Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. НЕФТЯНОЕ ЗАГРЯЗНЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ 7
1.1. Состав нефти и специфика нефтяного загрязнения почв 7
1.2. Влияние нефтяного загрязнения на свойства почвы 13
1.3. Влияние нефтяного загрязнения на растения 19
1.4. Реакция микро- и альгофлоры на нефтяное загрязнение почв... 25
1.5. Технологии восстановления нефтезагрязненных почв 33
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 43
2.1. Объекты исследований 43
2.1.1. Почвы 43
2.1.2. Модельные опыты 45
2.2. Методы исследований 46
2.2.1. Физико-химические методы исследований почв и модельных экосистем 46
2.2.2. Микробиологические методы исследований 50
ГЛАВА 3. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВ БУРОВЫХ ПЛОЩАДОК 54
3.1. Нефтяное месторождение мегавала Карпинского на территории Калмыкии - краткий геологический очерк 54
3.2. Изменение физико-химических свойств почв буровых площадок под действием нефти и нефтепродуктов 58
3.3. Нефтепродукты и органический углерод в почвах 70
3.4. Содержание тяжелых металлов в почвах 73
3.5. Микробиологические показатели почв 80
3.6. Аммонифицирующая и нитрифицирующая способность почв 86
ГЛАВА 4. АКТИВИЗАЦИЯ БИОДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ 91
4.1. Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из нефтезагрязненных почв Республики Калмыкия 91
4.2. Экспериментальное изучение активизации процессов очистки нефтезагрязненной почвы 101
4.2.1. Химические параметры модельных экосистем в ходе экспериментальных исследований 102
4.2.2. Микробиологические параметры экспериментальных экосистем 125
ВЫВОДЫ 129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
ПРИЛОЖЕНИЕ 148
- Состав нефти и специфика нефтяного загрязнения почв
- Физико-химические методы исследований почв и модельных экосистем
- Нефтепродукты и органический углерод в почвах
Введение к работе
Актуальность темы. Нефть и нефтепродукты являются приоритетными загрязнителями окружающей природной среды. Уже сейчас отдельные нефтедобывающие территории по состоянию окружающей среды приближаются к районам экологического бедствия, т.к. наблюдаются глубокие изменения практически всех компонентов: воздуха, почв и структур почвенного покрова, грунтов и недр, поверхностных и подземных вод, биоты. Нефтяная промышленность по опасности воздействия на окружающую среду занимает третье место в числе 130 отраслей современного производства.
Республика Калмыкия является одним из основных нефтедобывающих районов в Нижнем Поволжье. В процессе добычи, транспортировки и переработки нефти происходит загрязнение окружающей среды, где особенно сильное воздействие испытывает почвенный покров, усиливает эти процессы аридность территории, сильные ветры, засоление почв и вод.
Одним из актуальных вопросов данной проблемы является разработка технологий восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Наиболее эффективным методом очистки окружающей среды в настоящее время считается биоремедиация (биологическое оздоровление) (Бельков, 2001), основные приемы которой базируются на активизации деятельности аборигенной микрофлоры внесением различных стимулирующих добавок или интродукции в загрязненную экосистему активных микроорганизмов-деструкторов.
Микроорганизмы играют определяющую роль в процессах самоочищения почв от нефтяного загрязнения (Гусев, Коронелли, 1981; Коронелли, 1996). Углеводородокисляющие микроорганизмы, способные к эффективному разложению нефтепродуктов в почве, как правило, выделяют из загрязненной почвы, подверженной загрязнению продолжительное время (Лысак, Лапыгина, 1994; Ягафарова, Скворцова, 1996). В отличие от
препаратов, созданных на основе чистой культуры или смешанной микробной культуры углеводородокисляющих микроорганизмов, накопительная почвенная микробная культура представляет собой сообщество разнообразных взаимно дополняющих друг друга почвенных микроорганизмов, адаптированное к конкретному нефтяному загрязнению и физико-химическим условиям почв (Кураков, Гузев, 2003). В то же время, снижается риск, связанный с возможной гибелью в почве или длительным периодом адаптации к данной почве интродуцируемых микроорганизмов.
