Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Биохимическая роль селена для животных и человека 13
1.2. Эколого-биохимическое значение селена для растений 24
1.2.1. Поступление и содержание селена в растениях 24
1.2.2. Метаболизм и транспорт селена в растениях 32
1.2.3. Микроэлемент селен и окислительный стресс 34
1.2.3.1. Понятие окислительного стресса в растениях 34
1.2.3.2. Антиоксидантная система защиты растений 42
1.2.3.3. Антиоксидантные и прооксидантные свойства селена в растениях 54
1.3. Методы определения селена в природных объектах 57
Глава 2. Объекты и методы исследования 64
2.1. Объекты исследования 64
2.2. Методы анализа растительного материала 66
Глава 3. Экспериментальная часть 70
3.1. Особенности пробоподготовки и оптических методов определения селена в растительном материале 70
3.1.1. Особенности пробоподготовки растительного материала при количественном определении в нем селена 70
3.1.2. Особенности оптических методов определения селена в растительном материале 72
3.2. Исследование кормовых растений различных районов Калининградской области на содержание в них селена 82
3.3. Экологические аспекты накопление селена растениями ячменя 84
3.3.1. Накопление селена ячменем на различных стадиях онтогенеза 84
3.3.2. Влияние кислотности почвы на накопление селена ячменем 85
3.3.3. Распределение селена в различных органах ячменя 87
3.3.4. Влияние селеновой добавки на накопление ячменем биомассы 88
3.4. Влияние селена на биохимические показатели растений при окислительном стрессе 91
3.4.1. Влияние микроэлемента селена на устойчивость растений капусты китайской к окислительному стрессу, вызванному светом повышенной интенсивности и недостатком цинка 91
3.4.1.1. Микроэлементный состав растительных образцов 91
3.4.1.2. Влияние интенсивности света на развитие окислительного стресса и состояние антиоксидантных ферментов у растений капусты китайской 93
3.4.1.3. Влияние микроэлемента селена на развитие окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка, в растениях капусты китайской 95
3.4.1.4. Влияние микроэлемента селена на активность антиоксидантных ферментов в растениях капусты китайской в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка 98
3.4.2. Влияние микроэлемента селена на устойчивость растений ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом повышенной интенсивности и дефицитом цинка 101
3.4.2.1. Влияние микроэлемента селена на развитие окислительного стресса у растений ячменя 101
3.4.2.2. Влияние микроэлемента селена на активность антиоксидантных ферментов в растениях ячменя в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка 105
3.4.2.3. Влияние микроэлемента селена на накопление в растениях ячменя низкомолекулярных антиоксидантов в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка 109
Глава 4. Обсуждение результатов 116
Выводы 139
Библиографический список 141
- Биохимическая роль селена для животных и человека
- Объекты исследования
- Особенности пробоподготовки растительного материала при количественном определении в нем селена
Введение к работе
Актуальность темы.
Селен относится к эссенциальным микроэлементам, необходимым для нормальной жизнедеятельности организма человека и животных. При этом в последнее время все большее внимание привлекает регуляторная роль селена в организме и, прежде всего, его антиоксидантные свойства. Селен входит в структуру активного центра фермента глютатионпероксидазы, участвуя таким образом в поддержании в клетке перекисного гомеостаза [Flohe et al., 2000; Arthur 2000; Племенков, 2007]. Недостаток селена в рационе питания -основного источника поступления селена в организм - приводит к уменьшению уровня глютатионпероксидазы, что способствует снижению устойчивости организма к окислительному стрессу и развитию различных заболеваний.
Различные исследования последних лет показали, что во многих северо- и среднеевропейских странах (Германии, Австрии, Финляндии, Дании, Норвегии) содержание селена в кормовых растениях ниже установленного минимального порога [Hoesch, 1999]. Данных о селеновом статусе культурных и кормовых растений Калининградской области представлено не было, но, исходя из ее географического положения, можно предположить наличие селенодефицита, поэтому исследование особенностей накопления селена является особенно актуальным, в том числе и с целью изучения возможности применения селеносодержащих удобрений для повышения обеспеченности данным микроэлементом растений, животных и человека.
