Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Сократительный аппарат запирательных мышц моллюсков 11
1.1.1. Структурно-функциональные особенности мышц двустворчатых моллюсков 11
1.1.2. Толстые нити запирательных мышц моллюсков 12
1.1.3. Тонкие нити запирательных мышц моллюсков 16
1.1.4. Взаимодействие толстых и тонких нитей в мышцах моллюсков 18
1.2. Твитчин гладких мышц моллюсков 23
1.2.1. Гигантские белки иммуноглобулинового суперсемейства 23
1.2.2. Взаимодействие Ф-актина с белками титинового семейства 24
1.2.3. Твитчин - регуляторный белок гладких мышц моллюсков 27
1.2.4. Di и D2 - участки фосфорилирования в молекуле твитчина 29
1.3. Механизм запирательного сокращения 32
1.3.1. Физиологические и биохимические аспекты запирательного тонуса моллюсков 32
1.3.2. «Парамиозиновая гипотеза» 34
1.3.3. «Мостиковая гипотеза» 35
1.3.4. Гипотеза «твитчин-актиновых мостиков» 36
Глава 2. Материал и методы исследования 38
2.1. Выделение сократительных белков из запирательных мышц моллюсков 38
2.1.1. Выделение толстых нитей 38
2.1.2. Экстракция поверхностных белков толстой нити 38
2.1.3. Фракция, содержащая «природный» Ф-актин 39
2.1.4. Фракция, содержащая твитчин и миород 39
2.1.5. Фракция, содержащая миозин и тропомиозин 40
2.1.6. Получение синтетического актомиозина 41
2.2. Выделение миозина из скелетных мышц кролика 41
2.3. Выделение актина из скелетных мышц кролика 42
2.4. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле 43
2.5. Фосфорилирование твитчина 45
2.6. Использование лазерного дифракционного анализатора 45
2.7. Низкоскоростное и высокоскоростное центрифугирование 46
2.8. Измерение вязкости 47
2.9. Измерение АТФ-азной активности 47
2.10. Вспомогательные методы 49
Глава 3. Результаты исследования 51
3.1. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина оптическими методами 51
3.2. Измерения вязкости твитчин-актинового комплекса 56
3.3. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина низкоскоростным центрифугированием 59
3.4. Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина высокоскоростным центрифугированием 61
3.5. Влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина.. 64
Глава 4. Обсуждение результатов 73
4.1. Взаимодействие твитчина с фибриллярным актином 73
4.2. Регуляция твитчин-актинового взаимодействия 75
4.3. Влияние твитчина на свойства актомиозина 76
4.4. «Парамиозиновая» и «мостиковая» гипотезы запирательного сокращения в свете современных экспериментальных данных 77
4.5. Гипотеза «твитчин-актиновых мостиков» 80
4.6. Предполагаемый молекулярный механизм запирательного сокращения 82
Выводы 84
Список литературы
- Структурно-функциональные особенности мышц двустворчатых моллюсков
- Взаимодействие Ф-актина с белками титинового семейства
- Фракция, содержащая «природный» Ф-актин
- Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина низкоскоростным центрифугированием
Введение к работе
Актуальность проблемы
Мышцы являются специализированными структурными элементами, способными трансформировать химическую энергию в механическую работу. Несмотря на то, что строение и функция мышц разнообразны, общие принципы их работы одинаковы. Согласно теории скользящих нитей, мышечное сокращение обусловлено активным скольжением тонких актиновых нитей относительно толстых миозиновых нитей без изменения их длины. Работа мышцы заключается в циклической смене двух ее состояний: сокращения в результате повышения концентрации Са2+ в саркоплазме и расслабления при ее понижении. Это правило имеет лишь одно исключение - гладкие мышцы двустворчатых моллюсков способны поддерживать еще одно состояние -запирательный тонус, или catch-состояние, при котором мышца при низкой концентрации Са2+ остается сокращенной в течение длительного времени. При этом высокое значение поддерживаемой силы сочетается с низким расходом энергии. Это явление, описанное более ста лет назад, хотя и свойственно ограниченному кругу мышц, тем не менее, вызывает повышенный интерес исследователей, поскольку его механизм трудно объяснить в рамках современных представлений о механизмах биологической подвижности.
