Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Кардиотоксические эффекты цитотоксических препаратов и биологические эффекты веществ растительного происхождения: современные представления о механизмах действия и структурных проявлениях 11
І.І.Основные механизмы кардиотоксического действия антрациклиновых антибиотиков 12
1.2. Медико-биологические и кардиотоксические эффекты циклофосфамида 24
1.3. Кардиотропные эффекты природных и полусинтетических агентов с противоопухолевой активностью 35
1.4. Резюме 44
Собственные исследования
Глава II. Материал и методы исследования 46
2.1. Общая характеристика экспериментального материала 46
2.2. Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования 47
2.3. Методы морфометрического анализа и количественной оценки популяции кардиомиоцитов в сердце 50
2.4. Резюме 51
Глава III. Тканевая реорганизация миокарда крыс при действии циклофосфана и производных бетулина 52
3.1. Характеристика общетоксических и кардиотоксических эффектов циклофосфана и производных бетулина 52
3.2. Тканевая реорганизация миокарда крыс при действии циклофосфана и производных бетулина 54
3.3. Количественный анализ популяции кардиомиоцитов при действии циклофосфана и тритерпеноидов 81
3.4. Резюме 84
Глава IV. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов крыс при действии циклофосфана и производных бетулина 88
4.1. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов крыс при моделировании циклофосфановых повреждений 88
4.2. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов при комбинированном воздействии циклофосфана и тритерпеноидов 95
4.3. Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов при введении производных бетулина в качестве моноагентов 103
4.4. Резюме 109
Глава VI. Сравнительная характеристика структурной реорганизации миокарда экспериментальных животных при действии циклофосфана и тритерпеноидов (обсуждение результатов исследования) 112
Выводы 124
Список литературы 127
- Медико-биологические и кардиотоксические эффекты циклофосфамида
- Тканевая реорганизация миокарда крыс при действии циклофосфана и производных бетулина
- Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов крыс при моделировании циклофосфановых повреждений
- Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов при введении производных бетулина в качестве моноагентов
Введение к работе
Актуальность темы. Кардиотоксические эффекты цитоста-тических препаратов, в частности, применяющихся в онкологии, представляют одну из трудноразрешимых проблем современной медицины. К таким препаратам относятся, прежде всего, антра-циклиновые антибиотики, цитотоксические свойства которых в значительной степени определяются кумулятивной дозой (Лушни-кова Е.Л. и др., 2005; Непомнящих Л.М., 2007; Schimmel K.J.M. et al., 2004). Кардиотоксические доза-зависимые эффекты показаны также для таких препаратов, как циклофосфан (ЦФ), 5-флюороура-цил, таксоиды (паклитаксел и доцетаксел), трастузумаб, циклопен-тинилцитозин, цис-платина, мелфалан, флударабин, митомицин, бусульфан, мехлоретамин, декарбазин.
Кардиотоксические эффекты химиотерапии подразделяют на острые, хронические и отсроченные. Острые эффекты (снижение артериального давления, тахикардия, развитие аритмий, электрофизиологические изменения, желудочковая дисфункция) выявляются в течение нескольких минут после введения единственной дозы препаратов, как правило, хорошо купируются и быстро проходят. Хронические нарушения сердечной деятельности (пониженное артериальное давление, стойкие нарушения ритма, дилатация желудочков и сердечная недостаточность) развиваются в течение нескольких недель и месяцев после прекращения применения препаратов и часто являются угрожающими для жизни. Отсроченные кардиотоксические эффекты, характерные в основном для антра-циклиновых антибиотиков, проявляются в развитии необратимой кардиомиопатии и сердечной недостаточности через 4-20 лет после окончания лечения неопластических процессов (Steinherz L.J. et al., 1991). Такие состояния практически не поддаются лечению и, как правило, заканчиваются летально.