Целью работы - охарактеризовать особенности нефтезагрязненных почв буровых площадок Республики Калмыкия и оценить роль и активность микроорганизмов в деструкции нефтяных углеводородов в почвах.
Для достижения указанной цели были намечены следующие задачи:
дать экологическую оценку нефтезагрязненных почв района Черных Земель Республики Калмыкия на основании анализа химического и микробиологического состава почв;
выделить из нефтезагрязненных почв буровых площадок комплекс углеводородокисляющих микроорганизмов;
3) идентифицировать выделенные микроорганизмы на основании
изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических
свойств и определить их углеводородокисляющую активность;
4) изучить эффективность использования накопительной микробной
культуры для активизации очистки нефтезагрязненных почв.
Научная новизна. Впервые проведены экологические исследования почв буровых площадок месторождений Состинское и Баирское Черных Земель Республики Калмыкия, расположенных в зоне полупустынь, характеризующихся аридным, умеренно теплым климатом. Из нефтезагрязненных почв буровой площадки Баирская выделена накопительная культура углеводородокисляющих микроорганизмов. Определен состав накопительной микробной культуры, выделены
бактериальные штаммы, усваивающие жидкие углеводороды сырой нефти. Полученные штаммы бактерий идентифицированы и отнесены к родам Arthrobacter, Acinetobacter, Bacillus и Rhodococcus. При совместном использовании накопительной микробной культуры и минеральных удобрений эффективность очистки в течение 12 месяцев достигает по суммарным нефтяным углеводородам 75,3 %, н-алканам - 99,0 %, полиароматическим углеводородам - 99,8 %.
Практическая значимость работы. Материалы работы могут быть использованы для дальнейших исследований при разработке комплексных технологий по восстановлению нефтезагрязненных почв, завершающей стадией которых является биоремедиация. Применение накопительной микробной культуры углеводородокисляющих бактерий для активизации деструкции нефтяных углеводородов нефтезагрязненных почв месторождения Баирское Республики Калмыкия подтверждено актом лабораторных исследований.
Штаммы углеводородокисляющих бактерий, выделенные из нефтезагрязненных почв и хранящиеся в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета, рекомендованы для разработки биопрепаратов и способов биоремедиации нефтезагрязненных почв аридной зоны.
Результаты исследований используются в учебном процессе института биологии и природопользования Астраханского государственного технического университета, и являются частью фундаментальной исследовательской темы «Исследование возможности восстановления техногенных экосистем для использования в народном хозяйстве».
Состав нефти и специфика нефтяного загрязнения почв
Ежегодно в мире добывается свыше 2,5 млрд. тонн сырой нефти. Потери при добыче (разливы или выбросы пластовой жидкости), транспортировке, переработке нефти составляют около 50 млн. тонн в год (Проблемы экологической безопасности...., 1999). Приводятся данные (Пиковский, 1988), что в нефтедобывающих районах региональный геохимический фон содержания углеводородов варьируют в достаточно широких пределах: от 10 до 500 мг/кг сухого веса почвы. В результате загрязнения нефтяными углеводородами большие площади оказываются непригодными для хозяйственного использования. Последствия загрязнения экосистемы нефтью и нефтепродуктами обусловлены ее свойствами.
Как природное химическое вещество, нефть - это раствор органических соединений сложного состава, где обнаружено более 450 различных веществ, в основном парафиновые (алканы), нафтеновые (циклоалканы), ароматические углеводороды (арены), олефины (алкены) (Попов и др., 1994).