Изучение поступления селена в растения и влияющих на это факторов имеет также большое значение для раскрытия функций селена в растительных организмах. До недавнего времени считалось, что селен не является необходимым для растений микроэлементом, его признавали лишь «условно эссенциальным». Присутствие селена в растениях и способность аккумулировать его из сред служили лишь косвенными доказательствами
необходимости этого микроэлемента для растительных организмов. Но исследования последних лет показали, что селену принадлежит важная роль в усилении адаптивного потенциала растений. Так, описано положительное действие селена на растения в условиях окислительного стресса, вызванного УФ-излучением [Hartikainen, Xue, 1999; Xue, Hartikainen, 2000; Pennenen et al., 2002], гербицидами и гипотермией [Seppaenen et al., 2003; Прудников, 2007], старением растений [Xue et al., 2001; Djanaguiraman et al., 2004, 2005], солевым стрессом [Kong et al., 2005], выявлено повышение урожайности некоторых растений при добавлении низких концентраций селена [Graham et al., 2005].
В последнее время все большее распространение получает теория «окислительного стресса». Под этим состоянием понимают интенсификацию процесса накопления в клетках растений активных форм кислорода, к числу которых относят синглетный кислород ('Ог), супероксидрадикал ((V), перекись водорода (Н202) и гидроксилрадикал (ОН') [Arora et al., 2002; Halliwell, 2006]. Эти соединения являются сильными окислителями и способны повреждать структуру мембран, белков, ДНК [Пескин, Столяров, 1994; Davies, 1996; Мерзляк, 1999; Чиркова, 2002]. Активные формы кислорода могут образовываться в клетке и в процессе естественного метаболизма [Мерзляк, 1999; Чиркова, 2002; Asada, 2006]. Воздействие на растение неблагоприятных условий приводит к смещению динамического равновесия в клетке и провоцирует сверхнакопление активных форм кислорода, т.е. развитие в клетках растения окислительного стресса.
Свет функционально необходим для растений, трансформирующих и запасающих энергию солнечной радиации в химических связях органического вещества. Вместе с тем, он может являться агрессивным фактором, способствующим образованию в клетках растений избыточных количеств активных форм кислорода [Cakmak, Marschner, 1992; Rozema et al., 1997; Foyer, Noctor, 2000; Wu, v. Tiedermann, 2004]. Производство АФК в растениях заметно усиливается при действии на них совместно со светом
высокой интенсивности других неблагоприятных экологических факторов, таких, например дефицит минеральных веществ [Cakmak, Marschner, 1992; Polle, 1996; Cakmak, Engels, 1999]. Дефицит цинка является одним из наиболее распространенных нарушений минерального питания растений, который не только ведет к сокращению урожая, но и снижает устойчивость растений к неблагоприятным факторам окружающей среды [Graham et al., 1992; Cakmak et al., 1999].
Протекторный эффект селена в растениях в условиях окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности и дефицитом цинка еще не изучался. Кроме того, остается малоисследованным вопрос о механизме защитного действия селена в растениях. В связи с вышеизложенным актуальным является исследование влияния селена на антиоксидантную систему растений: как на функционирование антиоксидантных ферментов, так и на накопление низкомолекулярных антиоксидантов.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы явилось изучение экологических аспектов поступления микроэлемента селена и его влияния на некоторые биохимические показатели растений в условиях окислительного стресса. Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
Оптимизировать методику пробоподготовки растительного материала для последующего определения в нем селена. Сравнить эффективности фотометрического, флуориметрического и атомно-абсорбционного методов определения селена.
Изучить динамику накопления селена ячменем на различных стадиях онтогенеза в зависимости от концентрации внесенной селеновой добавки и кислотности почвы.
