НУО микроорганизмы.
Сообщества НУО микроорганизмов прибрежных вод юга о.Сахалин являются гетерогенными по способности к окислению НУ, отличаются по видовому составу и биологическим свойствам от микроорганизмов, выделенных из других акваторий.
Апробация результатов диссертации. Результаты работы были представлены на: XII ежегодном совещании северотихоокеанской морской научной ор-
ганизации (Seoul, 2003), VII региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии (Владивосток, 2004), III интернациональном симпозиуме по арктическим исследованиям (Tokyo, 2005), IX Международной научной конференции «Здоровье семьи - 21 век» (Далянь, 2005), I (XIX) Международной конференции молодых ученых «Изучение природных катастроф на Сахалине и Курильских островах» (Южно-Сахалинск, 2006), II (XX) Международной конференции молодых ученых «Природные катастрофы: изучение, мониторинг, прогноз» (Южно-Сахалинск, 2007), II байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007), II Международной микробиологической школе «Микробиологические методы в экологических исследованиях» (Владивосток, 2007), ХПІ Международной научной конференции «Здоровье семьи - XXI век» (Хургада, Египет, 2009), а также на коллоквиумах СахНИРО и семинарах кафедры общей экологии ДВГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора ли-тературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (269 источников, в том числе 85 иностранных) и пяти приложений. Диссертация изложена на 149 страницах, включает 32 рисунка и десять таблиц.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д. б. н., профессору Л. С. Бузолевой за ценные замечания и постоянное внимание, а также сотрудникам экспериментальных лабораторий СахНИРО, НИИЭиМ СО РАН и ДВГУ, оказавшим практическую помощь при выполнении исследований.
Современные источники загрязнения нефтью и нефтепродуктами прибрежных вод о. Сахалин
Основные источники загрязнения морской среды НУ. За последние сто лет развития человеческой цивилизации различные загрязняющие вещества постепенно распространились из рек в эстуарии, в прибрежные и шельфовые зоны морей, и в настоящее время обнаруживаются в открытом океане. Тревожным сигналом неблагополучия морских экосистем является отчетливая тенденция к увеличению концентраций загрязнителей, поступающих в океан через границы раздела: суша - море, атмосфера - море, отложения - вода (Нельсон-Смит, 1977; Немировская, 2004). Нет никаких оснований для оптимистических расчетов на то, что экосистемы океана выдержат любой натиск цивилизации, обладая мощной гомеостатической системой в виде микробных сообществ, обеспечивающих биогеохимические превращения различных соединений. Возрастающая антропогенная нагрузка на морскую среду вызывает значительные экологические изменения в прибрежных акваториях, принимающих наибольшее количество загрязняющих веществ.
В настоящее время наиболее серьезными загрязнителями морской среды по объемам и масштабам последствий являются нефть и нефтепродукты. Источники поступления нефтеуглеводородов в морскую среду могут быть как антропогенные, так и природные (Нельсон-Смит, 1977; Сулейманов и др., 1986; Израэль, Цыбань, 1989; Шапоренко, 1997; Миронов, 2000; Патин, 2001; Немировская, 2004; Wilson et al., 1974; Petroleum..., 1975; Etkin et al., 1999; Wang et al., 2003).
К антропогенным источникам относятся:
1. «Нормальные» безаварийные ситуации (так называемые технологические потери), которые происходят в результате несовершенства современных технологий переработки нефти, а также бытовые и промышленными стоки (Гурвич, 1990). Основной поток загрязнений зависит от индустриализации побережья, численности населения, развития судоходства, освоенности шельфа.
2. Дальний атмосферный перенос углеводородов (около 13%). Возникновение этого потока связано с неполным сгоранием различных видов топлива.
3. Аварийные разливы (6%), происходящие в результате различных происшествий с танкерным флотом. За историю морских нефтеперевозок произошло около 50 крупнейших аварий, закончившихся большими разливами нефтепродуктов (табл. 1). Загрязнению подверглись не только водная поверхность, но и морские побережья. При этом погибли сотни тысяч птиц, морских млекопитающих, огромное количество рыбы и других гидробионтов.