Наиболее полно изучены кардиотоксические воздействия антра-циклиновых антибиотиков. В серии фундаментальных исследований было установлено, что цитотоксические свойства антрациклиновых антибиотиков обусловлены их негативным влиянием на процессы воспроизводства ультраструктур кардиомиоцитов, приводящим к угнетению их внутриклеточной регенерации (Семенова Л.А. и др., 1985; Непомнящих Л.М. и др., 2003). Развивающаяся в таких условиях сердечная недостаточность была классифицирована как
регенераторно-пластическая сердечная недостаточность (Непомнящих Л.М., 2007). В качестве основных молекулярных механизмов ингибирования процессов внутриклеточной регенерации карди-омиоцитов антрациклиновыми антибиотиками рассматриваются их способность интеркалировать в молекулу ДНК и генерация свободнорадикальных процессов, вследствие чего происходит значительное изменение физико-химических характеристик сарколеммы и внутриклеточных мембран, изменяются сигнально-тран-сдукторные пути, интенсивность биосинтетических процессов, в ряде случаев усиливается индукция апоптоза (Olson R.D., Mushlin P.S., 1990; Zhu W. et al., 1999; Rang Y.J. et al., 2000; De Beer E.L. et al., 2001). Важными характеристиками регенераторно-пластической недостаточности антрациклинового генеза являются уменьшение общей численности кардиомиоцитов в сердце (численный дефицит) и атрофия значительного числа кардиомиоцитов.
Кардиотоксические свойства других цитостатиков, в частности, циклофосфана (ЦФ), изучены в меньшей степени. Считается, что в цитотоксичности ЦФ важнейшую роль играет интенсификация свободнорадикальных реакций в клетках (Олейник А.В., 1985). Однако характер структурных изменений миокарда при действии алкилирующих соединений практически не изучен. Не выяснены основные типы повреждений кардиомиоцитов, не установлены возможности и типы их регенерации.
Отсутствие избирательности действия цитостатических препаратов обусловливает необходимость разработки протективных и регенераторных технологий, снижающих негативные эффекты таких веществ и способствующих развитию тканеспецифических регенераторных реакций в органах и тканях, не пораженных неопластическим процессом. Необходимым требованием, предъявляемым к потенциальным протекгивным соединениям, является отсутствие их влияния на антибластомные эффекты противоопухолевой терапии. Одной из приоритетных задач является также поиск препаратов и соединений, обладающих антиметастатическим действием и повышающих резистентность организма при опухолевой болезни.
Среди таких соединений все большее внимание исследователей привлекают в последнее время тритерпеноиды - обширный класс химических соединений, обладающих широким спектром биологической активности (Liby К.Т. et al., 2007). Особый интерес вызывают тритерпеноиды ряда лупана. Из природных лупановых тритерпено-
вдов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения, можно выделить производные бетулина (Толстикова Т.Г. и др., 2006). Важными производными бетулина являются бетуло-новая кислота (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) (БК), которую получают путем окисления бетулина, и производное бетулоновой кислоты (ее амид), содержащее у атома С-28 р-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (АБК) (Петренко Н.И. и др., 2002). При исследовании острой и субхронической токсичности БК и АБК на крысах и мышах было установлено, что данные агенты не обладают токсичностью и могут быть отнесены к IV классу низкотоксичных веществ.
Изучение медико-биологических эффектов БК и АБК выявило их противоопухолевые, антиметастатические, нефропротекторные, гепатопротекторные (при метастатическом поражении печени и противоопухолевой полихимиотерапии) и антиоксидантные свойства (Жукова Н.А. и др., 2005; Позднякова СВ. и др., 2006,2007; Сорокина И.В. и др., 2007). Противоопухолевые свойства БК связывают с ее цитостатической активностью и способностью индуцировать апоптоз опухолевых клеток (Kim D.5. et al., 1998; Lee S.M. et al., 2003).
Сведения о противоположных (протективных и цитотоксичес-ких) эффектах БК и АБК, полученные при исследовании разных тканевых и клеточных систем и при разных экспериментальных условиях, позволяют отнести их к многофункциональным химическим агентам с плейотропными свойствами по аналогии с другими природными и полусинтетическими тритерпеноидами, в частности, с олеаноловой кислотой и ее производными, взаимодействующими с ключевыми макромолекулами в нескольких сигнальных трансдук-торных путях и ядерными рецепторами (Liby К.Т. et al., 2007). В этом аспекте изучение всего спектра кардиотропных свойств БК и АБК имеет важное значение для их возможного использования как в качестве компонентов противоопухолевой терапии, так и агентов, способных модулировать различные внутриклеточные процессы в кардиомиоцитах, включая их пролиферацию и дифференцировку, т.е. индуцировать цитопротекцию и регенерацию клеток.
