Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Развитие геомикробиологии 11
1.2. Роль микроорганизмов в цикле углерода 15
1.3. Методы изучения микробных сообществ подземной биосферы 18
1.4. Распространение жирнокислотных биомаркеров в природных средах 21
1.5. Условия существования микроорганизмов в подземной среде 28
1.6. Концепции функционирования подземной биосферы 32
2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Объекты исследования 39
2.1.1. Характеристика Высоковской скважины 39
2.1.2. Характеристика кернов осадочных пород, вскрытых ВПС-1 39
2.2. Обоснование методики изучения подземной биосферы 43
2.3. Подготовка керна породы к микробиологическому анализу 44
2.4. Хромато-масс-спектрометрическое исследование липидных профилей кернов осадочных пород, вскрытых ВПС-1, на содержание микробных маркеров 45
2.5. Выделение микроорганизмов различных эколого-трофическихгрупп
2.5.1. Водородные бактерии 48
2.5.2. Метаногены 49
2.5.3. Автотрофные ацетогены 51
2.5.4. Сульфатредукторы 52
2.5.5. Метанолокисляющие бактерии 53
2.5.6. Алканотрофы 54
2.5.7. Целлюлозоразлагающие бактерии 55
2.5.8. Бродильщики 56
2.5.9. Копиотрофы и олиготрофы 57
2.6. Методы количественного учета микроорганизмов 59
2.7. Методы первичной идентификации изолятов 61
2.8. Методы изучения адаптивных свойств изолятов 62
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Анализ липидных профилей кернов осадочных пород, вскрытых ВПС-1 64
3.2. Реконструкция микробных сообществ кернов песчаника и аргиллита 71
3.3. Выделение эколого-трофических групп микроорганизмов, участвующих в цикле углерода в породах, вскрытых ВПС-1 74
3.4. Численность и биоразнообразие микроорганизмов эколого-трофических групп в осадочных породах, вскрытых ВПС-1
3.4.1. Особенности результатов выделения культивируемых микроорганизмов исследуемых эколого-трофических групп 77
3.4.2. Водородные бактерии 79
3.4.3. Метаногены 81
3.4.4. Ацетогены 87
3.4.5. Сульфатредукторы 87
3.4.6. Метанолокисляющие бактерии 89
3.4.7. Алканотрофы
3.4.7.1. Предпосылки выделения культивируемых УОБ из осадочных пород, вскрытых ВПС-1 94
3.4.7.2. Численность 95
3.4.7.3. Алканотрофные изоляты, выделенные из кернов песчаника и аргиллита в атмосфере пропана и бутана 99
3.4.7.4. Алканотрофные изоляты, выделенные из кернов песчаника и аргиллита на среде с гексадеканом 101
3.4.7.5. Оценка возможности существования культивируемых алканотрофов в условиях глубоких горизонтов земной коры 103
3.4.8. Целлюлозоразлагающие бактерии 109
3.4.9. Бродилыдики 111
3.4.10. Олиготрофы и копиотрофы 115
3.4.9.10. Характеристика культивируемых олиготрофных микроорганизмов 117
3.4.10.2. Характеристика культивируемых копиотрофных микроорганизмов 118
3.4.10.3. Олиготрофные изоляты, выделенные из керна песчаника 119
3.4.10.4. Олиготрофные изоляты, выделенные из керна аргиллита 124
3.4.10.5. Копиотрофные изоляты, выделенные из керна песчаника 126
3.4.10.6. Копиотрофные изоляты, выделенные из керна аргиллита 329
3.4.10.7. Сопоставление характеристик олиготрофных и копиотрофных изолятов 131
3.4.11. Оценка возможности функционирования цикла углерода
в осадочных породах, вскрытых ВПС-1 134
Выводы 152
Список литературы
- Роль микроорганизмов в цикле углерода
- Выделение микроорганизмов различных эколого-трофическихгрупп
- Особенности результатов выделения культивируемых микроорганизмов исследуемых эколого-трофических групп