Механические свойства нативных и демембранизированных волокон запирательных мышц моллюсков свидетельствуют о том, что в основе catch лежит образование поперечных сшивок между элементами сократительного аппарата. Выдвинуты две гипотезы, конкретизирующие это положение: «мостиковая», постулирующая в качестве искомых сшивок особое ригороподобное состояние актомиозиновых мостиков (Lowy et al., 1964), и «независимая», или «парамиозиновая» гипотеза, которая постулирует наличие независимой системы поперечных связей. Предполагается, что такими связями являются сшивки между толстыми нитями (Johnson et al., 1959).
Мышцы, способные к запирательному тонусу, обладают необычными толстыми нитями, которые имеют большие размеры (10-20 мкм), и в их основе лежит парамиозиновый стержень, составляющий около 60% от массы толстых нитей. На поверхности парамиозинового стержня располагается миозин (Szent-Gyorgyi et al, 1971), твитчин (Vibert et al, 1993) и миород (Shelud'ko et al., 1999). Выход из состояния запирательного тонуса стимулируется серотонинэргическим нервом, что приводит к фосфорилированию твитчина (Siegman et al., 1997). В связи с этим открытием «мостиковая» гипотеза была уточнена. Предполагается, что дефосфорилированный твитчин, взаимодействуя с миозином, придает миозиновым мостикам свойства catch-сшивок, в то время как фосфорилированный твитчин не меняет цикл работы миозиновых мостиков (Butler et al, 2001; Funabara et al, 2001; Yamada et al, 2001, 2004).
Хотя «мостиковая» гипотеза catch является общепринятой и тестируется длительное время, убедительных доказательств ее правильности не получено. Более того, накапливаются экспериментальные данные, которые не согласуются с этой гипотезой (Siegman et al., 1997; Sugi et al., 1999; Galler et al., 1999; Takahashi et al, 2003).
В данной работе предложена новая «независимая» гипотеза запирательного сокращения - гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» («twitchin-actin linkage hypothesis»). Она основана на полученных нами данных о способности твитчина непосредственно взаимодействовать с фибриллярным актином, причем это взаимодействие регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как распад и образование catch-сшивок in vivo. Согласно этой гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя в дефосфорилированном состоянии catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.
Наши данные о способности твитчина взаимодействовать с фибриллярным актином противоречат ранее опубликованным данным Ямада и сотр. (Yamada et al, 2001), однако подтверждены Фунабарой и сотр. (Funabara etal, 2005).
Цель и задачи исследования
Целью работы было выяснение роли твитчина в механизме запирательного тонуса гладких мышц двустворчатых моллюсков. Были сформулированы следующие задачи:
Разработать методы препаративного выделения твитчина, миозина и актина из гладких мышц мидии Crenomytilus grayanus.
Провести поиск условий взаимодействия твитчина с фибриллярным актином.
Исследовать физико-химические свойства твитчин-актинового комплекса и влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина.
Положения, выносимые на защиту
Твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков взаимодействует с фибриллярным актином.
Взаимодействие твитчина и актина регулируется фосфорилированием твитчина.
Твитчин-актиновое взаимодействие может быть основой запирательного сокращения мышц двустворчатых моллюсков, обеспечивая поперечные catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями.
Научная новизна полученных результатов
Впервые показано, что гигантский белок твитчин способен взаимодействовать с фибриллярным актином, и это взаимодействие зависит от степени фосфорилирования твитчина. Взамен общепринятой «мостиковой» гипотезы запирательного тонуса (Lowy et al., 1964) предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой дефосфорилированный твитчин образует catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.
Теоретическое и практическое значение работы
Предложенная гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» открывает новые возможности экспериментального исследования механизма запирательного сокращения и стимулирует поиски аналогичных систем в других мышцах, обладающих тоническими свойствами.
В работе детально описаны методы выделения и очистки сократительных белков, а также способы образования синтетических сократительных моделей, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности.
Апробация работы и публикации
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004, 2006), VIII Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004) и ежегодной научной конференции Института биологии моря им. А. В. Жирмунского (Владивосток, 2005). По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе - 5 работ в рецензируемых изданиях из списка ВАК.
Финансовая поддержка работы
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-04-49895) и Конкурса проектов ДВО РАН (грант № 06-Ш-В-06-206).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 104 страницах, состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение результатов», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 170 ссылок. Рукопись содержит 19 рисунков.