Цель исследования - изучить характер структурной реорганизации миокарда экспериментальных животных при введении циклофосфана и тритерпеноидов (бетулоновой кислоты и ее Р-ала-нинового амида) с оценкой общей численности кардиомиоцитов в
сердце как интефального показателя выраженности регенераторных и компенсаторно-приспособительных реакций.
Для достижения данной цели были поставлены и реализованы следующие задачи:
-
Установить характер тканевой реорганизации миокарда крыс при моделировании циклофосфановьгх повреждений.
-
Выяснить характер структурных изменений миокарда крыс при введении тритерпеноидов в качестве моноагентов и при их последовательном применении после введения циклофосфана.
-
Установить характер ультраструктурных повреждений кар-диомиоцитов крыс при однократном введении циклофосфана в качестве моноагента и при комбинированном введении с тритер-пеноидами.
-
Изучить особенности внутриклеточных изменений кардиомиоци-тов при действии бетулоновой кислоты и ее Р-аланинового амида.
-
Оценить динамику изменений общей численности кардиоми-оцитов в сердце при действии циклофосфана и тритерпеноидов как показателя клеточной формы регенерации кардиомиоцитов.
Научная новизна. Впервые при проведении комплексного морфологического исследования миокарда крыс при действии циклофосфана и тритерпеноидов (бетулоновой кислоты и ее Р-аланинового амида) выявлены особенности структурной реорганизации миокарда и установлены особенности клеточной и внутриклеточной форм регенерации кардиомиоцитов. Показано, что использованные вещества вызывают сходные, но различающиеся по выраженности морфофункциональные изменения миокарда при использовании их в качестве моноагентов: литические и некробиотические повреждения кардиомиоцитов на фоне гемодинамических расстройств. Наиболее выраженными эти изменения были при введении циклофосфана с последующим введением амида бетулоновой кислоты.
Впервые показано, что циклофосфан и тритерпеноиды, использованные в качестве моноагентов и при последовательном применении, вызывают изменение общей численности кардиомиоцитов в сердце в динамике эксперимента. Показано, что однократное введение циклофосфана изменяет регенераторный потенциал кардиомиоцитов, что проявляется в индукции кариокинеза, снижении доли одноядерных кардиомиоцитов и в увеличении их общей численности в сердце в динамике эксперимента. Бетулоновая кислота и ее амид не вызывают существенных изменений общей числен-
ности кардиомиоцитов в сердце, но обусловливают значительное увеличение доли одноядерных клеток в ранние сроки воздействия. Введение амида бетулоновой кислоты после однократного введения циклофосфана приводит к наиболее значительному снижению массы сердца и вызывает уменьшение общей численности кардиомиоцитов в ранние сроки эксперимента.
Впервые при проведении сравнительного ультраструктурного исследования миокарда выявлены основные типы повреждения кардиомиоцитов и особенности их внутриклеточной реорганизации при действии циклофосфана, бетулоновой кислоты и ее Р-аланино-вого амида. Впервые показано, что использованные тритерпенои-ды вызывают сходные с циклофосфаном, но менее выраженные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов, которые достаточно быстро проходят. При последовательном применении циклофосфана итритерпеноидов установлен их синергизм в отношении основных видов ультраструктурных изменений кардиомиоцитов - литических повреждений миофибрилл, расширения везикул саркоплазматичес-кой сети и межмембранного околоядерного пространства. Показано, что восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при введении тритерпеноидов происходит быстрее. Выявлено, что амид бетулоновой кислоты в отличие от циклофосфана и бетулоновой кислоты вызывает значительные изменения тонкой структуры митохондрий. По данным ультраструктурного исследования, биологическая активность амида бетулоновой кислоты в отношении внутриклеточной реорганизации кардиомиоцитов выше, чем у бетулоновой кислоты, при использовании его как в качестве моноагента, так и в сочетании с циклофосфаном.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации миокарда, основных типах повреждений кардиомиоцитов и изменениях их общей численности при введении циклофосфана и тритерпеноидов, что вносит существенный вклад в развитие представлений о структурных реакциях миокарда и особенностях его регенерации при токсических воздействиях.