4. Потери при добыче нефти на шельфе: потери при извлечении нефти (имеются данные о потерях до 3,5%, или около 16 млн. тонн в год, добываемой в России сырой нефти) (Мазур, 1997); сброс буровых растворов и шламов, содержащих НУ; потери при транспортировке НУ танкерами, по трубопроводам и при хранении.
Существенный вклад в общий поток поступлений нефтяных загрязнений вносят и природные источники: 1. Высачивание НУ с морского дна (Немировская, 2004). Исследованиями установлено несколько тысяч мест естественного высачивания нефти, их локализация охватывает разные регионы Мирового океана. Так, поступление в море нефти из участка площадью 1,5 км в проливе Санта-Барбара оценивается 10-15 тонн в сутки (Spies et al., 1980). В общем, предполагается, что таким образом в морскую среду может выноситься до 800 тыс. тонн НУ в год (Etkin et al., 1998).
2. Значительное количество углеводородов (до 90 тыс. тонн) поступает на земную поверхность в результате обнажения и эрозии осадочных пород и угленосных отложений. С дождевыми и весенними паводками эти углеводороды попадают в водоемы и почвы (Radke et al., 1990; Пиковский, 1993).
Таким образом, в глобальном масштабе главные потоки поступления НУ в морскую среду складываются за счет антропогенных (городские и промышленные стоки, транспортировка НУ) и природных источников. Из 2350 тыс. тонн, поступающих в Мировой океан НУ, 60% поступает с суши от муниципальных и индустриальных источников, а также с бытовыми, промышленными и речными стоками. 25% загрязнений приходится на различные другие источники. Около 15% - из природных источников, которые создают фоновый уровень НУ для каждого конкретного района.
НУ являются не только антропогенными загрязнителями, но и неотъемлемыми природными компонентами морской среды. Они входят в состав ли-пидной фракции различных организмов (фитопланктон, зоопланктон, бентос, микроорганизмы, ихтиофауна), а также в состав взвесей и донных осадков.
Среди биогенных углеводородов, имеющих большое распространение, различают две генетические группы (Пиковский, 1993):
первично-биогенные углеводороды - продукты биосинтеза живыми организмами;
вторично-биогенные углеводороды - продукты биогеохимического или геохимического преобразования различных неуглеводородных соединений, входящих в состав биомассы отмерших организмов почвы, воды, донных отложений, осадочных пород. Основной геохимических процесс - это рассеивание углеводородов в атмосфере, гидросфере, донных осадках с последующей их трансформацией путем переноса и захоронения (Romankevich, 1984). Главными источниками биогенных углеводородов являются все растения, животные суши и океана; микроорганизмы вод, почв и донных отложений, отмершие растительные и животные остатки. Для морской части углеводородов важнейшие закономерности связаны с планктоном. При биосинтезе происходит образование алифатических углеводородов определенного состава. Другие классы углеводородов поглощаются растениями и животными из окружающей среды. В многочисленных видах фитопланктона в качестве основного алкана был идентифицирован полиолефин, доля которого может достигать 30—40% от общего количества углеводородов. Углеводороды входят в состав морских водорослей (содержат смесь нормальных и изо-алканов), содержатся в различных органах животных (Миронов, 1985).
Часть биогенных компонентов поступает в толщу воды в виде растворов или коллоидов как продукты жизнедеятельности организмов и при лизисе отмерших клеток. Это подтверждается частым обнаружением в толще воды концентраций п-С)7 и гопана (Немировская, 1994). Изоалканы являются доминирующими углеводородами зоопланктона. Наземная растительность характеризуется доминированием высокомолекулярных нечетных алканов С25-С31 (Elias, Cardoso, 1996). Еще одним источником углеводородов в морской среде являются бактерии. Для них типичен гомологический ряд алканов с максимумом в области С2о С25 Вопрос о биогенном синтезе полиареновых углеводородов (ПАУ) остается дискуссионным (Ровинский и др., 1998). Ранее считалось, что в некоторых случаях ПАУ синтезируют бактерии, водоросли и высшие растения (Нельсон-Смит, 1977). В более поздних работах склонялись к тому, что ПАУ, обнаруженные в некоторых наземных растениях, обусловлены поступлением их из загрязненного воздуха (Lipiatou et al., 1994). В донных осадках образование углеводородов происходит в диагенетических процессах, а также при поступлении из земной коры (Пиковский, 1993). В современных морских донных отложениях фоновых акваторий были идентифицированы различные незамещенные полиарены, а также их производные (Yunker et al., 1996; Немировская, 1999).