Структурно-функциональные особенности мышц двустворчатых моллюсков
Тип моллюсков, включающий более ста тысяч видов, представляет собой обширнейшую группу животных, уступающую по количеству видов только типу членистоногих. Наряду с достаточно четкой очерченностью типа и наличием общих черт, животные этой группы, объединяемые в разные классы, характеризуются и выраженными признаками специализации.
Почти для всех моллюсков характерно наличие раковины. Это обстоятельство в значительной степени определяет строение тела животных, в частности, расположение и строение мускулатуры. С наличием такого защитного приспособления, как раковина, связана и относительно малая подвижность большинства моллюсков. В результате у многих из них организация двигательного аппарата достаточно проста по сравнению с таковой у членистоногих или позвоночных. Моллюскам свойственны разнообразные формы мышечной активности: устойчивые тонические сокращения при запирании раковины, слитная медленная локомоция при ползании, внезапные резкие сокращения при плавании. Тонкая организация и в особенности механизмы функционирования нервно-мышечного аппарата до сих пор изучены мало. Общая структура мышц лучше всего изучена у двустворчатых моллюсков. Мускулатура двустворчатых делится на две части - на мантийную мускулатуру и мускулатуру ноги. Важнейшими производными мантийной мускулатуры являются мощные мышцы - аддукторы, закрывающие раковину. Типичным является наличие двух аддукторов - переднего и заднего. У большинства видов каждый аддуктор состоит из двух частей, нередко разделенных слоем соединительной ткани. Одна часть (функционально более быстрая) - мягкая, прозрачная, окрашена в желтый цвет. Другая часть — более плотная, непрозрачная, белого цвета. Белая непрозрачная часть аддуктора специализирована для осуществления тонической функции и способна длительно поддерживать высокий уровень напряжения при очень малом расходе энергии (запирательный тонус). Механизм запирательного тонуса неизвестен, хотя в целом структура этих мышц такая же, как у незапирательных мышц: они содержат толстые нити, тонкие нити и Z-структуры (Жуков и др., 191 А).
Толстые нити запирательных мышц моллюсков значительно отличаются от таковых из гладких мышц не только позвоночных, но и беспозвоночных животных, не способных поддерживать длительный тонус. Эти отличия, прежде всего, проявляются в их исключительно больших размерах по сравнению с толстыми нитями из других мышц, как по диаметру (до 100 нм), так и по длине (до 50-100 мкм) (Lowy and Hanson, 1962). Для сравнения толстые нити поперечнополосатых мышц гребешка Mizuhopecten yessoensis имеют диаметр около 20 нм, а длину всего 1.8-2.0 мкм (Levine et al., 1976).
Основой толстой нити запирательных мышц моллюсков является белок парамиозин (РМ), который формирует паракристаллическую структуру, показывающую шахматное распределение темноокрашенных участков при визуализации негативно окрашенных проб в электронном микроскопе (Szent-Gyorgyi et al., 1971). Поскольку молекулы парамиозина упакованы «бок-о-бок», с перекрытиями на определенную величину, в паракристаллах наблюдается сетчатая картина, которая была названа сетью Bear-Selby, по имени ученых, впервые ее описавших (Bear and Selby, 1956). Коен и сотрудники (Cohen et al., 1971) объяснили, каким образом получается сетчатый рисунок распределения красителя на поверхности паракристаллов - за счет последовательных сдвигов соседних рядов молекул на 14.5 нм с периодом повторения такого рисунка равным 72.5 нм.
Несмотря на многочисленные исследования, функция РМ до сих пор не совсем понятна. Этот мышечный белок не является обязательным компонентом сократительного аппарата, поскольку в мышцах позвоночных животных не обнаружен. Общепринято, что у беспозвоночных РМ выполняет структурную роль, образуя основу толстой нити. В соответствии с этим предположением существует хорошо известная корреляция длины толстых нитей и содержанием РМ - чем больше толстая нить содержит РМ, тем она длиннее (Levine et al., 1976). Поскольку развиваемое в системе напряжение пропорционально длине толстых нитей, то из этого следует, что мышцы с высоким содержанием парамиозина могут развивать более высокий уровень напряжения. Действительно, такие мышцы как передний биссусный ретрактор (ABRM) мидии Mytilus edulis или аддуктор мерценарии Mercenaria mercanaria (обе являются запирательными или catch-мышцами и содержат около 60% парамиозина) развивают напряжение до 10-15 кг/см , что значительно превышает уровень напряжения, который способны развить мышцы с меньшим содержанием парамиозина (Levine et al., 1976).