- Характеристика культивируемых копиотрофных микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время установлено (Оборин и др , 2004), что микроорганизмы могут функционировать в литосфере на глубинах до 6820 м (Тюменская сверхглубокая скважина) Подземная биосфера участвует в регуляции потока вещества и энергии на нашей планете, поддерживая ее гомеостаз (Pedersen, 2000), при этом цикл углерода является ведущим в системе биогеохимических круговоротов и сопряжен с циклами других важнейших элеменгов - О, N, Р и S (Заварзин, 2004) Максимальный возраст исследованных к настоящему времени осадочных отложений составил 400 млн лет и соответствовал девонским нефтеносным песчаникам, в которых обнаружили функционирующих анаэробных сульфатредукторов и ме-таногенов (Ivanov, Belyaev, 1983) Особенности микроорганизмов в докем-брийских осадочных отложениях глубоких горизонтов земной коры и возможность их активности in situ в настоящее время, ранее не изучались Имеющиеся сведения о распространении микроорганизмов и их активности, в подпочвенных горизонтах в целом фрагментарны, что послужило основой для концептуального подхода к изучению так называемой «подземной биосферы» В настоящее время известны концепция гидробиохимической зональности подземных вод Крамаренко (1973), модель хемолитоавтотрофных экосистем - функционирующих в глубоких кристаллических породах за счет первичной продукции из С02 и Н2 - Стивенса (1995) и Педерсена (1997), концепция структурно-функциональных групп подземной биосферы Вер-ховцевой и соавт (1996), концепция трех «бактериальных фильтров» в литосфере Земли Оборина (2004) Тем не менее, прогностическое значение этих концепций остается дискуссионным, поскольку они основаны на изучении изолятов и не сопровождались применением методов молекулярной экологии Оценить метаболические возможности подпочвенных микроорганизмов можно с помощью метода меченых атомов Однако все вышеуказанные методы дороги, требуют специального оборудования и больших затрат времени Нами выбран более дешевый и экспрессный метод анализа жирнокис-лотных биомаркеров в липидных профилях пород, который, блаїодаря при-
менению газовой хроматографии - масс-спектрометрии, позволяет определять количество микробных клеток и соотносить их с известными таксонами Комплексный анализ биоценозов осадочных пород, залегающих на глубинах более 1000 м, основанный на сочетании методов, без выделения и с выделением культивируемых микроорганизмов, ранее не проводился
Цель исследования: изучение биоразнообразия, численности и активности микроорганизмов основных эколого-трофических групп цикла углерода на примере осадочных пород венда Московской синеклизы с использованием маркерного анализа и микробиологических методов
Задачи исследования:
Выделить доминантные эколого-трофические группы микроорганизмов цикла углерода в осадочных породах, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, сочетая анализ биомаркеров в липидном профиле породы и выделение из нее микроорганизмов на лабораторных элективных средах
Изучить качественные и количественные характеристики микроорганизмов каждой эколого-трофической группы
Изучить адаптивные свойства микроорганизмов, выделенных из кернов осадочных пород, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, к условиям подземной среды
Оценить возможность биогеохимической активности микроорганизмов цикла углерода в осадочных породах, вскрытых Высоковской поисковой скважиной №1, в настоящее время
Научная новизна работы. Впервые в осадочных породах венда Московской синеклизы с помощью анализа липидных биомаркеров определена общая численность микроорганизмов Методами посева показано, что только часть пула микроорганизмов активна и высевается на питательные среды, ее массовая доля зависит от флюидоироницаемости пород Результаты исследования свидетельствуют, что в осадочных породах подземной биосферы есть условия для сосуществования, как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов Таким образом, впервые на основе комплексного анализа биоценозов осадочных пород, вскрытых в интервалах глубин 2350-2580 м,
сконструирована схема цикла углерода, протекание которого возможно в условиях изученных горизонтов