Оценить количество синтезируемых углеводородов сложно. Считают, что живое вещество Земли генерирует ежегодно 100 млн. тонн углеводородов (Пи-ковский, 1993). В Мировом океане путем фотосинтеза ежегодно продуцируется от 3 до 12 млн. тонн углеводородов (Герлах, 1985; Миронов, 1985). В основном это углеводороды алифатического строения, доля ПАУ составляет 2,7 тыс. тонн/год, а бензапирена - 0, 025 тыс. тонн/год (Neff, 1979).
Физико-географические характеристики и гидрометеорологические условия района исследований
Район исследований расположен вдоль побережья южной части о. Сахалин со стороны Японского и Охотского морей. Все станции отбора проб находятся в прибрежной зоне непосредственно у уреза воды.
Районы исследований имеет ярко выраженный муссонный характер атмосферной циркуляции. На движение воздуха над морями влияют три основных барических образования: алеутский минимум, северотихоокеанский максимум и сибирский зимний антициклон. Они формируются ежегодно и в зависимости от сезона локализуются в постоянных областях, создавая генеральную систему ветров. Наиболее контрастно эта система барических образований выражена в холодный период года. Алеутский минимум получает максимальное развитие и охватывает всю северную часть Тихого океана. В это время над территорией Азии развивается область высокого давления, которая совместно с алеутским минимумом создает устойчивый северо-западный перенос воздушных масс над акваторией Охотского и Японского морей. Скорость ветра достигает 10-20 м/с.
В теплое время года барическая ситуация меняется коренным образом. Область высокого атмосферного давления над Сибирью сменяется областью пониженного давления. Над Охотским морем все лето стационирует область повышенного атмосферного давления, а северотихоокеанский максимум смещается к северу и усиливается, захватывая всю акваторию северной половины Тихого океана. Вокруг него происходит антициклоническое вращение воздуха, в результате чего над акваториями Охотского и Японского морей устанавливается летний муссон с преобладающими ветрами южных румбов. Скорость ветра составляет в среднем 4-7 м/с (Доронин, 1986; Зенин, 1988).
Таким образом, находясь на периферии двух центров действия атмосферы климат южной части о. Сахалин определяется зимними и летними муссонами. Холодный период года может длиться до 120 суток. Самым холодным месяцем является январь, а самым теплым - август (Гидрометеорология и гидрохимия..., 1998).
Температурный режим. Для района исследований характерны резко выраженные сезонные колебания температуры на поверхности моря (от -1,78 до + 18С). В зимнее время из-за интенсивного выхолаживания температура воды поверхностных слоев моря понижается и достигает точки замерзания (-1,78С). Плотностная конвекция, возникающая при этом, приводит к тому, что толща вод до глубины порядка 100 метров приобретает такую же температуру. Летний прогрев повышает температуру поверхностных слоев до +8-18С, при этом холодный подповерхностный слой с отрицательными температурами сохраняется весь год.
В осенний период плотностная конвекция и приливы приводят к полному перемешиванию всей толщи вод до дна.
