Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Распространение и эпизоотология болезни 8
1.2. Патогенез диарей 11
1.3. Этиология диарей и ее формы 15
1.4. Биологические свойства и факторы патогенности возбудителя Е. coli 17
1.5. Принципы и средства фармакотерапии и профилактики при диареях телят и поросят 36
2. Собственные исследования 40
2.1. Материалы и методы исследований 40
3. Результаты исследований 45
3.1. Распространение эшерихиоза телят и поросят на фермах | Краснодарского края 45
3.2. Биологические свойства и факторы патогенности изолятов Е. coli, выделенных от телят и поросят на территории Краснодарского края 55
3.2.1. Серотиповой профиль изолятов Е. coli, выделенных от телят и поросят 55
3.2.2. Адгезивная и колициногенная активность изолятов Е. coli, циркулирующих на фермах Краснодарского края 60
3.2.3. Гемолитическая активность изолятов Е. coli 65
3.2.4. Чувствительность Е. coli к антибактериальным препаратам . 68
3.3. Разработка альтернативных методов индикации токсинообразования у Е. coli 71
3.3.1. Применение реакции коагглютинации для выявлениия у Е. coli
образования шигатоксинов 71
3.3.2. Применение модифицированной сорбитоловой среды для дифференциации Е. coli 0157 73
3.3.3. Способ биотестирования токсигенности Е. coli 79
3.4. Разработка комплексной этиопатогенетической профилактики и терапии при диареях телят и поросят на территории Краснодарского края 87
3.4.1. Эффективность имунофана при диареях молодняка сельскохозяйственных животных 87
3.4.2. Применение КД Тидрогемол" при диареях поросят и ее биологическое действие на организм 93
3.4.3. Применение антитоксической гипериммунной поливалентной сыворотки из местных штаммов против колибактериоза молодняка КРС и свиней 115
4. Обсуждение результатов исследований 122
5. Выводы 138
I 6. Практические предложения 141
7. Список литературы
- Патогенез диарей
- Биологические свойства и факторы патогенности возбудителя Е. coli
- Биологические свойства и факторы патогенности изолятов Е. coli, выделенных от телят и поросят на территории Краснодарского края
- Адгезивная и колициногенная активность изолятов Е. coli, циркулирующих на фермах Краснодарского края
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальнейших проблем современного животноводства является сохранность молодняка сельскохозяйственных животных. Желудочно-кишечные заболевания новорожденных телят и поросят продолжают оставаться одной из проблемных патологий современной ветеринарии как в нашей стране, так и в странах ближнего и дальнего зарубежья. Гибель новорожденных происходит, главным образом, вследствие болезней желудочно-кишечного тракта, а эшерихиоз занимает значительное место среди данной группы заболеваний (Полоцкий Ю. Е., Бондаренко В. М., 1986; Курашвили Т. К., 1992; Ургуев К. Р., Нажалов М. Н., 1998; Сидоров М. А., Субботин В. В., 1999; Rao D. S., 1990). В большинстве случаев данное заболевание обусловлено энтеропатогенными штаммами Е. coli (Коляков Я. Е., 1974; Урбан В. П., Найманов И. Л., 1984; Зароза В. Г., 1991). Несмотря на более чем вековой промежуток времени со дня открытия этиологической роли кишечной палочки в развитии диарей у новорожденных животных и внедрения массовых вакцинаций, эшерихиоз телят и поросят по-прежнему остается одной из наиболее острых проблем в ветеринарии.
Данное заболевание относят к многофакторным инфекциям. В связи с наличием множества возможных причин диарей молодняка сельскохозяйственных животных инфекционной и неинфекционной природы подчеркнута важность подтверждения диагноза колибактериоз (Anon, 1984). По основным культуральным и биохимическим свойствам патогенные Е. coli практически не отличаются от непатогенных представителей нормальной микрофлоры кишечного тракта (Бурлаков В. А., Родионова В. Б., Интизаров М. М., 2002).