Как уже упоминалось выше, РМ содержится только в мышцах беспозвоночных, однако в запирательных мышцах моллюсков его содержание во много раз больше, чем в мышцах, не способных к поддержанию длительного напряжения (Levine et al, 1976; Bennet and Elliot, 1981; Elliot and Bennet, 1982). В этой связи, некоторые группы исследователей полагают, что такое высокое содержание этого белка в мышцах моллюсков обуславливает их способность к запирательному тонусу (Ruegg, 1961, 1971; Achazi et al., 191 A; Watabe and Hartshorne, 1990).
Взаимодействие Ф-актина с белками титинового семейства
Иммуноглобулиновое суперсемейство внутриклеточных мышечных елков это гигантские белки, состоящие из повторяющихся копий иммуноглобулиновых (Ig) и фибронектин-подобных (Fn III) доменов (Benian et aL, 1996a). Молекулярный уровень организации двух типов доменов представлен семи или восьми (3-складчатыми структурами. Интересно отметить, что такие домены встречаются во многих других полипептидах, большинство из которых являются внеклеточными. Гигантские белки являются единственным примером внутриклеточных белков, содержащих подобные домены (Benian et aL, 1989). Еще одной отличительной особенностью белков данного семейства является их способность взаимодействовать с миозином.
Бениан и сотр. (Benian et aL, 1996а) предложили классифицировать представителей суперсемейства в соответствии с их локализацией структурой и функциями в саркомере. В результате было выделено четыре основных группы. В первую (титиновое семейство) входят твитчин (из мышц разных типов беспозвоночных от нематод до моллюсков, рис. 3), титин/коннектин позвоночных и прожектин насекомых. Белки титинового семейства имеют длинные, вытянутые молекулы и содержат серин-треониновый киназный домен вблизи СООН-конца, который гомологичен каталитическому участку киназы легких цепей миозина (MLCK).
Вторая группа состоит из гладкомышечной и немышечной формы MLCK и гладкомышечного белка телокина (Gallagher and Herring, 1991), а третью группу составляют С-белок, смитин и 86 кДа белок из скелетных мышц позвоночных, которому предписывают структурную роль (Vaughan et aL, 1993). Наконец, в четвертую группу Ig суперсемейства входят белки М-линии поперечно-полосатых мышц позвоночных - М-белок, скелемин и миомезин. Следует отметить еще один белок, который не попадает ни в одну из представленных групп. Это 700 кДа полипептид - кеттин, компонент Z-диска насекомых. Необычность кетгина заключается в том, что в отличие от других представителей иммуноглобулинового суперсемейства, он не связан ни с миозином, ни с толстыми нитями (Benian et al., 1996а). Данное утверждение спорно, поскольку Кулке и сотр. (Kulke et al., 2001b) показали, что С-концевая часть кетгина взаимодействует с миозином.
Взаимодействие Ф-актина или тонких нитей с белками титинового семейства - титином и прожектином известно давно. Впервые такое взаимодействие было обнаружено между I областью титина и Ф-актином с помощью электронной микроскопии (Kimura et al., 1984). Анализируя полученные изображения авторы предположили, что в данной области два белка находятся на достаточном для их ассоциации расстоянии.
Затем высказывалось предположение о том, что титин способен слабо связываться с тонкими нитями (Maruyama, 1986). Действительно, позднее было показано, что Ф-актин взаимодействует как с нативными молекулами титина (Maruyama et al., 1987; Kellermayer and Granzier, 1996; Podlubnaya et al., 2003) и прожектина (Weitkamp et al., 1998; Podlubnaya et al., 2003), так и с его протеолитическими (Astier et al., 1998; Niederlander et al., 2004) или рекомбинантными фрагментами (Kulke et al., 2001a; Yamasaki et al, 2001; Linke et al., 2002). Кроме того обнаружено, что PEVK-домен титина вовлечен во взаимодействие с небулином — высокомолекулярным белком тонких нитей (Ма and Wang, 2002).