Исследовать влияние микроэлемента селена на развитие окислительного стресса в растениях китайской капуты и ячменя, вызванного светом повышенной интенсивности и дефицитом в питательной среде цинка.
Исследовать действие селена на ферментативную антиоксидантную систему растений (на активность супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпероксидазы, аскорбатпероксидазы, дегидроаскорбатредуктазы) в условиях окислительного стресса.
Изучить влияние селена на накопление ряда низкомолекулярных антиоксидантних соединений (каротиноидов, антоцианов, аскорбиновой кислоты, рутина, рибофлавина, глютатиона) в растениях ячменя, выращенных при окислительном стрессе.
Научная новизна.
Оптимизирована методика автоклавной минерализации растительного
материала под давлением с целью последующего определения в нем селена.
Впервые исследовано содержание селена в некоторых кормовых растениях
различных районов Калининградской области. Изучена динамика накопления
селена ячменем в процессе вегетации в зависимости от кислотности почвы и
вносимой селеновой добавки, а также установлены оптимальные
концентрации селена для накопления биомассы ячменем. Впервые
исследовано влияние селена на устойчивость растений китайской капуты и
ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом высокой
интенсивности и дефицитом цинка. Установлено положительное действие
селена на активность ряда ферментов (супероксиддисмутазы,
глютатионпероксидазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и
дегидроаскорбатредуктазы) и увеличение пула некоторых
низкомолекулярных антиоксидантов (каротиноидов, аскорбиновой кислоты, глютатиона). Выявлена компенсаторная функция селена в защите растений от окислительного стресса при недостатке цинка.
Основные защищаемые положения.
1. В процессе онтогенеза общее содержание селена в ячмене увеличивается, но интенсивность его накопления растениями снижается.
Ответная реакция антиоксидантной системы (антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов) растений зависит от характера стрессового воздействия.
Селен уменьшает негативные последствия окислительного стресса, вызванного дефицитом цинка и светом высокой интенсивности, за счет повышения антиоксидантного статуса растений.
Практическая значимость.
Исследование накопления селена растениями ячменя, а также изучение его влияния на устойчивость растений китайской капусты и ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом высокой интенсивности и дефицитом цинка, позволяют более полно раскрыть функции данного микроэлемента в растениях, и, тем самым, создают основу для использования селенсодержащих удобрений не только для повышения обеспеченности селеном растений, животных и человека, но и с целью увеличения урожайности растениеводческой продукции, особенно в условиях действия неблагоприятных экологических факторов.
Оптимизированная методика пробоподготовки растительного материала позволяет повысить точность количественного определения селена и сократить время анализа.
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры ботаники и экологии растений и кафедры медицинской экологии Российского государственного университета им. И. Канта, в курсах лекций «Экология растений», «Физиология растений», «Биохимия растений», «Витаминология», «Рациональное питание» а также на занятиях Большого практикума.
Апробация результатов работы.
Материалы диссертационной работы представлялись на: II
Всероссийской научно-практической конференции «Химическое
загрязнение среды обитания и проблемы экологической реабилитации нарушенных экосистем» (Пенза, 2004); научной конференции
Калининградского государственного университета (Калининград, 2004);
Международном научно-практического семинаре «Новые
энергосберегающие технологии в зоотехнии и ветеринарии» (Калининград, 2005); научном семинаре Института минерального питания растений и почвоведения Университета г. Киль «Успехи в минеральном питании растений» (Киль, 2006); V Российско-Германских Днях Экологии (Калининград, 2006); Всероссийской научно-практической конференция «Общие проблемы мониторинга природных экосистем» (Пенза 2007); V Международном конгрессе валеологов (Санкт-Петербург, 2007); VII Международной научной конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2007), V Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (г. Минск, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008); Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы» (п. ВНИИССОК, Московская обл., 2008); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и практика: проблемы и перспективы» (г. Калининград, 2008).