Теоретическая и практическая значимость. Работа расширила существующие представления о подземной биосфере Показана возможность функционирования цикла углерода в неисследованных ранее осадочных породах с различной флюидопроницаемостью - песчанике и аргиллите, вскрытых Высоковской скважиной
В работе показана прогностическая значимость метода липидного анализа, который позволяет вести целенаправленный поиск микроорганизмов в породах еще до получения геологической информации Подтверждением тому является идентификация изолированных из кернов бактерий рр Соту-nebactenum и Propionibactenum, биомаркеры которых присутствовали в ли-пидных профилях соответствующих пород Выделенные микроорганизмы, могут быть потенциально перспективными объектами биотехнологии
Экспериментально показано присутствие в породах пула микроорганизмов, который обнаруживает потенциальную активность при проникновении человека в недра Земли
Результаты работы включены в содержание курсов «Экология организмов» (раздел «Экология микроорганизмов») и «Микробиология и вирусология» (раздел «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов») факультета биологии и экологии ЯрГУ им П Г Демидова
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены, доложены и обсуждены
на региональных конференциях 11-ой и 12-ой "Структура, вещество, история литосферы Тимапо-Североуральского сегмента" (Сыктывкар, 2002, 2003), «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2004), «Биоразнообразие Верхневолжья- состояние и проблемы сохранения» (Ярославль, 2004),
на всероссийских конференциях посвященной 200-летию ЯрГУ им П Г Демидова (Ярославль, 2003), "Экологические механизмы динамики и устойчивости биоты" (Екатеринбург, 2004), «Актуальные проблемы совре-
менной биологии» (Астрахань, 2005), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005), «Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных ландшафтов» (Ярославль, 2006), «Наука Образование Молодежь» (Майкоп, 2007),
- на международных конференциях «Микробное разнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005), «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005), интернет-конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований '2007» (Одесса, 2007), IV международном семинаре «Минералогия и жизнь» (Сыктывкар, 2007)
Плбликацнн. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1 Доминирующую эколого-трофическую группу осадочных пород
венда Московской синеклизы составляют углеводородокисляющие микроор
ганизмы
Обнаружившие активность микроорганизмы могут осуществлять в изученных горизонтах цикл углерода
Основным фактором, определяющим интенсивность цикла углерода в исследуемых горизонтах, является флюидопроницаемость пород
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 таблицами и 18 рисунками Список литературы включает 228 наименований работ
Автор выражает глубокую благодарность за помощь в работе и ценные рекомендации д б н ГА Осипову (группа академика Ю Ф Исакова), д б н А Л Степанову (МГУ) и геологу И С Грибовой (ФГУП НПЦ «Недра»)
Роль микроорганизмов в цикле углерода
Существует наука бактериальная палеонтология, которая занимается систематизацией ископаемых микроорганизмов и определяет геологический возраст протекания на нашей планете тех или иных микробных процессов [4]. С помощью сканирующего электронного микроскопа изучают образцы древних пород, в образовании которых принимали участие микроорганизмы - фосфоритов, бокситов, черных глинистых сланцев. При этом изучают морфологию ископаемых микроорганизмов, а также минерализованные продукты их жизнедеятельности: строматолиты (цианобактериальные маты), отдельные биопленки, фосфатизированные чехлы, микрофоссилии (возникшие в результате окремнения клеточных стенок бактерий). Изучают и изотопный состав различных элементов в породах, чтобы выяснить возможность активности микроорганизмов разных физиологических групп в конкретный геологический период.