Метановые углеводороды, особенно нормальные алканы (н-алканы) с короткой углеродной цепью, составляющие основную часть легких фракций нефти, оказывают наркотическое действие на живые организмы (Пиковский, 1988; Пономарева, 1998). Токсичность н-алканов ослабляется в присутствии нетоксичных углеводородов (Пиковский, 1988). Значительное влияние на природные системы оказывают твердые метановые углеводороды (парафины), содержание которых может достигать 15-20 %. Парафины содержатся практически во всех нефтях и влияют на вязкость нефти и устойчивость поллютантов в природных системах. Твердый парафин плохо разрушается и с трудом окисляется. Он может интенсивно мешать свободному влагообмену и дыханию почв, что усиливает восстановительные процессы и интенсифицирует деградацию биогеоценозов (Вшивцев, 1985; Пиковский, 1988). Циклоалканы могут стимулировать живые организмы и даже оказывать бальнеологическое действие (Исмаилов, 1988; Пономарева, 1998). Окисляются эти соединения достаточно трудно. Ароматические углеводороды - это наиболее токсичные компоненты нефти. Они являются хроническими токсикантами. Многие ароматические углеводороды характеризуются ярко выраженной индивидуальностью и канцерогенностью. Наиболее опасна группа полиароматических углеводородов (ПАУ), являющихся продуктами неполного сгорания ископаемого топлива и органических веществ. Некоторые низкомолекулярные ПАУ обладают острой токсичностью, а большая часть высокомолекулярных ПАУ относится к канцерогенам, тератогенам и генотоксикантам. Среди них наиболее опасными являются углеводороды с пятью конденсированными кольцами (3,4-бензпирен; 1,2,5,6-дибензантрацены и др.).
В сырой нефти содержатся газообразные углеводороды (до 5 %), вода (до 10 %), минеральные соли (в основном хлориды - до 4 %), тяжелые металлы, радиоактивные элементы. Соединения серы могут присутствовать в нефти в значительных количествах (0,001-14 %) и встречаться в виде серы элементарной, сероводородной, сульфидной, дисульфидной, меркаптановой и входящей в состав органических соединений, содержащих кислород и азот. Сернистая нефть распространена в Волго-Уральском и в отдельных районах Западно-Сибирского и других бассейнов (Пиковский, 1983; Добрянский, 2000). Кислородсодержащие соединения составляют в нефти до 10 %. Они представлены кислотами, фенолами, кетонами и эфирами, азот - моно-, ди- и триметилпиридинами и их производными. Основные группы минерализованных пластовых вод - хлоридно-натриевые (преобладающие) и хлоридно-кальциевые (Джангиров и др., 1976). Микроэлементы мышьяк, кобальт, медь, свинец, ртуть, никель, ванадий, железо, марганец и другие могут входить в состав нефтепродуктов, что является еще одним источником загрязнения окружающей среды. Наиболее высоки концентрации ванадия-0,006-0,04 % от веса нефти, никеля-0,01 % (Пиковский, 1988), урана-п 10"2-п 10"3 % (Карцев, 1959), ртути- 4 10" 5_4 Ю 6 %, железа до 1,4 10"4 % (Пиковский, 1988; Никифорова, 1989; Ладонин, 1995). В результате в почвах содержание микроэлементов (в частности, тяжелых металлов) и количество их подвижных форм могут увеличиваться в 1,5-2 раза.