Период весеннего прогрева поверхностных вод в районах исследования начинается в апреле. Самая высокая температура поверхностных вод моря приходится на август. Максимум наблюдается на акватории к югу от мыса Анива и достигает +16,0-16,5С (Гидрометеорология и гидрохимия..., 1998). На термический режим южной части залива Анива значительное влияние оказывают теплые воды течения Соя. В сентябре начинается охлаждение поверхностных вод. Переход к зимнему состоянию температуры вод происходит в ноябре. В декабре распределение температуры полностью отражает зимнее состояние. Распределение солености. Вертикальное распределение солености морской воды в районах исследования является типично субарктическим, т. е. соленость монотонно растет от поверхности ко дну. Рост солености с глубиной является стабилизирующим фактором и не позволяет развиваться плотностной конвекции глубже 100 м, предотвращая выхолаживание всей толщи вод. Средняя соленость вод поверхности составляет 32,5%о. Под влиянием изменяющегося стока рек, формированием и разрушением ледяного покрова, изменением соотношения осадков и испарения соленость вод имеет сезонный ход. Зимой соленость увеличивается за счет процессов льдообразования и уменьшения речного стока. Максимум солености у южной оконечности о. Сахалин наблюдается в период с декабря по март. Величина солености в заливе Терпения и заливе Ани-ва колеблется в диапазоне 28-32 %о, а в Татарском проливе - от 24,5 до 34 %о. (Пищальник, Бобков, 2000).
Система течений. Район исследований, расположенный на восточном побережье о. Сахалин, находится под влиянием Восточно-Сахалинского течения. Последнее является относительно устойчивым звеном общего циклонического движения вод Охотского моря и имеет направление с севера на юг вдоль восточного побережья о. Сахалин (Верхунов, 1997). В зимние месяцы происходит усиление скорости среднего течения до величин 40-50 см/с. Причем, максимальной величины оно достигает над шельфом и верхней частью склона и значительно слабее в глубоководной части. Летом скорости течения уменьшаются и не превышают 10-15 см/с (Бруевич и др., 1960; Mizuta et al., 2001).
Большой вклад в циркуляцию вод восточного побережья о. Сахалин вносят реверсивные приливные течения суточного характера, скорость которых составляет 35 4-5 см/с. В некоторых заливах она может достигать 260 см/с. Средняя скорость суммарного течения, когда поток направлен на юг, составляет 100-120 см/с, а в фазе прилива - 20-40 см/с (Доронин, 1986).
Районы исследований, находящиеся на западном побережье о. Сахалин, расположены в зоне влияния ветви Цусимского течения, которое по восточной периферии Японского моря достигает Татарского пролива. Одна из ветвей этого течения — течение Соя через пролив Лаперуза проникает в Охотское море. Течение имеет общую направленность на север (Гидрометеорология и гидрохимия..., 1993). Под влиянием холодного Северо-Охотского течения, одна из ветвей которого, через пролив Лаперуза, проникает в Японское море, вызывая в заливе Анива антициклоническую циркуляцию. С другой стороны течение Соя (ветвь Цусимского течения), проникая в Охотское море, вызывает циклоническую циркуляцию вод. Взаимодействие этих двух противоположно направленных течений, а также влияние рельефа дна и конфигурации берегов в заливе формируют микроциркуляции циклонической направленности. Поскольку станции пробоотбора находятся в волно-прибойной зоне моря, то на структуру вод и вертикальное распределение гидрологических характеристик последних большое влияние оказывает ветровое перемешивание.
Ледовые условия. Юг Сахалина омывается теплыми водами ветви Цусимского течения, движущимися с юга на север, и поэтому морские порты Холмск и Невельск, расположенные на этом побережье, относятся к категории незамерзающих. Суровая ледовая обстановка наблюдается только в заливе Мордвинова (пос. Охотское) на восточном побережье острова, где льды могут сохраняться даже в мае. Льды здесь имеют исключительно местное происхождение. Средняя продолжительность ледового периода составляет около полугода. Льдообразование обычно начинается в ноябре, разрушение и таяние ледяного покрова происходит в течение длительного периода с марта по май.
Нефте-геохішическая характеристика района исследований. Интерес к шельфовой зоне острова значительно возрос в последние три десятилетия в связи с открытием ряда перспективных месторождений углеводородов. К настоящему времени здесь открыто 7 месторождений углеводородного сырья. Первым стало открытое в 1977 г. в северо-восточной части шельфа острова нефтегазо-конденсатное месторождение Одопту-море. Далее были открыты следующие месторождения: Чайво - нефтегазоконденсатное (1982 г.), Луньское — нефтега-зоконденсатное (1984 г.), Венинское - газовое (1985 г.), Пильтун-Астохское -нефтегазоконденсатное (1986 г, Аркутун-Дагинское - нефтегазоконденсатное (1989 г.), Киринское - газоконденсатное (1992 г.). В настоящее время на шельфе активно разрабатываются 2 месторождения. В августе 1998 г. в рамках проекта «Сахалин-1» началась промышленная добыча на месторождении Одопту-море. В июле 1999 г. в рамках проекта «Сахалин-2» началась промышленная добыча нефти со стационарной ледостойкой нефтедобывающей платформы «Молик-пак» (первая морская добывающая платформа в РФ). На втором этапе освоения проекта «Сахалин-2» построено еще две морские платформы - вторая нефтедобывающая платформа на Пильтун-Астохском месторождении (ПА-Б) и первая в России газодобывающая платформа на Луньском месторождении (ЛУН-А), а также морские и наземные нефтегазопроводы.
