Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы.
1.1. Принципы эколого-эпидемиологической оценки территорий.
1.2. Методы определения генотоксического влияния окружающей среды.
1.2.1. Прокариотические тест системы для определения мутагенного потенциала загрязнения окружающей среды.
1.2.2. Эукариотические тест системы для определения ге-нотоксичности окружающей среды. 1.2.2.а. Низшие эукариоты.
1.2.2.6. Растительные тест системы.
1.2.2.В. Животные in vitro и in vivo.
1.3. Подходы к определению последствий загрязнения окружающей среды для человека.
Заключение
Глава II. Материалы и методы.
2.1 Растительные тест системы
2.2 Crepis capillaris L. как тест система для изучения мутагенного потенциала загрязнителей окружающей среды.
2.3 Использование традесканции для генетического монито ринга загрязнения окружающей среды
2.4. Соя (Glycine max (L.) Merill) как тест система для скрининга загрязнителей окружающей среды
2.5. Использование растений дикорастущей флоры для определения генотоксичности окружающей среды.
2.6. Методика определения загрязнения природных объектов
Глава III. Описание района исследования. 70
Глава IV. Растительные тест системы как чувствительный объект для обнаружения мутагенного потенциала тяжелых металлов 83
4.1. Определение мутагенной активности тяжелых металлов с использованием Crepis capillaris L. 84
4.2. Исследование мутагенной активности тяжелых металлов с использованием традесканции (клона 02). 87
4.3. Определение мутагенного влияния тяжелых металлов с использованием сои (Glycine max. (L.) Merill). 91
Заключение. 95
Глава V. Использование растительных тест систем для оценки генотоксического влияния отходов горно-обогатительного комбината. 100
Глава VI. Оптимальные методы оценки генотоксичности почв. 106
Глава VII. Виды дикорастущей флоры как объект для генетического мониторинга загрязнения окружающей среды. 117
Глава VIII. Анализ состояния здоровья взрослого населения в изучаемых районах.
8.1. Естественное движение населения.
8.2. Заболеваемость в районе расположения вольфрамо-молибденового комбината и в контрольных районах.
8.3. Сравнительный анализ частоты онкозаболеваний в зоне расположения ТГОК и контрольных регионах.
Заключение
Глава IX. Частота заболеваний, обусловленных генетическими причинами в исследуемых районах
- Принципы эколого-эпидемиологической оценки территорий.
- Определение мутагенной активности тяжелых металлов с использованием Crepis capillaris L.
- Использование растительных тест систем для оценки генотоксического влияния отходов горно-обогатительного комбината.
Введение к работе
Глава I. Обзор литературы.
1.1. Принципы эколого-эпидемиологической оценки территорий.
1.2. Методы определения генотоксического влияния окру
жающей среды.
' 1.2.1. Прокариотические тест системы для определения мутагенного потенциала загрязнения окружающей среды.
1.2.2. Эукариотические тест системы для определения ге-нотоксичности окружающей среды. 1.2.2.а. Низшие эукариоты. 1.2.2.6. Растительные тест системы. 1.2.2.В. Животные in vitro и in vivo.
1.3. Подходы к определению последствий загрязнения окру
жающей среды для человека.
Заключение
Глава П. Материалы и методы.
Растительные тест системы
Crepis capillaris L. как тест система для изучения мутагенного потенциала загрязнителей окружающей среды.
2.3 Использование традесканции для генетического монито
ринга загрязнения окружающей среды
Соя (Glycine max (L.) Merill) как тест система для скрининга загрязнителей окружающей среды
Использование растений дикорастущей флоры для определения генотоксичности окружающей среды.
2.6. Методика определения загрязнения природных объектов ^
Принципы эколого-эпидемиологической оценки территорий
Современный этап развития общества характеризуется нарастанием экологических проблем и их глобализацией. При этом наблюдается явный недостаток исследований по оценке влияния разнообразных экологических факторов на экосистемы и здоровье населения на региональном и локальном уровнях.
Сидоренко Г.И. и Кутепов Е.Н. (1994) обратили внимание на тот факт, что к настоящему времени уже накоплен значительный объем данных по воздействию на здоровье населения отдельных генотоксических факторов окружающей среды, но нет критериев оценки эколого-гигиенических ситуаций на отдельных территориях с позиций ущерба для здоровья населения, отсутствуют единые методологические подходы к эколого-гигиенической оценке изменений здоровья населения в связи с воздействием антропогенных факторов окружающей среды.
В.Г. Дружинин (2003) отмечал, что в современных популяцион-ных токсико-генетических исследованиях интенсивно разрабатываются подходы к оценке генетического здоровья населения. Но такие исследования проводятся, как правило, на контингентах, имеющих контакт с генотоксикантами на производстве. Вместе с тем, до сих пор дискутируется проблема оценки кластогенного действия промышленных загрязнений в приложении к большим группам населения, не контактирующего с генотоксикантами профессионально, но проживающих в условиях реальной мутагенной нагрузки.