Основные результаты доложены и обсуждены на заседаниях кафедры медицинской экологии РГУ им. И. Канта (2004, 2005, 2007, 2008 гг.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, библиографического списка. Библиография представлена 369 источниками, из них 296 на иностранных языках. Общий объем работы составляет 169 страниц. Иллюстративный материал представлен 21 таблицами и 43 рисунками.
Благодарность.
Автор благодарит за ценные советы, помощь и содействие в работе научного руководителя доктора биологических наук, профессора Чупахину Галину Николаевну и кандидата химических наук, доцента Куркову Татьяну Николаевну. Особая благодарность директору ФГУ «ЦАС «Калининградский» доктору сельскохозяйственных наук, профессору Владимиру Ильичу Панасину за предоставление растительных образцов кормовых растений и возможность проведения флуориметрического анализа селена. Отдельная благодарность доктору Йошке Герендашу за внимательное руководство работой в Институте питания растений и почвоведения университета г. Киль и профессору Хайнриху Голдбаху за помощь в организации вегетационного опыта в Институте питания растений университета г. Бонн.
Автор выражает глубокую благодарность Немецкому экологическому фонду (Deutsche Bundesstiftung Umwelt) за содействие и финансовую поддержку, без которой осуществление данной исследовательской работы было бы невозможно.
Биохимическая роль селена для животных и человека
Микроэлемент селен был открыт в 1817 году шведским химиком Берцелиусом. До 1957 г селен и его соединения считали исключительно токсичными для организмов. Причиной этому были массовые отравления скота в некоторых районах США, вследствие высокого содержания селена в пастбищных растениях [Селен..., 1989]. В 1957 г. Schwarz и Foltz описали эксперименты по предотвращению развития некроза печени у крыс и экссудативного диатеза у цыплят очень низкими дозами селенита натрия, что положило начало использования соединений селена в терапии беломышечной болезни животных и других заболеваний [Schwarz, Foltz, 1957]. Тем не менее, в течение значительного периода времени после этого конкретные биохимические механизмы действия соединений селена были не -ясны. Процесс их изучения значительно ускорился после открытия в 1973 г. селензависимой глютатионпероксидазы [Rotruck et al., 1973]. Полученные за последнее время многочисленные данные свидетельствуют о том, что селен является необходимым для жизни человека и животных микроэлементом.
Главным источником поступления селена в организм животного и человека служат пищевые продукты. На рисунке 1 отражены основные пути миграции селена.
Вследствие геохимических различий, оценки воздействия селена на взрослых людей колеблются в разных районах мира от 11 до 5000 мкг/сутки, однако, обычно потребление селена с рационом лежит в пределах 20-300 мкг/сутки [Селен..., 1989]. Несмотря на то, что важнейшим источником селена для организма человека являются пищевые продукты, с питьевой водой (учитывая значительные потери данного микроэлемента из пищевых продуктов в процессе их подготовки и кулинарной обработки) может поступать до 10 % суточной нормы [Новиков, Плитман, 1984].
В среднем, в организме человека содержится до 14 мг селена [Hallbach, 2001]. Однако данная величина может варьироваться от 3-6 мг у жителей районов с недостаточным содержанием селена, например, Новой Зеландии, до 13-20 мг в районах с достаточным обеспечением селеном [Daniels, 1996]. В организме человека и животных селен присутствует во всех органах и тканях. Однако его распределение в различных органах зависит от ряда факторов и, прежде всего, от формы поступления в организм, уровня обеспеченности, антагонистического/синергинестического действия других питательных элементов [Combs, Combs, 1984; Wuermli et al., 1989]. Максимальная концентрация селена в нормальном состоянии отмечается в щитовидной железе, почках и печени. В период недостаточного поступления селена в организм его распределение в различных органах меняется: преимущественно селен концентрируется в тканях мозга, органах эндокринной системы и половой железе [Scheid, 1989; Oster, 2003].