На сегодняшний день установлено, что в большинстве случаев штаммы, вызывающие диареи как у детей, так и молодняка сельскохозяйственных животных, имеют одинаковый О-групповой профиль (Поляков Я. Е. с соавт., 1970; Зароза В. Г., 1991; Улиско И. Н., 1996). Наличие у Е. coli ряда биологических свойств и, прежде всего, большого
набора серологических вариантов, факторов адгезии и колонизации, способности токсинообразования, инвазивной активности, устойчивости к различным антибактериальным препаратам обеспечивают данному микроорганизму широкое распространение и циркулирование в организме животных и во внешней среде. Именно эти обстоятельства являются основной причиной недостаточно высокой эффективности коммерческих вакцин и традиционно осуществляемой этиотропной терапии.
В связи с этим, изучение биологических свойств и факторов патогенносте у циркулирующих на территории Краснодарского края возбудителей колибактериоза телят и поросят, а также совершенствование экспресс-методов лабораторной диагностики токсинообразования и других факторов патогенности у Е. coli являются актуальными, решение которых позволит рекомендовать практике более эффективные средства и меры борьбы и профилактики кишечных инфекций.
Цель и задачи исследований Целью работы было изучение распространения эшерихиоза, биологических свойств и факторов патогенности E.coli, циркулирующих на фермах Краснодарского края, а также разработка средств специфической профилактики и терапии на основе установленных факторов патогенности и изыскание методов альтернативной экспресс-лабораторной диагностики. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- изучить распространение и этиологическую структуру желудочно-
кишечных болезней телят и поросят в хозяйствах края.
изучить биологические свойства и факторы патогенности изолятов Е. coli, выделенных от телят и поросят.
изучить возможность применения модифицированной сорбитоловой среды для дифференциации Е. coli 0157.
разработать альтернативные методы индикации токсинообразования у Е. coli с помощью биотестирования токсигенности Е. coli и реакции коагглютинации (РКА на планшетах).
- разработать комплексную этиотропную и патогенетическую профилактику и терапию при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят на территории Краснодарского края.
Научная новизна. Изучены распространение, этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят и поросят на фермах Краснодарского края, биологические свойства и факторы патогенности Е. coli, выделенных от молодняка сельскохозяйственных животных. Впервые для установления токсигенных свойств Е. coli использовали инфузории стилонихии и реакцию коагглютинации (РКА на планшетах). Для дифференциации Е. coli 0157 разработана и использована модифицированная сорбитоловая среда. Разработана комплексная система профилактики и лечения эшерихиозов молодняка сельскохозяйственных животных с использованием имунофана, кормовой добавки «Гидрогемола» и гипериммунной антитоксической сыворотки и инактивированных антигенов из местных штаммов бактерий, полученных с учетом факторов патогенности Е. coli.
Практическая значимость. Установлено распространение эшерихиоза телят и поросят на территории Краснодарского края и этиологическая структура возбудителей, изучены некоторые механизмы развития колибактериоза с учетом биологических свойств и факторов патогенности, встречающихся штаммов Е. coli. Разработан, испытан и предложен практике метод индикации токсинообразования у Е. coli (биотестирование на стилонихиях). На способ изучения токсигенности кишечной палочки получен патент РФ № 2262529 от 20 октября 2005 года. Для выявления образования шигатоксинов применена реакция коагглютинации (РКА на планшетах). Для ускоренной дифференциации патогенных Е. coli 0157 предложена модифицированная сорбитоловая среда. На способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157 получен патент РФ № 2273661 от 10 апреля 2006 года. Разработана комплексная высокоэффективная система профилактики и лечения колибактериоза телят и
поросят с учетом серологического профиля возбудителей и их токсигенности, циркулирующих на территории Краснодарского края.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили одобрение на Ученом совете Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института, научной конференции, посвященной 80-летию Кубанского государственного аграрного университета (Краснодар, 2002 г.), а также на совещаниях зооветспециалистов Тимашевского, Каневского, Ейского и других районов Краснодарского края.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Основные положения, выносимые на зашиту:
- распространение и этиологическая структура эшерихиоза телят и поросят в
хозяйствах Краснодарского края.