Было показано, что иммуноглобулиновые домены (116 и 117) N2B части титина из сердечной мышцы способны взаимодействовать с тонкими нитями (Linke et al., 1999). Однако определяющий вклад при образовании комплекса между актином и титином вносит, по-видимому, эластичный PEVK-домен титиновой молекулы (Linke et al., 2002). Интересно отметить, что сродство актина к титину, вероятно, зависит от изоформы последнего. Так, PEVK-домен титина из скелетной мышцы слабее связывается с актином, чем таковой из сердечной мышцы (Linke et al., 1997). Существует мнение, что такое взаимодействие происходит in vivo (Funatsu et al., 1993; Trombitas et al., 1997; Linke et al., 1997), придавая жесткость неактивированной сердечной мышце (Granzier et al., 1997; Linke et al., 1997), или оказывая вязкое сопротивление скольжению актиновых нитей (Kulke et al., 2001а; Yamasaki et al., 2001). PEVK-областъ титиновой молекулы
Название PEVK-домена обусловлено высоким содержанием в его составе четырех типов аминокислот - пролина (Р), глутаминовой кислоты (Е), валина (V) и лизина (К). В титине данный участок представляет собой статистический клубок, вторичная структура эластичной цепи которого представлена а-спиралыо и р-складчатостью (Gutierrez-Cruz et al., 2001). Считается, что именно этот участок ответственен за характерную эластичность титановых нитей (Kulke et al., 2001а).
В настоящее время данных относительно PEVK-подобного участка, входящего в состав твитчина моллюсков, в литературе нет. Тем не менее, мы считаем целесообразным представить в настоящем обзоре информацию о PEVK-домене титина, который является наиболее изученным белком иммуноглобулинового семейства, с тем, чтобы иметь представление о структуре и некоторых свойствах этой уникальной последовательности.
PEVK домен титина состоит из двух основных последовательностей: РРАК (или PEVK повтор) и polyE сегментов (Greaser, 2001). Первый участок (с повтором в 28 аминокислотных остатков) всегда начинается с паттерна аминокислот РРАК, в то время как polyE содержит, в основном, глутаминовую кислоту.
С помощью методов ядерного магнитного резонанса и кругового дихроизма было показано, что PEVK - домен имеет вязкую, эластичную структуру которая способна переходить из одного конформационного состояния в другое: роїу-пролиновая спираль, (3-поворот, виток (Ma and Wang, 2003).
Длина PEVK-домена титина варьирует в зависимости от типа мышц — один из самых коротких обнаружен в сердечной мышце позвоночных (около 180 аминокислотных остатков в так называемой N2B изоформе титина). В скелетной мышце его длина достигает 2174 аминокислотных остатков (Labeit and Kolmerer, 1995). Напомним, что PEVK-подобный участок твитчина состоит лишь из 79 аминокислотных остатков (Funabara et al., 2003).
Фракция, содержащая «природный» Ф-актин
Осадок фракции 43-65% растворяли в 50 мл раствора 0.3 М КС1, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ЭГТА, 5 мМ МЭТ, 1 мМ NaN3, 20 мМ фосфатного буфера, рН 6.5 и диализовали против этого раствора. Диализат осветляли при 45000 об/мин, 1 час, затем разбавляли 7 объемами раствора 1 мМ MgC , 0.5 мМ ДТТ и центрифугировался 5000 об/мин, 15 мин (супернатант может быть использован для получения тропомиозина). Осадок промывали и осаждали дважды раствором 50 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 0.5 мМ ФМСФ, 1 мМ NaN3, 50 мМ трис-HCl, рН 7.0. Осадок растворяли в 20 мл этого раствора добавлением 3 М КС1 до 0.5 М КС1 и осветляли ультрацентрифугированием при 45000 об/мин, 2 часа. Концентрацию измеряли методом Бредфорда при длине волны 595 нм и рассчитывали по следующей формуле: п _ 039ХІ595 . где С - концентрация белка, Е595 — оптическая плотность при длине волны 595 нм. Коэффициенты были получены с использованием данных калибровочной кривой, обработанных в программе GraphPad Prizm. Часть препарата хранили на льду, другую глицеринизировали (50% глицерина) и хранили при -30С.