Загрязнение нефтью и нефтепродуктами вызывает существенные изменения в морфологических свойствах почвы (Мукатанов, Ривкин, 1980; Солнцева, 1988; Груздкова и др., 1990). По мнению ряда авторов, глубина просачивания может ограничиваться только верхними горизонтами в пределах 5-15 см (Пиковский, 1988) или достигать одного - двух метров (Галиуллин, 1989). Иногда мощность битуминозного слоя достигает 40-50 см. При этом верхняя часть гумуссодержащего горизонта приобретает смолисто- черную окраску, происходит склеивание отдельных структурностей. В результате закупорки капилляров почвы нефтью сильно нарушается аэрация, создаются анаэробные условия, нарушается окислительно-восстановительный режим. В составе почвенного воздуха превалируют легкие токсичные фракции нефти, вредные как для растений, так и для многих микроорганизмов. Битуминизация ухудшает водопроницаемость и смачиваемость почвы, ее талые и дождевые воды на участках с высокой концентрацией мазута не впитываются в почву, а стекают по склонам. При попадании в почву тяжелые фракции нефти проникают на незначительную глубину и задерживаются верхними слоями грунта. Более легкие фракции проникают в нижележащие слои. Закономерности миграции-закрепления нефти и нефтепродуктов в почвенной толще определяются уровнями нефтеемкости-нефтеотдачи отдельных почвенных тел и их комбинациями в пространстве. Важнейшую роль играют генетические свойства почв, химический состав субстратов, а также плотность и вязкость нефтепродуктов (Odu, 1972). На сильно загрязненном участке глубина проникновения нефти и нефтепродуктов может достигать значительных величин, например, в почвах Западной Сибири - на глубину 1,5 м (Киреева, 1994), в южной тайге в дерново-подзолистых пахотных почвах - глубже 1,5-2,0м (Никифорова, 1989); в лесостепи в пойменных луговых почвах - глубже 2,0 м (Хазиев и др., 1981). Разуплотнение верхних горизонтов почв усиливает радиальное просачивание нефти, вследствие чего в пахотных почвах при одинаковой техногенной нагрузке нефть и нефтепродукты накапливаются в более глубоких горизонтах, чем в аналогичных целинных почвах (Никифорова, 1989; Славнина, Кахаткина, 1989; Груздкова и др., 1990). Наиболее глубоко (до 8,5 м) нефтепродукты продвигаются в субстратах легкого механического состава - гравистых отложениях, песках, супесях, а также трещиноватых породах (Гашева и др., 1990).
Физико-химические методы исследований почв и модельных экосистем
Отбор проб почв для изучения физико-химических показателей
проводили согласно ГОСТ 28168-89; ГОСТ 29269-91; Агрофизические методы..,
1966; Ринькис, 1967; Аринушкина, 1970; Агрохимические методы.., 1975;
Инструкция по контролю.., 1989; Минеев, 1989; Методические указания..,1992,
1994. Расчеты проводили согласно ОСТ 5681-84. Используемые методы
Л- исследования приведены в таблице 3. Для общей характеристики почв использовались следующие вытяжки:
а) Водная вытяжка из почв готовилась в соотношении почва : вода 1:5 — для определения сухого остатка; катионов Са2+, Mg2+, Na+ и анионов СГ, НС03", 9 9+ 94 SO4 " Катионы Са и Mg определяли по ГОСТ 26428-85 трилонометрически, сумму Са + и Mg + - титрованием трилоном Б в присутствии аммиачного буфера 9-І и индикатора хромоген черный. Определение Са - титрованием с трилоном Б в щелочной среде в присутствии индикатора мурексид. Анионы СГ определяли аргентометрически в присутствии индикатора хромата калия (Аринушкина, 1970). Анионы SO4 " определяли фотометрически по рассеиванию света осадком сульфатом бария при длине волны 490 мм (ГОСТ 26426-85), большие количества определяли гравиметрически. Анионы НСОэ" и СОЗ определяли ацидиметрически с индикаторами метиловый оранжевый и фенолфталеин (ГОСТ 26424-85). Катионы Na+ определяли по разности между суммой анионов и суммой катионов Са Mg в мг-экв/100г (ГОСТ 26427-85). Сумма солей определялась по сухому остатку.
б) Солянокислая вытяжка - для определения тяжелых металлов (ТМ) и микроэлементов в почве, окисление проводили по методу Ринькиса (1967, 1987), ГОСТ Р 250682-94. Для получения вытяжек с подвижными формами ТМ почва и 1н раствор соляной кислоты брались в соотношении 1:4. Для валовых форм использовали вытяжку с 6,0н азотной кислотой в соотношении 1:10. Почвенные растворы на содержание тяжелых металлов анализировались после концентрирования проб до 1:2, окисление проводили перекисью водорода и хлорной кислотой.