В современной биологии происходит постепенный поворот от преимущественного изучения отдельных организмов к изучению организмов в сообществах, возможных связей между членами сообщества и взаимодействия с окружающей средой. Традиционные методы изучения микробных сообществ были основаны на классическом микробиологическом принципе, требующем обязательного выделения и культивирования на специальных питательных средах в лабораторных условиях чистой культуры микроорганизмов. Молекулярные методы микробиологических исследований позволяют непосредственно изучать генотипическое разнообразие всех представителей определенного природного сообщества. Появление и усовершенствование различных методов молекулярной биологии -гибридизационного анализа, секвенирования, молекулярного клонирования и полимеразной цепной реакции (ПЦР) - привели к созданию методологии молекулярной экологии. Ее общий принцип: биоразнообразие изучается без выделения отдельных микроорганизмов в чистую культуру, а только на основании анализа отдельных элементов их генетического материала [67].
Традиционные микробиологические методы - с выделением культур бактерий - широко применялись в два последние десятилетия XX в., когда начал повышаться интерес исследователей к подземной микробиологии (subsurface microbiology). Первоначально изучение подземной микробиоты проводилось на основе выделения изолятов подпочвенных бактерий и их идентификации по особенностям морфологии и физиолого-биохимических свойств клеток [81; 82; 116]. В 90-х гг. и далее для идентификации штаммов стали активно применять методы молекулярной биологии. Выделение чистых культур микроорганизмов из подземной среды практикуют и сейчас, поскольку физиолого-биохимические особенности подпочвенных бактерий отличаются от родственных организмов почвенной, водной и наземно-воздушной сред [56; 78].
Для изучения трофических связей в подпочвенных микробоценозах применяли, и продолжают практиковать в настоящее время, выделение на элективных питательных средах физиологических групп микроорганизмов, выполняющих специфические функции (метаногенез, окисление углеводородов, сульфатредукцию) [56; 72; 84; 104; 129; 148; 192; 200; 216]. Это позволяет оценить видовое разнообразие и численность культивируемых бактерий определенной функциональной группы.
Численность микроорганизмов можно определять прямым счетом клеток в геологическом образце. Для этого широко используется метод флуоресцентной микроскопии [123; 137; 145; 147; 152; 159], а также различные молекулярные методы. В подземной микробиологии для изучения видового состава сообществ без выделения чистых культур бактерий используется метод гибридизации 16S рРНК, в том числе в сочетании с градиентным гель-электрофорезом (DGGE) денатурированных ПЦР-фрагментов (ампликонов) ДНК, метод FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) - гибридизация тестовой ДНК непосредственно в пробе с окрашиванием различными флюоресцентными метками [83; 84; 89; 94; 103; 123; 137; 147; 148; 180].
Молекулярно-генетические методы трудоемкие, дорогостоящие и требующие высокой квалификации. Для идентификации чистых культур бактерий широко используется, вследствие простоты и доступности, получил метод анализа метиловых эфиров жирных кислот (ЖК), входящих в состав липидов мембран, окружающих цитоплазму каждой клетки [53]. Однако, для расшифровки таксономического состава микроорганизмов в образцах воды, почвы и породы, в России этот метод еще не получил широкого распространения. В настоящее время в нашей стране мало специалистов с неоходимыми навыками. Кроме того, базы данных по жирнокислотным маркерам микроорганизмов, обнаруживаемых в различных средах обитания, тем более - в подземных водах, кристаллических и осадочных породах -находятся на стадии разработки. Все вышеперечисленные факты послужили причиной применения метода изучения микробоценозов на основе липидного анализа образцов, в нашей работе.
Выделение микроорганизмов различных эколого-трофическихгрупп
Исследования проводили на хромато-масс-спектрометре АТ-5971 фирмы Agillent Technologies (США). Масс-спектрометр квадрупольный с диапазоном масс 2-1000 аем, имеет разрешающую способность 0,5 аем во всем рабочем диапазоне. Ионизация электронами 70 эв. Чувствительность прибора составляет 10 пг по метилстеарату в режиме непрерывного сканирования и 1 пг в режиме селективных ионов. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку HP-5MS из плавленного кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 130 до 320 С со скоростью 5 град/мин. Температура инжектора составляет 280, интерфейса - 250 С.