- биологические свойства и факторы патогенности изолятов Е. coli,
выделенных от телят и поросят на территории Краснодарского края.
метод индикации токсинообразования у Е. coli с помощью биотестирования (инфузории-стилонихии) токсигенности Е. coli, применение реакции коагглютинации (РКА на планшетах) и полимеразно-цепной реакции для обнаружения образования шигатоксинов у Е. coli и модифицированная сорбитоловая среда для ускоренной дифференциации Е. coli 0157.
комплексная этиотропная и патогенетическая профилактика и терапия при диареях телят и поросят.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами и 12 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы содержит 163 источника, из которых 72 иностранных.
Патогенез диарей
Механизм развития колиинфекции у молодняка сельскохозяйственных животных и сейчас изучен слабо. Мнения большинства ученых относительно патогенеза данного заболевания сводятся к тому, что колибактериоз возникает в результате появления в кишечнике новорожденных животных большого количества патогенных Е. coli. Заселение слизистой кишечника патогенными эшерихий происходит очень быстро. Уже через 3 часа после инфицирования обнаруживаются прикрепившиеся к слизистой оболочке клетки кишечной палочки, а в течение суток они колонизируют тонкий кишечник на 60 % (Коляков Я. Е., 1970; Порохов Ф. Ф., 1984; Лаптев Н. Е., 1987; Зароза В. Г., 1991; Lemcke R. et al., 1957; Petkov M., 1980; Kirchner A., 1981; Tattini A., 1988; Bramilla P. G. et al., 1989).
Предрасполагающим фактором заболевания является резкая смена и дача трудно переваримых кормов, которые способствуют развитию дисбактериоза в кишечнике молодняка животных. Активное размножение энтеротоксигенных бактерий, обладающих гемолитическими, дермонекротическими, а в ряде случаев нейротропными свойствами, в необычных местах локализации объясняется тем, что антагонистическая микрофлора (молочнокислые, лакто-, бифидум- и другие бактерии) размножаются слабо, так как для своей жизнедеятельности им необходимо наличие витаминов, различных аминокислот, минеральных веществ, а в ряде случаев пуриновых и пиримидиновых оснований, и если таковых не находят в желудочно-кишечном тракте, то данная микрофлора погибает (Матюшев П. С, 1978; Тимошко М. А., 1990; Шитый А. Г. с соавт., 1993; Depelechin В. О. et al., 1985).
Экспериментально доказано влияние алиментаного кальция на микробиоциноз в кишечнике сельскохозяйственных и лабораторных животных. Низкое содержание кальция в рационе приводило к достоверному снижению численности молочнокислых бактерий и почти полному дефициту лактобацилл и бифидумбактерий на фоне резкого увеличения не ферментирующих лактозу эшерихий и других патогенных энтеробактерий (Воробьев А. А. с соавт., 1999; Суханов Б. П. с соавт., 1999).
Важным сдерживающим фактором чрезмерного размножения Е. coli имеет молозиво матери. Так, в создании устойчивости новорожденных телят к эшерихиозу наибольшее значение имеет молозиво первого удоя, так как в последующие дни содержание питательных веществ и защитных Ig в нем резко сокращается (ЗарозаВ. Г., 1991).
Э. К. Москвитина (1975) показала, что за счет лизоцимной и бактерицидной активности и секреторного Ig А, нейтрофилов и макрофагов, молоко в пищеварительном тракте поросят способно ингибировать патогенные бактерии, в том числе и Е. coli.