В естественных условиях селен поступает в организм человека и животных главным образом в виде селенсодержащих аминокислот селенометионина (Se-Met) и селеноцистеина (Sec) растительного происхождения. Искусственное снабжение организма селеном при его алиментарном дефиците может осуществляться в форме селенита или селената натрия, а также в форме органических соединений селена микробиального происхождения. Все эти соединения селена легко всасываются в желудочно-кишечном тракте [Forth et al., 2001]. Однако судьба органической и неорганической форм селена в организме оказывается различной [Гмошинский и др., 2000].
Селенат- и селенит-анионы, поступающие в организм, быстро восстанавливаются ферментативным путем до селеноводорода. Некоторое количество образующегося селеноводорода соединяется с селенсвязывающими и транспортными белками за счет ковалентных или Ван-дер-Ваальсовых связей, образуя лабильный пул селена. Избыточные количества селеноводорода медленно подвергаются ферментативному метилированию с образованием, последовательно, метилгидроселенида, диметилселенида и катиона триметилселенония. Эти соединения селена экскретируются с мочей, а диметилселенид - в больших количествах также и с потом. Строго определенное количество селена, входящего в состав пула селеноводорода, через стадию селенофосфата включается в высокоспецифический процесс синтеза так называемых селен-специфических селенопротеинов, таких как глютатионпероксидазы I, II, III и IV, селенопротеины Р и W, 5 -йодотиронин дейодиназа, тиоредоксинредуктаза. У позвоночных селен входит в состав этих белков исключительно в виде остатка селеноцистеина.
Объекты исследования
В качестве объектов исследования использовались растения (листья) ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare L.) сортов Ria и Кишенев, китайской капусты (Brassica rapa L. subsp. chinensis (L.) Hanelt) пак чой, a также сборы многолетних злаковых (смесь трав — Arrhenatherum elatius L., Bromopsis inermis L., Dactylis glomerata L., Festuca protensis L., Phleum pratense L., Poa pratensis L.) и бобовых трав (смесь трав - Lathyrus pratensis L., Medicago falcata L., Melilotus albus L., Trifolium pratense L., Trifolium hybridum L., Vicia sepium L.), выращенных в Гурьевском, Краснознаменском, Полесском, Гвардейском, Багратионовском, Зеленоградском, Гусевском, Черняховском районах Калининградской области и применяемых в качестве корма, и для сравнения был проанализирован кукурузный силос (Нестеровский р-н), широко используемый в качестве корма в зимний период.
Для исследования накопления селена ячменем на различных стадиях онтогенеза в зависимости от внесенной в почву селеновой добавки, выращивание ячменя проводили в вегетационных сосудах на несменяемой почве (9 кг) с рН=5,5 и рН=6,35. Селен вносили в почву в виде раствора селената натрия в концентрациях 0,01 мг, 0,05 мг, 0,1 мг, 0,5 мг (в пересчете на кг почвы). Влияние селена на растения сравнивали с контрольным вариантом (без селена). Кроме того, в почву были внесены основные удобрения: 0,17 г азота в пересчете на нитрат аммония, 0,13 г Р2О5 в пересчете на гидрофосфат калия, 0,28 г К20 в пересчете на гидрофосфат и сульфат калия и 0,044 г MgO в пересчете на сульфат магния на кг почвы. Растворы удобрений и селената натрия вносили так, чтобы они не смешивались. Сначала в крайние точки квадрата поверхности почвы внесли основные микроэлементы, а селенат натрия вводили в центральную точку. После того, как почва высохла, ее перемешали и высадили ячмень. Полив растений осуществляли дистиллированной водой. Растения анализировали на трех стадиях: стадии кущения, стадии выхода в трубку и стадии созревания (фаза молочной спелости). На первых двух фазах развития растения проводили анализ всей надземной части проростков ячменя, на последней стадии — стадии созревания - отдельно анализировали стебель и колос.
Для исследования влияния селена на физиолого-биохимические показатели растений при окислительном стрессе в качестве объектов исследования использовали китайскую капусту и ячмень обыкновенный.