Исходным материалом для получения препарата синтетического актомиозина являлась отдиализованная фракция, или часть отдиализованной фракции 43-65% насыщения. Диализат осветляли при 14000 об/мин, 30 мин, затем к супернатанту добавляли 50-100 мг Ф-актина кролика или nFA мидии. В актин предварительно добавляли З М КС1 до 0.5 М и ДТТ до 2 мМ. Смесь белков осаждали ультрацентрифугированием при 40000 об/мин, 2 часа. Осадки суспендировали в минимальном объеме раствора 0.5 М КС1, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ ЭГТА, 5 мМ МЭТ, 1 мМ NaN3, 20 мМ имидазол-НС1, рН 7.0, и измеряли концентрацию биуретовым методом. Затем к препарату актомиозина добавляли ДТТ до 2 мМ. Соотношение миозина к актину рассчитывали с помощью денситометрирования электрофорезного геля.
Препарат хранили на льду не более 10 дней.
Миозин выделяли по методу Перри (Репу, 1955), модифицированному Тартаковским (Тартаковский, 1978). Срезанные спинные мышцы кролика сразу помещали в молотый лед. Охлажденные и очищенные от жировой и соединительной ткани, мышцы пропускали два раза через предварительно охлажденную мясорубку с диаметром отверстий не более 2 мм. Мышечный фарш взвешивали и экстрагировали 3-кратным объемом раствора 0.3 М КС1, 0.1 М К2НР04, 10 мМ Na4P207, 0.001 М MgCl2, рН 6.5. Экстракцию проводили 15-20 мин с перемешиванием и центрифугированием при 1000-5000g, 10-15 мин. Надосадочную жидкость быстро фильтровали через стеклянную вату. Миозин осаждали, выливая фильтрат в 14 объемов 5 мМ ЭДТА, рН 6.6-6.8 и осторожно перемешивали получаемую смесь. Суспензию оставляли на холоду. Через 2-3 часа надосадочную жидкость декантировали и оставшуюся густую суспензию центрифугировали при 2000g, 20 мин. Продолжительность и скорость центрифугирования должны быть достаточны для того, чтобы в супернатанте не было видно хлопьев, а осадок не был сильно уплотнен. Осадок растворяли добавлением З М КС1, 5 мМ ЭДТА, рН 7.0, до конечной концентрации 0.5 М КС1.
К полученному раствору добавляли ЭДТА до 5 мМ, рН 6.8, понижая концентрацию КС1 до 0.3 М. Актомиозин осаждали центрифугированием при 30000 об/мин, 1 ч. К супернатанту, содержащему миозин, добавляли ЭДТА до 5 мМ, рН 6.8, понижая концентрацию КС1 до 0.04 М.
Конечный препарат миозина растворяли в растворе 0.5 М КС1, 5 мМ ЭДТА, рН 7.0 и осветляли центрифугированием при 30000 об/мин, 1 ч. Концентрацию конечного препарата измеряли биуретовым методом.
Для получения актина из поперечно-полосатых мышц кролика использовали остаток миофибрилл, полученный из мышечного фарша раствором Хассельбаха - Шнейдера (Шелудько, 1975; Шелудько и Пинаев, 1975). После дальнейшей обработки миофибриллярного остатка 5 мМ раствором ЫаНСОз и ацетоном получали сухой, ацетонизированный порошок, не содержащий миозина, а так же саркоплазматических белков и белков Са -чувствительного комплекса (Хайтлина, 1978). Для экстракции актина из ацетонизированного порошка использовали раствор Риса-Янга, содержащий 0.5 мМ АТФ, 0.2 мМ СаС12 и 0.5 мМ МЭТ (Rees and Young, 1967).
Тестирование взаимодействия твитчина и Ф-актина низкоскоростным центрифугированием
Высокоскоростное соосаждение двух белков в условиях, когда один из них не осаждается широко используется в биохимической практике для обнаружения белок-белкового взаимодействия. В случае взаимодействия белков, в осадке находится не только белок, обычно осаждаемый в этих условиях, но и белок, с ним взаимодействующий.
Использование высокоскоростного соосаждения в нашем случае выявило более сложную картину твитчин-актинового взаимодействия. Оказалось, что результаты соосаждения комплекса сильно зависят от выбранных экспериментальных условий. При условиях, представленных на рисунке 13 (дорожки 1-4) осадки формировались как на дне, так и на стенке пробирки и содержали небольшое, приблизительно одинаковое количество твитчина (дорожки 3 и 4, 01 и 02). Однако при низком соотношении твитчина к актину осадок на стенке содержал намного больше твитчина, чем осадок на дне пробирки (не показано). Мы предполагаем, что появление двух осадков связано с гетерогенностью твитчин-актинового комплекса. Комплексы могут включать как большие частицы, обогащенные твитчином, так и маленькие частицы, обогащенные актином.