Для анализа минорных биогенных химических компонентов использовали метод масс-фрагментографии. Составлена программа для селективного детектирования с накоплением сигналов специфических ионов маркерных веществ микроорганизмов. Программа производит периодический опрос интенсивности ионов в пяти временных группах, каждая из которых включает до двадцати ионов. Группы распределены по времени хроматографирования пробы от 4 до 40 мин с момента ввода пробы в хроматограф, охватывают диапазон веществ от декановой кислоты до ситостерола. Алгоритм измерений позволяет детектировать около 140 маркерных веществ микроорганизмов, при использовании трех-четырех параметров на вещество: два специфических иона, характеристическое время удерживания и соотношение площадей их хроматографических пиков.
Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по тридейтеро-метиловому эфиру тридекановой кислоты.
При составлении программы анализа, алгоритма идентификации и количественного расчета эффективного числа клеток компонентов микробного сообщества использованы сведения о химическом составе индивидуальных и коллективных маркеров более 500 видов микроорганизмов, предполагаемых членов сообщества.
Известно, что разные микроорганизмы в составе липидов клеточной стенки имеют в сумме около 200 ЖК, отличающих их от клеток растений и животных. Некоторые вещества соотносятся только с одним таксоном. Число клеток или вес таких микроорганизмов вычисляли по концентрации маркера, используя известные данные по содержанию жирных кислот в микробной клетке, условиям пробоподготовки и калибровки прибора.
Площадь пика маркера пропорциональна его концентрации, следовательно, концентрации соответствующего микроорганизма, которая определяется как число клеток Nj в единице объема или веса пробы по формуле: Ni=Ai[Mst/(q2xMsamxAst)]/Ri,, где выражение в квадратных скобках - постоянный коэффициент: к = Mst/q2/Msam/Ast = Mst(mg)/5,1 xl0(-15)g/Msam(mg)/Ast В этих формулах: Ai - площадь пика маркера, Mst - количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam - соответственно, количество пробы, Ast - площадь пика стандарта, Ri) - доля в % маркера с индексом і в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (Nj), q2 - коэффициент, равный 5,lxl0("15)g, в котором содержится основополагающая в пересчете на число клеток величина 5,9x1012 клеток микробов, содержащихся в 1 г микробной биомассы и доля ЖК в клетке, принятая в среднем равной 3%.
Соответственно, число клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле N2 = Ai х k / Ri2 и так далее, умножая площади пика Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на коэффициент к и деля на долю маркера в % в составе ЖК этого микроорганизма. Здесь мы не рассматриваем случай, когда одна и та же ЖК происходит из клеток разных микроорганизмов, и для разделения компонентов требуется использование более сложных расчетов. Если вещество не обладает свойством маркера, то есть может быть отнесено к двум или более таксонам, то и в этом случае можно вычислить долю вклада каждого микроорганизма, если воспользоваться решением системы уравнений для двух (или, соответственно, более) веществ.
По аналогии с проведенным ранее исследованием была подготовлена база данных для расчета количества клеток потенциальных представителей микробоценозов исследуемых образцов. Первичный анализ состава ЖК маркеров микроорганизмов позволил соотнести их с наиболее вероятными таксонами на основании общего, известного на сегодня, каталога маркерных веществ микроорганизмов. Отнесение ЖК маркера к тому или иному таксону в большинстве случаев не однозначно. Выбор предпочтительного таксона проводится с учетом данных по балансу ЖК профиля образца, физиологическим и трофическим признакам возможных обитателей экологической ниши, а также непременным учетом условий исследуемой среды: температуры, рН, солености, Eh, минерального состава и т.п.
Массовую долю (м.д., %) отдельной физиологической группы бактерий в реконструированном бактериоценозе породы определяли как сумму м.д. всех таксонов, потенциально обладающих соответствующим свойством.
