Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение механизмов дифференцировки клеток и регенерации тканей, в частности механизмов миогенеза и регенерации мышц - одна из важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития (Румянцев, 1982). Многоклеточные организмы сформированы из множества специализированных клеточных популяций. По наличию клеточного обновления популяции были разделены на обновляющиеся, растущие и статические. К последним были отнесены нейроны и кардиомиоциты млекопитающих (Leblond, 1964). Эта классификация подвергается уточнениям. У грызунов возможна реактивация синтеза ДНК в кардиомиоцитах желудочков сердца в пределах 0.1-0.5 % через 3-30 сут после инфаркта миокарда (Румянцев, 1982). У людей описаны митозы кардиомиоцитов в околоинфарктной зоне (Beltrami et al., 2003).
Кардиомиоциты взрослых млекопитающих - это высокодифференцированные, высокоорганизованные клетки, специализированные для выполнения функции сокращения. Ограниченная способность сердечных миоцитов (особенно желудочковых) к пролиферации в постнатальном кардиомиогенезе позволяет многим авторам определять кардиомиоциты млекопитающих как популяцию некамбиального типа. В то же время кардиомиоциты способны к довольно быстрой и эффективной реорганизации своей внутренней структуры при изменении условий существования (например, при гиперфункции органа или снижении притока пластических веществ) за счет усиления или снижения процессов внутриклеточной регенерации (Саркисов, 1977).
Способность кардиомиоцитов млекопитающих к такого рода изменениям их составляющих делает эти клетки удобной моделью для изучения характера адаптивно-компенсаторных реакций в клетках, способных к реактивации митотического цикла в очень ограниченной степени. Это не позволяет отнести ни одну из разновидностей кардиомиоцитов (желудочковые, предсердные, проводящей системы), даже у взрослых млекопитающих, к чисто статической (необратимо постмитотической) популяции клеток (Румянцев, 1982). Это обстоятельство так же, как и способность кардиомиоцитов некоторых видов млекопитающих (грызуны, приматы, человек) к полиплоидизации, определяет особенности регенерации сердечных миоцитов.
В настоящее время накапливаются данные об участии стволовых клеток в регенерации миокарда (Dawn et al., 2005; Kajstura et al., 2005; Torella et al., 2007). Точная оценка вклада
так называемых стволовых клеток или клеток-предшественников кардиомиоцитов в поддержание и обновление клеточного состава миокарда требует дополнительных исследований (Flugelman, Lewis, 2004; Liao et al., 2007). Однако независимо от результатов решения вопроса об отнесении кардиомиоцитов к популяции обновляющегося типа не вызывает сомнения, что основную массу клеток миокарда представляют терминально дифференцированные кардиомиоциты «с достаточно жесткой репрессией синтеза ДНК и митозов» (Румянцев, 1982).
Так как обновление и тем более скорость обновления кардиомиоцитов пока остаются неизвестными, будем придерживаться мнения, что терминально-дифференцированные кардиомиоциты млекопитающих функционируют в миокарде неопределенно продолжительное время. Следовательно, встает вопрос о выживаемости этих клеток. Одним из подходов к анализу выживаемости кардиомиоцитов может быть использование животных с генетическим дефектом - мышей mdx. Отсутствие в сократительных клетках мутантных мышей mdx синтеза белка дистрофина сопровождается развитием в них окислительного стресса, вызывающего гибель клеток.
Таким образом, сократительные клетки мышей mdx являются моделью выживания клеточных популяций в условиях окислительного стресса. Исходя из этого, изучение цитохимических особенностей кардиомиоцитов при генетически обусловленной кардиомиодистрофии на модели мышей mdx приобретает несомненную актуальность.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в выяснении цитологических механизмов выживания и гибели кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx методами авторадиографии, иммуноморфологии и морфометрии после динамического стресса. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
Изучение включения Н-тимидина в кардиомиоциты мышей mdx и С57В1 до и после стресса.
Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57В1 до и после динамического стресса.
Анализ динамики экспрессии гешр53 до и после динамического стресса.