При дисбактериозе кишечника происходят не только количественные, но и качественные изменения биологических свойств, а соответственно и факторов патогенности Е. coli. Так, гемолитическая кишечная палочка, выделенная от поросят больных эшерихиозом, не только не нуждается в витамине В 12, но даже напротив, вырабатывает вещества, разрушающие и тормозящие его всасывание. Следовательно, можно считать, что дисбактериоз кишечника является причиной нарушения обмена веществ в организме, что в свою очередь сказывается на клиническом состоянии молодняка и его продуктивных качествах. Энтеропатогенные Е. coli поселяются в верхних отрезках тонкого отдела кишечника и интенсивно размножаются (1 : 4,3 млрд. микр. кл. в сутки), продуцируя в процессе жизнедеятельности энтеротоксины (Демаков Г. П., 1971; Gaad J., 1990).
В зависимости от биологических свойств и факторов патогенности Е. coli различают и типы ее взаимодействия с эпителием слизистой кишечника. Энтеротоксигенные кишечные палочки прикрепляются, колонизируют и поверхностно размножаются на энтероцитах, структурно не повреждая и не инвазируя их при этом. ЭТКП образуют цитотоксические LT и ST-энтеротоксины, нарушающие равновесие между секрецией и всасыванием жидкости эпителиальными клетками тонкого кишечника, вызывая при этом диарею.
Для энтеропатогенных и энтерогеморрагических эшерихий сущность патогенного действия определяется прикреплением к энтероцитам, после чего слущивают их микроворсинки, колонизируют плазмолемму и размножаются в цитоплазме, при этом происходит повреждение поверхности эпителия. ЭПКП сопровождается образованием эрозий и умеренным воспалением тонкого кишечника. ЭГКП синтезирует гемолизины и специфические цитолизины, воздействие их сопровождается общей интоксикацией и поражением внутренних органов, вызывая геморрагический колит.
Энтероинвазивные Е. coli прикрепляются к микроворсинкам, вызывая их разбухание и деструкцию, внедряются в цитоплазму эпителиальных клеток, размножаются в них, вызывая гибель. Бактерии распространяются в кишечном эпителии с проявлением цитотоксемии и эндотоксемии, сопровождается эрозиями, изъязвлениями и резко выраженным воспалением (Притулин П. И., 1975; Матюшев П. С, 1978; Полоцкий Ю. Е. с соавт., 1992; Бондаренко В. М., 1999; Тугаринов О. А. с соавт., 2001; Воротынцева Н. В. с соавт., 2001; Бурлаков В. А. с соавт., 2002; Moxley R. A., Francis D. Н., 1986; Bilkei G., 1991; Teylor D. J., 2000).
Под действием постоянно увеличивающейся концентрации экзотоксинов Е. coli происходит гиперстимуляция аденил- и гуанилциклаз, локализованных в цитоплазматической мембране энтероцитов. Вследствие чего происходит внутриклеточное накопление монофосфатов, которое приводит к повышению секреторной и снижению абсорбционной функции кишечного эпителия, последнее сопровождается профузной диареей, угнетением диуреза, нарушением кислотно-щелочного и вводно-солевого баланса (Bywater R. J., 1976; Kirchner А., 1981; Petzinger Е., 1984; Stiglimair-Herb M. Т. et al., 1986). Чаще всего каких-либо специфических морфологических изменений в слизистой кишечника не происходит, это связано с тем, что действие энтеротоксинов ограничивается только влиянием на клеточную мембрану энтероцитов, а именно медиаторную систему. В тоже время, особенностью эндотоксинов является цитолитический и анафилоксигенный эффект, результатом которого является разрушение клеток эпителия, дегенерация и атрофия ворсинок, эрозии и некроз пейеровых бляшек, повреждение кровеносных сосудов, нейронов, блокирование лимфоидно-макрофагальной системы, нарушение функции надпочечников и щитовидной железы, что чаще всего проявляется повышением температуры, вегетативной и сердечно-сосудистой патологией, диспепсическим синдромом (Deldar A. et al., 1984; Michaels F. H., Bauks К. L., 1988; Seimija Y. et al., 1992). He редки случаи когда одновременно действуют и эндо- и экзотоксины, а кроме того, и другие факторы патогенности Е. coli, что соответствующим образом отражается как на клиническом течении, так и на патолого-анатомической картине (Зароза В. Г., 1985; Хмелевская Д. В. с соавт., 1990).