При действии генотоксикантов нарушается репродуктивная функция человека, снижается рождаемость, увеличивается частота спонтанных абортов на разных этапах беременности, частота врожденных пороков, мертворождений, возрастает смертность детей в перинатальном периоде (О.П. Романенко и С.К. Клюева. 2004). Кроме того, они обусловливают до 30% задержек умственного развития, 10% бесплодия супружеских пар, а так же сотни генных болезней и заболеваний с генетической предрасположенностью (Дурнев А.Д. 2001).
Поэтому давно назрела необходимость проведения генетического мониторинга для выявления генотоксического влияния загрязнения окружающей среды, как на местную биоту, так и на население загрязненных регионов.
Как отмечали Л.П. Сычева с соавт. генетический мониторинг популяций человека проводится на двух уровнях. Первый - это клеточный, когда регистрируются генетические повреждения клеток человека в исследуемой популяции. Основным методом в данном случае является учет клеток с хромосомными аберрациями в культуре лимфоцитов. Кроме этого широко внедряются и совершенствуются неинвазивные методы. А именно — полиорганный микроядерный тест на буккальных эпителио-цитах, клетках назального и урогенитального эпителия (Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях. 2007).
Второй - это генетический мониторинг на уровне организма, когда учитываются последствия этих повреждений. В этом случае учитывается частота злокачественных новообразований, врожденных пороков развития, перинатальная смертность и ряд других показателей.
Общеизвестным показателем генетического повреждения соматических клеток являются онкологические заболевания. Поэтому данные по частоте злокачественных новообразований могут быть основой для проведения генетического мониторинга.
Другим следствием повреждения соматических клеток могут быть мультифакторные заболевания. Рост такого рода заболеваний может быть в определенной степени обусловлен устойчивым изменением экспрессии генов из-за токсического влияния загрязненной окружающей среды на организм.
Последствиями повреждения половых и эмбриональных клеток является рост частоты спонтанных абортов за счет внутриутробной ги бели плода, врожденных пороков развития и др. Поэтому, как отмечают авторы, «... наиболее полно в настоящее время можно проводить мониторинг последствий генетического повреждения клеток человека путем регистрации злокачественных новообразований, частоты врожденных пороков развития и перинатальной смертности». Там же отмечено, что регистры позволяют анализировать только отдаленные по времени события, причем далеко не все.
Одной из недавних работ по генетическому мониторингу, в которой использовался метод учета генетических повреждений соматических клеток человека в исследуемых популяциях, является работа В.Г. Дружинина (2003). В данной работе представлены результаты изучения частоты хромосомные нарушения у населения крупного промышленного региона (на примере Кемеровской области). Исследуемыми территориями были: крупные промышленные города - г. Кемерово и г. Новокузнецк, которые входят в число 20 наиболее химически загрязненных городов на территории РФ. Также небольшие шахтерские города и поселки, и ряд непромышленных населенных пунктов. Автор отмечает, что у населения крупных промышленных городов наблюдался более высокий уровень хромосомных аберраций и ведущей причиной увеличения частоты цитогенетических повреждений в данной группе являлись факторы загрязнения городской среды.
Определение мутагенной активности тяжелых металлов с использованием Crepis capillaris L
Одной из первых тест систем, широко применявшихся для цитоге-нетических исследований, была скерда зеленая (С. capillaris L.) (Дубинина Л.Г. 1978). В целях же исследования мутагенного влияния окружающей среды она использовалась не так часто.
Нами были проведены исследования мутагенного потенциала выше указанных металлов с использованием этой тест-системы. Были определены их токсические и мутагенные концентрации. В табл. 1 приведены сведения о низших мутагенных субтоксических концентрациях неорганических соединений этих металлов. Часть сведений о мутагенном влиянии серебра, свинца и меди взята нами из ранее опубликованных работ (Реутова Н.В., Шевченко В.А. 1991, 1991а; Реутова 2001). Данные по мутагенному влиянию хрома и вольфрама были взяты из работы Гогуа М.Л. (2003). Обработка растворами солей тяжелых металлов во всех случаях проводилась в течение 42 часов, методика проведения всех опытов была идентичной.
Как видно из табл. 1, спонтанный уровень мутаций в контролях был разный. Возможно, это связано с тем, что опыты проводились в разное время и сроки хранения семян были разными. Как известно, с увеличением срока хранения семян спонтанный уровень мутаций увеличивается (Дубинина Л.Г. 1978). В наших опытах спонтанный уровень мутаций в контролях колебался от 0,05% до 0,34%. На такой же не стабильный уровень мутаций в контролях у ряда растительных тест-систем (в частности у Трад-ВТН) обращали внимание P. A. White и L.D. Claxton (2004) в своем обзоре по генотоксическому влиянию почв. Они отмечали, что только у Viciafaba этот показатель отличался стабильностью.
Наиболее токсичными для данного растения оказались соединения ртути. Их токсическая концентрация составила 6 10" М. Следующим по токсичности было серебро - 10"5М. Далее: хром и свинец - 10"4М; кад-мий — ЮМ; молибден- 10" М и вольфрам — 10" М. Растворимость иоди-да меди составляет 10"5М, и эта концентрация не была токсической, хотя медь в виде медного купороса токсична в концентрации 10"4М (Реутова Н.В. 2001). Таким образом, по мере убывания токсичности, исследованные тяжелые металлы образовали следующий ряд: Hg Ag Cr6+, Pb Cd, Cu Mo6+ W6+. Следует отметить, что токсические концентрации ртути и серебра почти совпадают, токсическая концентрация ртути примерно в два раза выше, чем у серебра, токсические концентрации остальных металлов отличаются на порядок.