На побережье залива Анива, расположенного в южной части острова Сахалин, уже закончено строительство нефтяного экспортного терминала и завода по производству сжиженного природного газа (СПГ) с узлом отгрузки. Второй этап проекта «Сахалин-2» является одним из крупнейших в мире комплексных нефтегазовых проектов.
Масштабы работ и огромные объемы добычи и переработки нефти и газа создают потенциальную угрозу загрязнения нефтяными углеводородами прибрежных акваторий о. Сахалин. Так за первые 4 сезона добычи нефти с 1999 по 2002 г. было добыто более 5,3 млн. тонн нефти, за 2003 г. - около 3,2 мнл. тонн, за 2004 г. - 3,5 мнл. тонн, за 2005 г. - чуть более 4 мнл. тонн, за 2006 г. -6,2 мнл. тонн, за 2007 г. - 14,9 мнл. тонн, а к 2012 г. добыча нефти на шельфе острова планируется довести до 20 млн. тонн.
Гидролого-гидрохимическая характеристика прибрежных вод юга о. Сахалин как среды обитания для НУО микроорганизмов
Скорость и полнота разрушения НУ бактериями зависит от многих факторов. В первую очередь от температуры, содержания растворенного кислорода и наличия в среде биогенных элементов (Миронов, 2002).
В связи с этим в прибрежной зоне южной части о. Сахалин были проведены гидролого-гидрохимические исследования морской воды по таким параметрам как: температура, рН, соленость, абсолютное и относительное содержание растворенного в воде кислорода, биохимическое потребление кислорода за 5 суток, содержание биогенных элементов. Результаты исследований представлены за период с 2004 по 2006 г. как средние данные, полученные в результате наблюдений по сезонам (Приложение 2, 3).
Температура. Влияние температуры на микробиальную активность разложения органических веществ хорошо известно. Для накопительной культуры морских нефтеокисляющих микроорганизмов температурный градиент в интервале от 0С до +40С равен 3.0 (при увеличении температуры в указанном интервале на каждые 10С скорость утилизации углеводородов возрастает в три раза) (Zobell, 1973b). Однако этот градиент может изменяться. Некоторые виды бактерий активно разлагают нефть и при низких температурах (Зубакина, 1978). Нефтеокисляющие микроорганизмы обнаруживались в полярных морях и выделялись среди льдов Балтийского моря (Миронов, 2000).
В наших исследованиях показано, что минимальные средние значения температуры наблюдались в районе пос. Охотское (рис. 3.1), являющегося прибрежной зоной открытого моря, максимальные - в бухте Лососей и пос. Золото-рыбное - районах мелководных акваторий, расположенных в заливе Анива.
Таким образом, диапазон температур в районах исследования составлял от -1,60 С до +22,15С, что является оптимальным для существования факультативных психрофилов или психротрофных микроорганизмов. При этом согласно данным литературы, наиболее благоприятными для процессов нефтео-кисления являются летние температуры (+20С-+22С) (Гусев, Коронелли, 1982).
Водородный показатель (рН). Средние значения рН среды (минимум, максимум) колебались в зависимости от сезона года: зимой - от 7,51 до 8,21, весной - от 7,46 до 8,14, летом - от 8,06 до 8,50, осенью - от 8,04 до 8,35 (рис. 3.2). Летом и осенью средние значения рН были повышены по сравнению с зимой и весной, что подтверждается также и литературными данными (Але-кин, 1966; Алекин, Ляхин, 1984). При этом наиболее низкий рН наблюдался в районе пос. Золоторыбное в весенний период, а наиболее высокий рН - в бухте Лососей в летний сезон года. Все отмеченные в районах исследования значения рН являются оптимальными для существования нефтеокисляющих микроорганизмов (Biological degradation..., 1994).