Семена капусты предварительно проращивали и высевали в кюветы с увлажненным перлитом. Выращивание растений проводилось при температуре 20-22 С в течение 14 суток. Полив осуществлялся питательным раствором, содержащим все необходимые макро- и микроэлементы, за исключением цинка и селена. На 15-е сутки растения пересаживали в вегетационные сосуды, объемом 2 л, и выращивали в гидропонной культуре на модифицированной нами питательный среде Хогланда (табл. 4). В опыте использовались растения, выращенные на питательной среде с добавлением селена или с исключением цинка. Селен добавлялся в форме селената натрия в концентрации 2 мкмоль/л. Первые две недели для молодых растений использовали разбавленный в два раза питательный раствор. Необходимость смены раствора при длительном выращивании растений устанавливалась по остаточному содержанию в нем нитрата (Экспресс-тест Markoquant). В течение 4 недель все растения выращивали при физиологически нормальном освещении (интенсивность света — 75 Вт/м", фотопериод 16/8 ч). Затем часть растений подвергали облучению светом более высокой интенсивностью -170 Вт/м"в течение 12 часов. Растительные образцы для проведения биохимических анализов отбирались непосредственно после световой экспозиции.
Особенности пробоподготовки растительного материала при количественном определении в нем селена
Подготовка пробы к анализу при определении селена состоит из нескольких этапов: 1) переведение органических форм селена в неорганические 2) удаление нитрит-ионов, мешающих определению селена, 3) восстановление селенат-иона до селенит-иона.
Чтобы избежать потерь селена на первой стадии, необходимо создавать окислительные условия. Большинство авторов предлагают для этой цели использовать смесь HNO3 + НСЮ4 [Голубкина, 1995; Торгов Демидова, 1998]. При этом значительное число исследователей осуществляет мокрое сжигание при температуре 150-170 С, а в определенные моменты минерализации температура может достигать 180 С [Голубкина, 1995], тогда как некоторые соединения селена улетучиваются уже при 70 С. Решением этой проблемы может служить минерализация образца в герметизированных автоклавах. В данном исследовании для минерализации проб использовались герметично закрывающиеся фторопластовые стаканы, устойчивые к действию концентрированных кислот, высоких температуры и давлению. В качестве окисляющих агентов использовали концентрированную азотную кислоту и перекись водорода. Во избежание бурного процесса навеска образца не превышала 0,5 г.
Важным элементом пробоподготовки растительных образцов к анализу является удаление нитрит-ионов, которые существенно мешают как атомно-абсорбционному, так и флуориметрическому определению селена. В литературе выделяют несколько способов удаления нитрит-ионов из минерализата: отгонка с водой, добавление хлорной кислоты, обработка проб пероксидом водорода [Голубкина, 1995]. Однако наиболее предпочтительным является использование амидосульфокислоты, которая является менее опасной в работе, чем хлорная и, как нами было установлено, более эффективна при удалении нитрит-ионов по сравнению с перекисью водорода.
Использование сильноокслительных условий при мокром озолении растительных образцов приводит к частичному переходу селена в селенат-ион. Так как в реакцию с тетрагидроборатом натрия (при атомно-абсорбционном определении) и с 2,3-диаминонафталином (при флуориметрическом определении) вступает только Se (IV), необходимой оказывается стадия восстановления Se (VI). Общепринятый прием превращения селената в селенит заключается в нагревании пробы с концентрированной соляной кислотой 20-30 мин при температуре 100-150 С [Голубкина, 1995; Торгов Демидова, 1998; Schloske et al., 2002]. Однако при нагревании минерализата с концентрированной соляной кислотой при температуре выше 70 С происходят значительные потери селена, вследствие образования им летучих соединений: Se2Cl2 и SeOCb, поэтому для избежания потерь селена на этой стадии подготовки растительные образцы после добавления соляной кислоты выдерживали в течение часа на водяной бане при температуре 70С.
Полноту разложения растительного материала и правильность измерений контролировали путем анализа стандартного растительного материала BCR-189 с известным содержанием селена (132±10 нг/г). При этом к стандартному образцу добавляли 0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 мкг/л селена.