Следует отметить, что именно этот метод был использован Ямада и сотр. (Yamada et ей., 2001) для демонстрации отсутствия взаимодействия между актином и твитчином. Авторы цитируемой работы не обнаружили твитчин в осадках Ф-актина в результате ультрацентрифугирования. Мы полагаем, что это может быть связано с особенностями осаждения в угловом роторе гетерогенных по размеру частиц. Большие частицы имеют высокую скорость осаждения и поэтому могут осаждаться на стенке пробирки. Вероятнее всего, авторы анализировали только придонные осадки, причем в тех условиях, когда в них содержится минимальное количество твитчина.
В тоже время, твитчин-актиновый комплекс, сформированный в 150 мМ КО, осаждается одним осадком на дне пробирки и содержит такое же незначительное количество твитчина (рис. 13, дорожка 7), как в случае 75 мМ КС1 (рис. 13, дорожки 3 и 4). Наличие только одного осадка в 150 мМ КС1 согласуется с отсутствием агрегации твитчин-актиновых комплексов в данных условиях (Рис. 7).
Можно отметить, что значительная часть твитчина, после высокоскоростного центрифугирования, остается в супернатанте (рис. 13, дорожки 2 и 6). Однако использование концентрированных растворов Ф-актина значительно увеличивает количество связанного твитчина (Рис. 13, дорожки 8-10).
Таким образом, взаимодействие твитчина и Ф-актина может быть обнаружено как низкоскоростным, так и высокоскоростным центрифугированием в растворах с низкой и физиологической ионной силой. In vitro фосфорилированный в присутствии ПКА твитчин не осаждается с Ф-актином (рис. 12, дорожка 7).
Твитчин (0.4 мг/мл), Ф-актин (0.2 мг/мл или 2 мг/мл) смешивали в растворе, содержащем 75 или 150 мМ KCI. ИС - исходная смесь до центрифугирования, С - супернатант, О - осадок, 01 - осадок на стенке пробирки, 02 - осадок на дне пробирки. Осадки ультрацентрифугирования при 100000g в течение 2 часов.
Результаты, представленные в первой части настоящего исследования, демонстрируют, что твитчин способен взаимодействовать с Ф-актином -основным компонентом тонкой нити. Данное взаимодействие регулируется in vitro фосфорилированием твитчина протеин киназой А, что подтверждено оптическими (рис. 5) и гидродинамическими (рис. 11) методами, а также электрофоретическим анализом твитчин-актинового комплекса (рис. 12). Это очень интересное наблюдение, поскольку в нативной мышце процесс фосфорилирования твитчина протеин киназой А связан с расслаблением мышцы из запирательного тонуса (Siegman et ai, 1998). В обзоре, посвященном проблеме запирательного тонуса, Фунабара и сотр. (Funabara et al., 2005), сообщили о том, что наши данные о взаимодействии Ф-актина с твитчином и регуляции этого взаимодействия фосфорилированием твитчина проверены в их лаборатории и подтверждены.
Как было упомянуто выше, мышечный белок миозин в составе сократительного аппарата выполняет две функции. Во-первых, он является структурным белком, а во-вторых, проявляет ферментативную активность, катализируя гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата, высокоэффективно преобразовывая энергию АТФ в механическую работу. В следующей серии опытов было изучено влияние твитчина на механохимическую активность суспензионных сократительных моделей. Такие модели представляют комплекс белков актина и миозина, которые при понижении ионной силы их раствора образуют тонкую взвесь актомиозина, частицы которой обладают такими же свойствами при взаимодействии с АТФ, как и актомиозиновые нити - они сокращаются. Сокращенные частицы осаждаются (преципитируют) быстрее исходных и образуют осадок меньшего объема. Это явление было названо Сент-Дьердьи (Szent-Gyorgyi, 1951) суперпреципитацией (СПП). Скорость и степень СГШ характеризуют процесс сокращения частиц и, следовательно, отражают динамику актин-миозинового взаимодействия.