Особенности результатов выделения культивируемых микроорганизмов исследуемых эколого-трофических групп
Мы провели учет потенциальных свойств, связанных с трансформацией органических и неорганических углеродсодержащих соединений, у представителей реконструированных бактериоценозов песчаника и аргиллита. При этом использовали данные о свойствах бактерий различных родов, представленные в публикациях [9; 14; 18; 19; 29; 36; 42; 50; 55; 57; 61; 65; 71; 73; 77; 79; 82; 92; 95; 110; 111; 120; 124; 126; 146; 153; 161; 195; 212; 217; 223; 225; 227]. Анализируя полученные результаты и особенности геохимической обстановки в исследуемых породах, мы выделили семь доминантных эколого-трофических групп микроорганизмов в структуре бактериоценозов песчаника и аргиллита (табл. 3.3.1): ВОБ, гомоацетогенов, СРБ, МОБ, УОБ, ЦРБ, бродильщиков.
Независимо от результатов маркерного анализа пород мы предположили наличие еще трех эколого-трофических групп в структуре микробоценозов осадочных пород. Во-первых, это метаногены. Особенности хроматографа не позволили провести учет биомаркеров метанобразующих архебактерий в липидных профилях пород. Однако в порах песчаника и аргиллита был обнаружен метан - продукт их жизнедеятельности, - а также СОг и Н2 - ростовые субстраты.
Итого, усл. кл/г породы 2,4x10 2,2x10 Примечание: 2358 м - песчаник; 2574 м - аргиллит Поэтому мы сочли метаногенов одной из основных эколого-трофических групп в биоценозах исследуемых пород. Во- вторых, с учетом концепции подземной биосферы Верховцевой и соавт. [7], мы выделили еще две группы: окисляющих органический субстрат до СОг и НгО при его высоких концентрациях в среде - копиотрофов - и, очень низких, -олиготрофов.
Несмотря на то, что в породах присутствовал метан, в липидных профилях песчаника и аргиллита не обнаружили специфических биомаркеров группы метанотрофов (роды бактерий, название которых начинается с Methylo-). В составе бактериоценоза аргиллита присутствовал р. Nocardia (табл. 3.3.1) - единственный среди всех представителей сообществ включающий бактерий, способных окислять метан [29], но его массовая доля была незначительной - 3,2%. Поэтому мы выделили группу метанолокисляющих бактерий (МОБ), использующих производное метана. В подземных водах Пермского Предуралья [56] максимум активности метанотрофов приурочен к водоносным горизонтам зоны затрудненного водообмена на глубинах 150-1500 м. Педерсен в своем обзоре [179] сообщает, что метанотрофы преобладают в слоях земной коры до глубины 200 м. В осадочных породах, вскрытых ВПС-1, метанотрофы, по-видимому, функционируют в более высоких горизонтах земной коры, чем исследованные в нашей работе.
Таким образом, в составе бактериоценозов песчаника и аргиллита мы выделили эколого-трофические группы микроорганизмов, способных развиваться, либо за счет углерода флюидов, используя при этом: а) Н2 и С02 - ВОБ, АМБ и гомоацетогенов, а также автотрофных СРБ, которым, помимо того, необходимо наличие сульфатов в породах; б) Н2 и ацетат (экзометаболит гомоацетогенов и бродильщиков) - ГМБ; в) С і-соединение -метанол (экзометаболит бродильщиков) - МОБ; г) абиогенные углеводороды - алканотрофов; д) абиогенные и биогенные жирные кислоты одновременно с сульфатами - гетеротрофных СРБ; либо за счет рассеянного органического вещества пород: ЦРБ, гидролизующих целлюлозу до низших кислот и спиртов; бродильщиков, преобразующих продукты гидролиза органических полимеров; олиготрофов и копиотрофов, развивающихся за счет экзометаболитов бродильщиков.