Соленость. Воды исследуемых районов обладали сходными значениями солености, за исключением весеннего периода, когда в результате разрушения ледяного покрова и увеличивающегося стока рек соленость повсеместно уменьшалась (рис. 3.3). Минимальные средние значения солености наблюдали в весенний период в прибрежных водах практически всех изучаемых станций (за счет таяния льдов, снегов, весеннего паводка). Максимальные - в зимний, за исключением акваторий порта Корсаков и пос. Пригородное, где максимум солености наблюдался в осенний сезон года.
Микроорганизмы, в районах с постоянной соленостью хорошо адаптированы к существованию в данных условиях. По литературным данным (Shinichi, 1983) известно, что колебания солености в пределах 5%о не оказывают существенного влияния на скорость разрушения НУ НУО бактериями. В нашем случае значительные колебания солености (более 5%о) мы наблюдали весной в 4 районах в основном в заливе Анива (бухта Лососей, порт Корсаков, пос. Пригородное, пос. Золоторыбное). Следовательно, микроорганизмы, выделенные в этот сезон года, будут наиболее адаптированы, так как выдерживают большие перепады солености.
Растворенный кислород. Не менее важным фактором для деструкционных процессов считается наличие в воде кислорода. Он является необходимым элементом для окисления НУ, а насыщенность вод кислородом определяет интенсивность деструкционных процессов (Квасников, Клюшникова, 1981). Вопросы анаэробного окисления нефти изучены недостаточно. Имеются наблюдения за деградацией нефти после катастрофы «Амоко Кадис» (Ward, 1980), которые показали, что скорость разложения нефти при отсутствии кислорода на несколько порядков ниже, чем аэробная биодеградация.
Воды прибрежной зоны исследуемых районов достаточно хорошо насыще-ны кислородом от 9,85 мг/дм до 12,67 мг/дм , что соответствует требованиям для водоемов рыбохозяйственного назначения, концентрация растворенного в воде кислорода для которых не должна быть ниже 6 мг/дм . Высокие показатели растворенного кислорода объясняются мощными приливно-отливными процессами и вдольбереговыми течениями в условиях достаточно открытых морских акваторий районов исследования. Процентное насыщение вод кислородом составило от 95,23% до 129,46% (рис. 3.5). Очевидно, что высокое насыщение вод кислородом в исследуемых районах может обеспечивать постоянную активность процессов окисления нефти микроорганизмами во все сезоны года.
Выделение НУО микроорганизмов
Температура, являясь мощным фактором отбора, может влиять на видовой состав сообществ, численность и активность бактерий. Летом верхние слои воды в прибрежной части юга о. Сахалин прогреваются до 13-14С, что способствует выживанию, в основном, психрофильных штаммов, степень деструкции нефти у которых при температуре 6С обычно выше, чем при температуре 24С (Белоусова, Шкидченко, 2004; Samuel et al., 1996). Для проверки психрофильных свойств исследуемых бактерий изучали их рост на среде Youchimizu- Kimu-ra (1976) при температурах 22С и 6-8С. Установлено, что практически все штаммы коллекции размножались при низких температурах (Приложение 4), исключение составили штаммы 13, 77, 813. Из чего можно заключить, что микроорганизмы, входящие в сообщество НУО бактерий являются психрофилами.
Для изучения характера роста штаммов выделенных на НУ, использовали также плотную среду МКД с добавлением 1% нефти и ее фракций: бензина, керосина, масел.
В результате проведенных исследований все исследуемые штаммы по характеру роста колоний можно было разделить на четыре группы (рис. 4.1).