Определение валовых и подвижных форм Со, Pb, Cd, Mn, Си, Ni, Cr, Zn проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии с пламенной атомизацией на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Квант" (Сборник.., 1998; РД 52.18.289-90) в пламени ацетилен-воздух. Для исключения возможных помех со стороны компонентов матрицы определение тяжелых металлов выполняли методом стандартных добавок.
Определение железа проводили фотометрически с сульфасалициловой кислотой в ацетатном буфере рН 4,5 (Минеев, 1989).
Определение молибдена проводили экстракционно-колориметрическим методом: Мо + в кислых водных растворах в присутствии восстановителя SnCb восстанавливается до Мо5+образуя с роданидом (CNS") комплекс, который экстрагировали изоамиловым спиртом (ГОСТ Р 50689-94).
Определение бора проводили фотометрическим методом (с хинализарином в концентрированной серной кислоте) и на пламенном фотометре ПАЖ-1.
в) Солевые вытяжки использовались для определения подвижных форм N, Р, К; рН, емкости поглощения, суммы обменных оснований.
Определение легкогидролизуемого азота проводили по ГОСТ 26107-84. Азот переводится в ион аммония, который в щелочной среде с реактивом Несслера образует йодистый меркураммоний, придающий раствору желтую окраску, интенсивность которой зависит от концентрации аммония.
Определение подвижных форм фосфора и калия проводили по методу Кирсанова в модификации ЦИНАО ГОСТ 26207-91. Фосфаты образуют комплекс с молибденовой кислотой, восстановление проводили сульфитом натрия и гидрохиноном.
Определение калия и натрия проводили методом пламенной фотометрии при длинах волн 766,5 нм и 589,0 нм по ГОСТ 26207-91.
Определение обменного кальция и магния проводили методами ЦИНАО (ГОСТ 26487-85). Емкость поглощения определяли по методу Аскинази: после разложения карбонатов соляной кислотой, почву обрабатывали буферным раствором хлорида бария с рН 6,5. Гидролитическая кислотность (Н) определяли по методу Каппена в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26212-91).
Определение нитратов и ионов аммония проводили в вытяжках алюмокалиевых квасцов (N-N03) и сульфата калия (N-NH4) потенциометрическим методом с ионселективными электродами по ГОСТ 26951-86,26489-85.
Определение гумуса и органического углерода (Сорг) проводили по методу Тюрина в модификации ЦИНАО (ГОСТ 26213-84; 26213-91). Принцип метода основан на окислении органического вещества почвы хромовой кислотой до образования углекислоты, титрование избытка окислителя проводили солью Мора с индикатором - фенилантраниловая кислота. рН солевой (КС1) и рН водной вытяжки определяли потенциометрическим методом с водородным электродом по ГОСТ 26483-85.
Определение нитрифицирующей и аммонифицирующей способности почв проводили на основании определения азота-аммония (N-NH4„ ) и азота-нитратов (N-NO3), накапливающихся в почве при компостировании при оптимальных для развития нитрифицирующих и аммонифицирующих микроорганизмов, температуре и влажности.. Образцы почв были предварительно высушены, измельчены и просеяны. При компостировании навеску подготовленной почвы помещали в емкость, распределяли ровным слоем по дну, и увлажняли дистиллированной водой из расчета 60 % капиллярной влагоемкости, закрывали крышками, и помещали на 7 суток в биологический термостат с автоматической регулировкой температуры (28+1)С. Два раза - на 3 и 5 день приоткрывали крышки технологических емкостей с почвой на 10 минут. Содержание нитратов и аммония в исходной почве до и после компостирования определяли с помощью ионселективных электродов. Методы определения нефтяных углеводородов. В образцах исходной почвы и почвах модельных экосистем определение нефтепродуктов производили гравиметрически по выходу веществ гексанового экстракта согласно инструкции по контролю за состоянием на объектах предприятий Миннефтепрома (РД 3901470988-015-90; ВНИИТИ, 1989). Экстракцию углеводородов и битуминозных веществ нефти осуществляли вначале хлороформом, затем гексаном, высушивали, пропуская экстракт через колонку с окисью алюминия. PDC-спектры веществ гексановых экстрактов были сняты на спектрофотометре СФ-22, для съемки делали мазок на пластинку покрытую хлоридом натрия. РЖ-спектры почв были сняты на спектрофотометре СФ-29 с использованием КВг -техники
Концентрацию н-алканов и полиароматических углеводородов (ПАУ) в исходной почве и почвах модельных экосистем в ходе эксперимента определяли с использованием газового хроматографа GC-17A SHIMADZU при следующих условиях: газ-носитель - водород, колонка - медный капилляр диаметром 0,25 см, длина колонки - 25м, неподвижная фаза - апиезон L, давление водорода на входе в колонку 0,8 атм, линейное программирование температуры 2 градуса в минуту, начальная температура 100 градусов. Экстракцию н-алканов и ПАУ из исследуемых образцов осуществляли гексаном (Инструкция..., 1999).