Численность и биоразнообразие микроорганизмов эколого-трофических групп в осадочных породах, вскрытых ВПС-1 3.4.1. Особенности результатов выделения культивируемых микроорганизмов
В табл. 3.4.1 представлены результаты определения численности микроорганизмов разных эколого-трофических групп путем высева кернов пород в элективные питательные среды. Как показывают данные таблицы, результаты высева кернов пород в элективные среды подтвердили активность шести эколого-трофических групп, выделенных на основе маркерного анализа: ВОБ, СРБ, МОБ, УОБ, ЦРБ и бродильщиков. Культивируемые автотрофные гомоацетогены не были обнаружены. Признаки роста автотрофных СРБ были зафиксированы только при высеве в элективную среду пробы аргиллита, гетеротрофные СРБ не были обнаружены в кернах обеих пород. Из образцов песчаника и аргиллита были изолированы культивируемые микроорганизмы всех трех групп, выделенных в структуре сообществ пород не на основе маркерного анализа: олиготрофов, копиотрофов и метаногенов. На плотных питательных средах из образцов песчаника и аргиллита были выделены олиготрофные, копиотрофные, алканотрофные и метилотрофные изоляты. Большая часть изолятов, в которых бактерии являлись спорообразующими палочками, успешно, причем неоднократно, пересевалась на свежую среду.
Характеристика культивируемых копиотрофных микроорганизмов
Значения численности копиотрофов (NKon.) песчаника и аргиллита, определенные при помощи метода НВЧ с использованием сред РПБ и М2(2), представлены в табл. 3.4.1 и на рис. 12А, количество выделенных изолятов приведено на рис. 12Б. Как показано на рис. 12А, численность копиотрофов, как и количество изолятов, выделенных из каждой породы, были тем меньше, чем выше была температура. Исключение составляла зависимость распределения NKon. песчаника на среде М2(2) с максимальным значением численности при 37 С - 9,5x104 кл/г (табл. 3.4.1), - которое было недостоверно выше NKOn. при 28 С - 5,0x104 кл/г. Максимальные значения NK0I) аргиллита были получены при 28 С и мало различались на РПБ и М2(2):3,0х103и1,5х103кл/г, соответственно.
Количество копиотрофов песчаника на РПБ находилось, в целом, в пределах 2,95 - 4,7 lg NK01,./r породы (рис. 12А), а на М2(2) - от 2,5 до 5,0 lg NK0ll/r. Число копиотрофов аргиллита при 28, 37 и 60 С на РПБ находилось в пределах 3,5 - 2,65 lg NK0I1/r, на М2(2) - от 3,2 до 2,0 lg NKOn/r. Фредриксон и соавт. [118] установили, что численность культивируемых бактерий, выделенных на богатой питательной среде из осадочных отложений вадозной зоны (США, штат Вашингтон), вскрытых на глубинах 25 и 27 м, при температуре in situ (25 С) составила 2,4 и 5,5 lg КОЕ/г, соответственно. Согласно результатам нашего эксперимента (табл. 3.4.1), NKOn. песчаника на среде М2(2) при всех температурах была, в целом, выше, чем таковая аргиллита.
Однако при температуре горизонта NK0I1 песчаника и аргиллита на РПБ были близки - 9,0x10" и 9,5х 10 кл/г соответственно, что согласуется с содержанием Сорг. в породах. В песчанике и аргиллите оно было близко (табл. 2.3): 0,12 и 0,15% на породу соответственно.
При высеве кернов обеих пород в РПБ, а также аргиллита в М2(2), NK0II. при 28 С была больше, чем при 37 С, а характер зависимости распределения NKon. от температуры не соответствовал ожидаемому от микроорганизмов, «аборигенных» для пород, вскрытых ВПС-1. Возможно, среди копиотрофов песчаника и аргиллита присутствовали бактерии, попавшие в них в результате контаминации пород при бурении скважины.