Биологические свойства и факторы патогенности возбудителя Е. coli
Escherichia coli - типовой представитель рода Escherichia семейства Enterobacteriaceae. По своим морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам различные виды, разновидности и типы Е. coli не различаются между собой. Все они имеют форму прямой палочки с закругленными концами размерами 0,5 - 1,5 х 2,0 - 6,0 мкм, в мазках располагаются одиночно или парами, по Граму окрашиваются отрицательно. Многие имеют капсулу (микрокапсулу). В большинстве случаев бактерия подвижна (имеются и неподвижные штаммы), аэроб или факультативный анаэроб, оптимальной температурой для их роста является 37 С. Ферментирует глюкозу с образованием газа и кислоты. По способности утилизировать лактозу выделяются ферментирующие и не ферментирующие эшерихии, они различаются по подвижности, антибиотикочувствительности, антигенным свойствам. Е. coli оксидаза - отрицательна, каталаза -положительна, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, не образует сероводород, не проявляет уреазную и липазную активность, восстанавливает нитраты, желатину не гидролизует, молоко створаживает без пептонизации, часто редуцирует красители. К питанию не требовательна. Хорошо растет на обычных белковых средах, вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого вязкого осадка на дне пробирки, либо пленки или пристеночного кольца. На агаре образует мелкозернистые молочно-голубоватого цвета S-колонии с ровными или слегка волнистыми краями 0,3 - 0,5 см в диаметре, либо R-колонии с неровными краями.
Биохимическую дифференциацию бактерий производят как традиционным методом с использованием сред с углеводами и индикатором Андроде или полужидких сред с индикатором ВР, сред с мочевиной, сернокислым железом, фенилаланином, желатиной, агара Симонса, бульона Хоттингера (на сероводород), так и с использованием биохимических тест-систем. Наибольшее распространение в бактериологических лабораториях получили следующие наборы: пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии или стафилококки (ПБДЭ, ПБДС, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород), микромультисистема для дифференциации энтеробактерии (ММТЕ-1 и 2; НПО «Аллерген» г. Ставрополь), микротестсистема для определения активности микроорганизмов, энтеробактерии, стафилакокков (МТС-5У, МТС-12Е, МТС-С; НПО «Питательные среды», г. Махачкала), микротестсистемы для дифференциации стрептококков, стафилококков, энтеробактерии, неферментирующих бактерий и анаэробов; фирма «Лахема», Чехия). Для интерпретации полученных результатов на вышеназванных тест-системах используют компьютерные программы и каталоги кодов (Терехов В.И., 2000).
Биохимические свойства кишечной палочки изучали многие исследователи разных стран, однако, какой-либо корреляции между их ферментативной активностью не установлено (Притулин П. И., 1975; Бедоева 3. М., 1984; Коростелев А. П. с соавт., 1985; Определитель бактерий Берджи, 1997; Медицинская микробиология, 1999; Тугаринов О. А. с соавт., 2001; Hordzic Е., 1986; Рора et al., 1999).
Одним из важнейших факторов, регулирующих кишечный микробиоциноз, являются колицины - антибиотические вещества белковой природы. Образуемые некоторыми разновидностями Е. coli, шигелл и цитробактера, колицины были открыты A. Gratia еще в 1925 году. В бактериальной популяции колицины вырабатывают отдельные клетки, которые при этом погибают. Способность клеток продуцировать колицины может быть передана неколициногенным бактериям при совместном культивировании. Колициногенность является стойким наследственным признаком, утрата которого происходит редко, а временное снижение возможно. Она отражает способность Е. coli синтезировать колицины с антибактериальным действием в отношении семейства Enterobacteriaceae. Колициноустойчивость бактерий может быть обусловлена как устойчивостью к гомологичному бактериоцину, так и отсутствием на их клеточной поверхности соответствующих рецепторов (Кудлай Д. Г., Лиходед В. Г., 1966; Егоров Н. С, Баранова И. П., 1999; O Brien G. J., Chambers S. Т., 1996).