4. Морфометрический подсчет изменений концентраций кардиомиоцитов в миокарде
мышей mdx и С57В1 до и после стресса с целью вычисления клеточной потери
кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1, вызываемой динамическим стрессом.
Основные положения, выносимые на защиту
Кардиомиоциты мышей С57В1 характеризуются низким уровнем частоты обнаружения двунитевых разрывов ДНК (ДрДНК). Динамический стресс в сочетании с охлаждением организма усиливает образование ДрДНК. Через 1 сут после стресса частота обнаружения ДрДНК в нормальных кардиомиоцитах уменьшается до контрольного уровня.
Частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей mdx при обычных условиях содержания животных превосходит таковую в кардиомиоцитах мышей. Динамический стресс усиливает образование ДрДНК. Через сутки после стресса частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей mdx уменьшается до исходного уровня.
После динамического стресса кардиомиоциты мышей mdx включают Н-тимидин в ядра.
Динамический стресс усиливает экспрессию белка р53 в кардиомиоцитах мышей С57В1 и mdx. Динамика экспрессии белка р53 мышей mdx коррелирует с динамикой появления ДрДНК.
Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже, чем в миокарде мышей С57В1, а суточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса превышает таковую у мышей С57В1.
Репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса.
Научная новизна работы
Впервые исследована частота обнаружения ДрДНК у кардиомиоцитов мышей С57В1 и mdx в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма. Впервые произведен подсчет частоты включения Н-тимидина у кардиомиоцитов мышей С57В1 и mdx в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма. Впервые изучена экспрессия белка р53 в кардиомиоцитах мышей С57В1 и mdx в отсутствие динамического стресса, через час и через 24 ч после стресса. Впервые определено, что динамика экспрессии белка р53 в кардиомиоцитах мышей mdx коррелирует с динамикой появления ДрДНК. Впервые с использованием усовершенствованного метода морфометрии подсчитана концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей С57В1 и mdx. Впервые произведен учет суточного снижения концентрации кардиомиоцитов у мышей С57В1 и mdx после динамического стресса.
Теоретическое и практическое значение работы
Представление о «достаточно жесткой репрессии синтеза ДНК и митозов» основной массы терминально дифференцированных кардиомиоцитов миокарда млекопитающих сделало одной из основных задач теоретической и практической биологии кардиомиоцитов изучение их выживания и гибели при неблагоприятных ситуациях, возникающих в миокарде в случае патологии. В нашем случае неблагоприятными ситуациями были состояние окислительного стресса мутантных кардиомиоцитов мышей mdx и плавание при низкой температуре, усиливающие состояние окислительного стресса. Сопоставление динамики ДрДНК и уровня клеточной потери позволило заключить, что репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса. Кроме того, положительная корреляция динамики ДрДНК и экспрессии гена р53 указывает на участие активности гена р53 в регуляции гибели и выживания кардиомиоцитов. Этот результат свидетельствует о том, что по механизму регуляции выживания и гибели кардиомиоциты млекопитающих соответствуют клеткам обновляющихся клеточных популяций. В совокупности представленные результаты показывают, что миокард мышей mdx является экспериментальной моделью кардиомиопатии. Полученные результаты и методы могут быть с успехом использованы для изучения кардиомиоцитов человека при различных формах сердечной патологии.
Материалы диссертации также могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.
Апробация работы
В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на совместных семинарах Группы генетики клеточных популяций и Лаборатории патологии клетки Института цитологии РАН. Материалы работы представлены на следующих научных собраниях: Съезд Общества клеточной биологии, (Санкт-Петербург, октябрь 2003); Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, октябрь 2004); XV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь 2005); Международная конференция "Acute Cardiac Care" Европейского Общества Кардиологов, (Prague, Czech Republic, October 2006); Политехнический симпозиум, конференция "Молекулярная и структурная биология", (Санкт-Петербург, декабрь 2006); 2-й съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-
Петербург, октябрь 2007); Всероссийский национальный конгресс кардиологов (Москва, октябрь 2007)
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 8 докладов на всероссийских и международных конференциях и съездах.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, использованных в работе, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 142 ссылки. Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста и иллюстрированы 22 рисунками и 11 таблицами.