link3 Нефтепродукты и органический углерод в почвах link3 .
Нефть, нефтепродукты и другие близкие им по составу соединения, находящиеся в природной среде (почвах, грунтах, горных породах) имеют собирательное название «битуминозные вещества» (БВ). Сумму БВ называют битумоидами. При попадании нефти в почву происходят глубокие изменения химических, физических, микробиологических свойств почвы, а также нарушения растительного покрова. Из-за отсутствия установленных предельно допустимых концентраций при загрязнении почв нефтью и нефтепродуктами объективная оценка загрязнения проводится путем сравнения с фоном (естественным состоянием почв).
В исследуемых условно фоновых почвах (пробы брали на расстоянии 10 км за оградительным рвом буровых площадок) БВ не обнаружено. На территории буровых значение БВ колеблются в пределах 1,02-8,86 % (рис.6; табл. 10). На Баирской-1 наиболее высокое значение приурочено к устью -5,14 %, низкое 1,76 % - у дизеля. На территории Баирской-2 распределение идет в порядке убывания: устье — факел - емкости, а на расстоянии 50 м от устья уровень содержания БВ уже в 4,6 раза меньше, чем у устья и составляет 1,92 %. Баирская-3 менее загрязнена нефтью и нефтепродуктами. Показатели БВ у устья и факела соответственно 3,29 и 2,58 %. На территории Баирской-4 наиболее загрязненное также же устье скважины, у факела этот показатель понижается в 1,2 раза, а на расстоянии 50 м от устья уровень загрязнения снизился в 4,7 раза (рис. 6).
Если рассматривать объекты по мере удаления от источника загрязнения (табл. 10), то видно, что уровень загрязнения БВ снижается от устья скважин к фоновым территориям.
Содержание битуминозных веществ в почвах буровых площадок
Для Баирской-2 и 4 содержание БВ в почве на расстоянии 50 м от устья в среднем снизилось в 4,65 раза.
Еще одним важным показателем загрязнения почв органическими соединениями служит отношение органического углерода (Сорг.) к общему азоту (N общ) - C:N. В фоновых почвах отношение C:N практически одинаково и в среднем составляет 1,72. На территории буровых показатель C:N резко увеличивается, достигая значений 4,67-10,77, что объясняется повышением содержания органического углерода за счет техногенных потоков углерода.
Вследствие разрушения почвенных структур и диспергирования почвенных частиц снижается водонепроницаемость почв. В загрязненных почвах резко меняется состояние органического вещества почв и распределение в них Сорг.
Нефть и нефтепродукты, взаимодействуя с почвенными органическими соединениями и минеральными компонентами, резко меняют качественные и количественные характеристики органических веществ.Взаимодействие нефти и нефтепродуктов с гумусовыми кислотами приводит к значительному расширению отношений углерода к азоту, что ухудшает азотный режим почв. Таким образом, происходит резкое увеличение Сорг и незначительное изменение общего азота, что свидетельствует о техногенной природе углерода.