По P. Fredericq, Колициногенность - один из факторов вирулентности E.coli.
О.В. Бухарин с соавт. (2002) показал зависимость частоты выделения колициногенных эшерихий от тяжести течения заболеваний желудочно кишечного тракта. Так, он отметил, что в случаях обострений заболеваний желудочно-кишечного тракта доля колициногенных эшерихии составляет от 45 до 100 % по отношению ко всем выделенным энтеробактериям. В группе условно здоровых новорожденных и более старших группах доля колициногенных штаммов в среднем составляла менее 15 %.
По культуральным и биохимическим свойствам колициногенные и неколициногенные изоляты Е. coli не отличаются. Бактериальные изоляты из одного очага, как правило, продуцируют одинаковые типы колицинов. Колициногения используется как стабильная метка в эпидемиологической практике (Кудлай Д. Г., Лиходед В. Г., 1966; Бухарин О. В., Герасимов А. В., 1969;ЗарозаВ.Г., 1991).
Дифференцировка Е. coli основана на различиях в структуре поверхностных антигенов, среди которых выделяют полисахаридные (О), жгутиковые (Н) и капсульные (К) антигены, обозначаемые арабскими цифрами. В настоящее время обнаружен 171 вариант О-антигенов (01 -0171), 57 вариантов Н-антигенов (HI - Н57) и 90 вариантов поверхностных К-антигенов, однако в действительности имеется 164 группы по О-антигену, 55 сероваров по Н-антигену, так как некоторые представители из прежних О-и Н- серогрупп были исключены из вида Е. coli, но порядковые номера остались неизменными (Зароза В. Г., 1991; Бурлаков В. А., 2002; Levine М. М., 1984; Ewing W. Н., 1986).
Биологические свойства и факторы патогенности изолятов Е. coli, выделенных от телят и поросят на территории Краснодарского края
По данным авторов В. Г. Зароза, 1991; В. А. Бурлаков, 2002; М. М. Levine, 1984; W. Н. Ewing, 1986 и др., патогенные Е. coli обладают факторами патогенности, одними из которых являются колициногенная и адгезивная активность.
С помощью антигенов адгезии энтеротоксигенные штаммы Е. coli прикрепляются к эпителиальным клеткам кишечника, что позволяет им реализовать свои энтеропатогенные свойства, а с помощью колицинов -выживать в микробном сообществе, вытесняя неколициногенные штаммы.
Обнаружение адгезинов (фимбрий) и установление их типов у эшерихий, вьщеленных от поросят и телят на территории Краснодарского края, проводилось с помощью манозонезависимой реакции гемагглютинации (РГА). Результаты исследования отражены в таблице 10. фимбрии 1 типа (маннозочувствительные, неспецифические адгезины) 1- фимбрии 2 типа (маннозоустойчивые, специфические адгезины) 2- «-»- реакция гемагглютинации не происходит (штаммы Е. coli не обладают адгезивной активностью). Нами было протестировано 98 полевых штаммов Е. coli, при этом установлено, что у 56 (57,1%) из них имелись фимбрии, у 42 (43%) они отсутствовали. У адгезинпозитивных сероваров в 42 (75%) случаев фимбрии были представлены 1 (общим) типом, и в 14 (25%)- 2 (специфическим) типом.
Из 98 изученных полевых штаммов Е. соїі, у 32 (32,7%) обнаружены колициногенная активность. Было установлено, что серовары, продуцирующие колицины, либо имели фимбрии 1 типа 18 (56,3%), либо их вообще не имели 14(43,7%). Ни у одного полевого штамма Е. coli, обладающего специфическими адгезинами, не обнаружена колициногенная активность, что позволяет предположить отсутствие способности их продуцирования эшерихиями с фимбриями 2 типа.