Что касается мутагенных свойств, то этот ряд активности несколько отличается от ряда токсичности: Сг6+ » Ag Hg Cd, Мо6+, Pb W6+ Си. Здесь на первом месте оказался хром, низшая из мутагенных концентраций которого составила 10"8М. По токсичности хром стоял на третьем месте. Мутагенные концентрации ртути и серебра вновь оказались почти одинаковыми - 110"6М и 310"6М соответственно и в обоих рядах активности они стоят рядом и в самом начале. Но следует отметить, что ртуть не проявила мутагенных свойств в виде нитрата, но была мутагенной в виде иодида даже в значительно меньшей концентрации. Медь оказалась весьма токсичной в виде медного купороса, но мутагенных свойств не проявила ни в одном соединении. Свинец по токсическим концентрациям совпадает с хромом, а по мутагенности значительно ему уступает. Кадмий в обоих рядах активности стоит на четвертом месте. Молибден по токсичности и мутагенности пятый. Свинец более токсичный, чем мутагенный. Таким образом, ряды токсичности и мутагенности не совсем совпадают. Самые значительные несовпадения относятся к шестивалентному хрому. Коэффициент корреляции между рядами токсичности и мутагенности составил 0,61, что свидетельствует о наличии корреляции между токсичностью и мутагенностью. Более токсичные металлы проявляют мутагенные свойства в более низких концентрациях.
Использование растительных тест систем для оценки генотоксического влияния отходов горно-обогатительного комбината
После проверки пригодности растительных тест систем для определения мутагенного потенциала тяжелых металлов, мы использовали их для определения возможных мутагенных свойств отходов предприятий цветной металлургии. Этим предприятием был Тырныаузский горнообогатительный комбинат (ТГОК). ТГОК занимается разработкой вольф-рамо-молибденового месторождения и обогащением добытой руды.
ТГОК свои отходы в виде пульпы по пульпопроводу перекачивает в хвостохранилище, расположенное на берегу р. Баксан. В результате высыхания пульпы формируется хемозем, а на верху расположено озеро со свежей пульпой, которое частично сформировано также и водами р. Гиж-гид. Вода из озера фильтруется через всю толщу отвалов и в виде дренажных вод стекает в р.Баксан. Мы проводили исследование генотоксичности пульпы и дренажных вод с использованием всех трех растительных тест систем — С. capillaris L. (хромосомные аберрации в корневой меристеме), Трад-ВТН (мутации по окраске в волосках тычиночных нитей) и Glycine max. (L.) Merrill, (соматические мутации на листьях).
В опытах с С. capillaris L. и дренажные воды, и особенно пульпа были токсичными. В проростках было мало делящихся клеток (табл. 5).
Основным типом мутаций были делеции самой крупной А хромосомы и в меньшей степени D хромосомы. Именно с таким типом мутаций мы встречались в случае обработки и другими тяжелыми металлами. Уровень мутаций для дренажных вод был в 5 раз выше, чем в контроле, а для пульпы - в 11,7 раза. В качестве контроля во всех случаях использовалась водопроводная вода.
Второй использованной тест системой была Трад-ВТН клона 02 (табл. 6). Пульпа оказалась очень токсичной для данного растения. Черенки после обработки погибли, поэтому эти данные в табл. 6 не приведены. Дренажные же воды вызывали повышение уровня мутаций в 45 раз.
Таким образом, тест-система Трад-ВТН оказалась очень чувствительной к такому типу загрязнений.
Биттуева М.М. (2004) проводила тестирование сточных вод этого же горно-обогатительного комбината с использованием третьей растительной тест-системы — сои. И дренажные воды, и пульпа оказались токсичными и для этой тест-системы, поскольку наблюдалось снижение всхожести (табл. 7). Проявилось и их тератогенное действие, которое выразилось в появлении растений с утратой листа в сложном тройчатом листе и срастании листовых пластинок у первых двух простых листьев, что свидетельствует о повреждении точек роста Подробный анализ пятен, появляющихся на листьях вследствие различных типов мутаций, представлен в табл.8. В сравнении с контролем у растений со светло-зелеными листьями наблюдалось увеличение числа темно-зеленых пятен, причиной появления которых считают как обратные генные мутации, так и нерасхождения хромосом, когда компонент из моносомных клеток не развился, а также приобретение клеткой Yn фрагмента, возникшего в результате делеции в ближайшей клетке. Отмечено также и значительное увеличение числа двойных пятен, обусловленных соматическим кроссинговером. На листьях желтых растений отмечалось увеличение количества светло-зеленых пятен, причиной которых являются обратные генные мутации. Появления очень темно-зеленых пятен на темно-зеленых листьях, обусловленных нерасхождениями хромосом, не наблюдалось.