Первая группа микроорганизмов (23% - от всех выделенных штаммов) -штаммы, у которых был отмечен хороший рост и наблюдались зоны просветления вокруг колоний. Во вторую группу вошли микроорганизмы (13%), которые также хорошо росли на субстратах, но не образовывали зоны просветления вокруг колоний. Третья группа микроорганизмов (12%), в отличие от первых двух групп, наряду с хорошим ростом культуры, образовывала пигментированные колонии (темно-коричневый цвет). Для последней группы микроорганизмов (52%) был характерен очень слабый рост на изученных субстратах. При этом культуральные свойства проявлялись в одинаковой степени у штаммов, выделенных на нефти сахалинской, и у штаммов, выращенных на среде с флотским мазутом.
Как видно из данных таблицы 4.2. В состав первой физиологической группы входили штаммы, выделенные из проб воды практически всех станций, кроме пос. Охотское. Ко второй группе, отличающейся хорошим ростом на заданных субстратах, относились штаммы, изолированные, в основном, из вод бухты Лососей и пос. Золоторыбное. Большинство штаммов третьей группы, составляли штаммы, выделенные из вод порта Корсаков и пос. Пригородное. К четвертой группе были отнесены штаммы, выделенные, в основном, из прибрежных вод пос. Охотское и Пригородное, а также портов Холмск и Корсаков. Согласно данным литературы все НУО бактерии по механизму проникновения поллютанта в клетку можно условно разделить на «микроорганизмы прямого контакта» и «микроорганизмы-эмульгаторы» (Гусев, Коронелли, 1982). Первые за счет гидрофобной поверхности легко вступают в контакт с каплей НУ и поглощают ее посредствам пассивной диффузии. Вторые, не обладающие гидрофобной поверхностью, выделяют в среду метаболиты диспергирующие НУ и лишь, потом усваивают их из водной эмульсии. В связи с этим по характеру роста микроорганизма на плотных средах, содержащих НУ, можно судить о механизме проникновения поллютанта в клетку. Так, «микроорганизмы-эмульгаторы» будут образовывать зоны просветления вокруг колоний, за счет диспергирования нефти. В противоположность этому, «микроорганизмы прямого контакта» и НУ устойчивые бактерии таких зон не образуют. Следовательно, бактерии первой физиологической группы, составляющие 23% от общего числа культур, выросших на НУ, по механизму проникновения поллютанта в клетку следует отнести к «микроорганизмам-эмульгаторам».
Таким образом, штаммы, выросшие на нефти и ее фракциях, отличались по своим культуральным свойствам. Можно было предположить, что эти микроорганизмы отличались по способности разлагать нефтеуглеводороды.
С целью исследования нефтеокисляющих способностей выделенных культур, отнесенных к разным физиологическим группам, был поставлен эксперимент, в котором разложение нефти микроорганизмами оценивалось методом визуализации (ZoBell, 1973). При этом испытуемые культуры выращивали на минеральной среде, где единственным источником углерода являлась 1% нефть. Все 67 культур были засеяны в среду (107 КОЕ/мл), продолжительность эксперимента составила 4 недели. Оценивали разложение нефти микроорганизмами визуально по 4-х крестной системе:
По результатам эксперимента, представленным в таблице 4.3, полностью и в течение 3-х недель (+-Н-+) НУ разлагали 24% исследуемых штаммов.
Отсутствие нефти в среде выращивания к 4-й неделе (+++) наблюдали у 33% штаммов, плохо разлагали НУ 15% (++) и 28% (+) штаммов. Следовательно, 57% штаммов коллекции хорошо разлагали НУ, а 43% — слабо.
По активности разложения НУ внутри физиологических групп культуры распределились неоднозначно (табл. 4.4). Так, наибольшее количество штаммов, разлагающих нефть за 3 недели (++++) относились к первой физиологической группе, а большая часть культур слабо утилизирующих нефть (+) и (++) — к четвертой. Во второй и третьей группах в большинстве своем оказались штаммы, разлагающие НУ на три плюса. При этом наибольшей гетерогенностью по отношению к НУ окисляющей активности обладали 2-я (от ++ до ++++) и 4-я группа (от + до +++) (табл. 4.4).
Для дальнейших молекулярно-генетическиих исследований были отобраны штаммы, которые активно разлагали нефть (++++): 12 штаммов из первой физиологической группы и 4 штамма из второй.