Таким образом, у 57,1% полевых штаммов Е. coli, выделенных из патологического материала от молодняка крупного рогатого скота и свиней, обнаружена способность к выработке адгезинов и колицинов.
По данным краевой ветлаборатории и результатам собственных исследований, представленным в таблице 11, за последние 5 лет установлена изменчивость состава адгезинов сероваров Е. coli, выделенных от молодняка крупного рогатого скота и свиней.
Большее количество полевых штаммов Е. coli, имеющих адгезины К99, наблюдалось у телят в 2000 году - 37,8 %, у поросят в 2001 году-46,5 %, в среднем за 6 лет (1999-2004), процент встречаемости его составил у телят 20,3 %, у поросят 23,3 %; наибольший процент Е. coli с адгезином К88 установлен, у телят в 2002 году 29,4%, у поросят в 2000 году - 53,9 %, в среднем за период наблюдений составил у телят 18,5 %, у поросят 46,4%; адгезии А20 выявлен у Е. coli выделенные от телят в 2001 году в 64,2%, от поросят в 2003 году - 20,7%, в среднем - у телят 42,1%, у поросят 13,8%; наиболее часто варианты адгезина F41 выявлены у культур Е. coli, выделенных от телят в 2000 году 14,0%, от поросят в 2004 году - 7,5%, средний процент составил у телят 6,4%, у поросят 4,4 %; адгезивные варианты Е. coli 987Р чаще обнаруживали у телят в 2002 году 19,8%, у поросят в 2004 году-14,2%, процент выделения за период 1999-2004 гг. составил у телят 12,0%, у поросят 11,7%.
Количество полевых штаммов Е. coli не типированных имеющимися в наличии сыворотками составило 10 (0,6%) у телят и 7 (0,3%) у поросят.
Процент выделения Е. coli адгезиновных антигенов варьировал по годам исследования: К99 от телят от 5,9% до 37,8%, от поросят 13,8% до 46,5%; К88 от телят 12,2% до 29,4%, от поросят 34,9% до 53,9%; А20 от телят 10,9% до 64,2%, от поросят от 9,1% до 20,7%; F41 от телят от 2,1% до 14 %, от поросят от 1,2 % до 7,5%; 98 7Р от телят 7,3% до 19,8%, от поросят от 7,9% до 14,2%. При этом закономерности изменения или зависимости от года исследования не выявлено.
Соотношение антигенной структуры Е. coli, выделенных от телят и поросят за весь период исследования 1999-2004гг., представлено на рисунках 4 и 5. Специфические адгезины у Е. coli, выделенных от телят, чаще всего представлены А20 - 706 (42,1%), К99-341 (20,3%), К88-311 (18,5%), 987Р- 202 (12,0%) и реже всего F41-107 (6,4%). Специфические адгезины у Е. coli, выделенных от поросят, чаще всего представлены К88 - 968 (46,4%), К99 - 487 (23,3%), А20 - 287 (13,8%), 987Р - 245 (11,7%) и реже всего F41-91 (4,4%). Полученные данные свидетельствуют, что в настоящее время ведущая роль в развитии эшерихиоза у телят принадлежит Е. coli с адгезивным антигеном А20, а у поросят Е. coli К88.
Адгезивная и колициногенная активность изолятов Е. coli, циркулирующих на фермах Краснодарского края
В настоящее время выявление токсигенных кишечных палочек осуществляется с помощью таких методов как: твердофазный радиоиммунологический, ганглиозид-иммуноферментный, тест Бикена, реакция коагглютинации, культурально-клеточные исследования (цитотоксичность), проба отека мышиной лапы, легирование петель кишечника и анальная проба на мышах сосунах.