Как показывают данные таблицы, из керна песчаника было выделено 27 изолятов в виде колоний: при 28 С - 7, при 37 С - 16 и при 60 С - 4 культуры. Шестнадцать изолятов из двадцати семи содержали, помимо бактерий, еще и дрожжи (табл. 3.4.14). Двадцать четыре изолята удалось пересеять и, в дальнейшем, поддерживать в культуре, на средах, используемых соответственно для их выделения из керна породы. Три изолята - ОИП28.3, ОЛП37.3 и ОИП60.1 - не пересеялись вовсе. Не удалось получить чистые культуры бактерий, применяя пересев изолятов в среду К с нистатином. Первыми на поверхности агаризованной среды появлялись плоские колонии, при микроскопировании которых были обнаружены клетки дрожжей. После отсева клеток полученных таким образом культур на свежую среду, в появившихся на ней колониях обнаруживались, как дрожжи, так и бактерии. Внешний вид колоний при этом изменялся от плоских - в виде пластинки на поверхности среды - до выпуклых - с каплевидным профилем и очень слизистой консистенцией.
Описание морфологии колоний и клеток микроорганизмов чистых и смешанных культур, выделенных из образца песчаника на олиготрофных средах, приведено в табл. П. 12, табл. 3.4.15 и 3.4.16. Как показывают данные табл. 3.4.15, шт. ПК37.4 был представлен грамположительными кокками. Бактерии из двадцати трех культур - чистых и смешанных - были грамположительными спорообразующими палочками. В непересеявшейся культуре ОИП28.3 также были обнаружены палочки со спорами (табл. П. 12). Наконец, два непересеявшиеся изолята - ОЛП37.3 и ОИП60.1 - содержали бесспоровые палочки.
Среди пересеявшихся олиготрофных изолятов, бактерии в двадцати культурах, были мезофильными (выделены при 28 и 37 С), спорообразующими грамположительными палочками, факультативно анаэробными, и обладали каталазной и оксидазной активностями (табл. 3.4.15, 3.14.16). Клетки из десяти культур были подвижными. На основе вышеперечисленных признаков, бактерии, обнаруженные в 20-ти вышеуказанных культурах, можно предварительно отнести к p. Bacillus [57]. Бактерии шт. ПК37.4 оказались единственными неспорообразующими из всех пересеявшихся культур, вследствие чего для их идентификации мы осуществили расшифровку липидного профиля шт. ПК37.4. Однако, фенотипическая характеристика культуры ПК37.4 (табл. 3.4.15) не соответствовала полученным результатам маркерного анализа. Таким образом, для идентификации шт. ПК37.4 требуется привлечение других молекулярных методов, например анализа последовательности нуклеотидов в гене, кодирующем 16S рРНК.
Олиготрофные изоляты песчаника обладали рядом адаптивных свойств для существования в подземной биосфере. Так, клетки смешанных культур ОЛП28.3, ОЛП37.4 и ОЛП37.7 - на среде М2(0,2) продуцировали внеклеточный пигмент розового цвета (табл. 3.4.15), что было отмечено ранее для смешанных культур алканотрофов (см. п. 3.4.6.5). Три перечисленных олиготрофных изолята успешно пересевались на РПАр, однако в этом случае пигмент не образовывали. Отмеченный факт является дополнительным свидетельством оптимальности среды М2(0,2) для выделения культивируемых олиготрофов из образца песчаника, поскольку известно, что, как правило, создание условий культивирования микроорганизмов, способствующие их хорошему росту, стимулируют и образование ими пигментов [17].
Почти все культуры олиготрофов, кроме термофильной ПК60.1, были способны фиксировать молекулярный азот (табл. 3.4.15, 3.4.16). Все олиготрофные культуры, как чистые, так и смешанные, были способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии глюкозу, а также смесь пропана с бутаном. Все мезофильные культуры (выделенные при 28 и 37 С), как чистые, так и смешанные, использовали смесь УВ.