Часть обозначенных методов весьма трудоемки, другие дорогостоящи и трудновоспроизводимы, третьи дефицитны по используемым реагентам, а значит мало востребованы, некоторые из них не соответствуют требованиям комиссии по проблемам этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук.
Недостатком известных способов является отсутствие биотестирования токсигенности болезнетворных бактерий, таких как кишечная палочка (Е. соИ).
Целью нашей работы являлся поиск и разработка простого, экономичного, легко воспроизводимого, гуманного и достоверного метода определения токсигенности Е. СОІІ.
В качестве объекта для тестирования токсигенности Е. coli были выбраны инфузории, которые в настоящее время используют для индикации в кормах и пищевых продуктах токсикантов химического и грибного происхождения. В эксперименте изучали 4 вида инфузорий -парамеции, стилонихии, колподы и тетрахимены. Для проведения исследований, с помощью метода полимеразноцепной реакции (ПЦР), были подобраны штаммы Е. coli имеющие гены, отвечающие за выработку токсинов: у штамма 196 - за энтерогемолизин; у 173 - за выработку только шигатоксина; у 174(9) - за выработку гемолизина, некротизирующего и шигатоксина. Положительным контролем служил штамм Е. coli М-17 используемый в качестве пробиотического препарата и поступающий в аптечную сеть под названием «колибактерин», не обладающий патогенными и токсигенными свойствами. В качестве отрицательного контроля использовался стерильный питательный бульон Хоттингера. После проведенных исследований (результаты представлены в таблице 17), пришли к выводу, что в данном опыте можно использовать только один вид инфузорий-стилонихии, так как только они оказались чувствительными к токсинам выделяемым Е. coli. Парамеции и колподы не только не погибали, но и размножались в присутствии центрифугата бульонной культуры кишечной палочки, даже при высоких ее концентрациях, а гибель тетрахимен наблюдали и при отсутствии токсинов. Важным моментом при использовании стилонихий является то, что при гибели происходит их полный лизис, что упрощает контроль реакции. Травмированные инфузории при подсчете не учитываются.
В процессе исследований было подобрано оптимальное соотношение фильтратов бульонных культур Е. coli и среды культивирования инфузорий, которое составило 1:3 (то есть на одну каплю фильтрата питательного бульона три капли среды культивирования инфузорий), что позволило максимально снизить процент ошибки. Так при более низкой концентрации фильтрата питательной среды Е. coli. стилонихии не погибали, а при увеличении данного параметра наблюдали 100% лизис инфузорий.
Для выявления токсинов Е. coli на предметное стекло вносится 3 капли среды с инфузориями (суточная культура), проводится их подсчет (для удобства подсчета желательно, чтоб количество стилонихии составило 10-20 штук), при помощи бинокулярной лупы или микроскопа (при увеличении 2x8), и добавляется 1 капля исследуемой бульонной культуры Е. coli. После чего через 5 минут производится предварительный просмотр и подсчет количества инфузорий (для того чтобы избежать влияния различных факторов окружающей среды-запахи, перепады температуры и так далее, так как инфузории являются весьма чувствительными к ним). Стекла с исследуемым материалом помещают во влажную камеру в термостат с оптимальной для культивирования инфузорий (18-23 С) температурой. Культивирование стилонихии проводилось согласно ГОСТу 13496.7-97. По истечении 2-х часов производится окончательный подсчет числа инфузорий, который сравнивается с первоначальным значением. Считаются все стилонихии (как подвижные, так и не подвижные), погибшими считаются только подвергнувшиеся лизису. Для получения достоверных данных опыт дублируется 3-5 раз, затем высчитывается средний показатель. Чем выше процент лизированных (погибших) микроорганизмов, тем более токсичной является культуральная среда, а исследуемый штамм, соответственно - токсигенным.
Изучили влияние продолжительности инкубации на накопление токсинов в культуральной среде. Тест-культуры инкубировали при 37 С в течение 72 часов, через каждые 24 часа осуществляли контроль уровня токсичности. Полученные результаты данного опыта отражены в таблице 18.