Полученные данные о том, что бетулоновая кислота и Р-аланино-вый амид могут как потенцировать цитотоксические эффекты циклофосфана, так и выступать в качестве индуктора регенераторных реакций миокарда, имеют важное значение для разработки схемы введения и подбора оптимальных доз данных химических агентов
для достижения определенного биологического эффекта — протек-тивного воздействия или усиления цитотоксического эффекта. Основные положення, выносимые на защиту:
-
Кардиотоксические эффекты циклофосфана проявляются в снижении массы сердца, диаметра сердечных миоцитов, развитии их дистрофических и некробиотических изменений, гемодина-мических расстройствах. Однократное введение циклофосфана изменяет регенераторный потенциал кардиомиоцитов, индуцируя в них кариокинез, что обусловливает снижение доли одноядерных клеток в популяции кардиомиоцитов.
-
К основным видам ультраструктурных повреждений кардиомиоцитов при действии циклофосфана относятся умеренно выраженный лизис миофибрилл, расширения везикул гранулярной и агранулярной саркоплазматической сети и деструкция митохондрий с образованием миелиноподобных остаточных телец. Бетулоновая кислота и ее р-аланиновый амид вызывают сходные с циклофос-фаном, но менее выраженные повреждения ультраструктуры кардиомиоцитов.
-
Бетулоновая кислота и ее Р-аланиновый амид потенцируют действие циклофосфана в ранние сроки их комбинированного применения, что проявляется в более выраженном снижении массы сердца, численности кардиомиоцитов в сердце и выраженности их ультраструктурных изменений. В более поздние сроки данные химические агенты способствуют более быстрой регенерации кардиомиоцитов при их комбинированном использовании с цик-лофосфаном.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на II Съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007), Ш Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), межлабораторной научной конференции в ГУ НИИ региональной патологии и пато-морфологии СО РАМН (Новосибирск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 - в рецензируемых журналах по списку ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора ли-
тературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, иллюстрирована 3 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 185 источников, из них 16 отечественных и 109 иностранных.
Медико-биологические и кардиотоксические эффекты циклофосфамида
Общая характеристика препарата. Циклофосфамид, циклофосфан, (Cyclophosphamide) относится к противоопухолевым препаратам относительно широкого спектра действия (Машковский М.Д., 2003). Циклофосфан впервые был синтезирован в 1958 г., технологичный метод его синтеза разработан в 1959 г. Исходными продуктами при получении циклофосфана являются диэтаноламин, хлороксид фосфора и аминопропанол-1,3. Молекула циклофосфана состоит из двух характерных частей: действующей, ди-(2-хлорэтил)-аминной группы и транспортной группы (шестичленное кольцо фосфорамидоэфира).
Циклофосфамид и его изомерный аналог ифосфамид широко используются в терапии злокачественных опухолей различной локализации (мелкоклеточного рака легкого, рака яичников, рака молочной железы, ретику-лосаркомы, лимфосаркомы, хронического лимфолейкоза, острого лимфоб-ластного лейкоза, множественной миеломы, опухоли Вильямса, костной ре-тикулосаркомы, саркомы Юинга, ангиосаркомы) (Ларионов Л.Ф., 1962; Кивман Г.Я. и др., 1982). Циклофосфамид обладает таюке иммуносупрес-сивными свойствами и используется при трансплантации органов и разных аутоиммунных заболеваниях (Машковский М.Д., 2003; Moore M.J., 1991).
Чувствительными к циклофосфамиду в эксперименте оказались перевивные, индуцированные и спонтанные опухоли различного генеза и морфологического строения: солидные опухоли эпителиального, соединительнотканного и лимфоидного происхождения, различные формы лейкозов. Вместе с тем циклофосфан характеризуется сравнительно слабой избирательностью действия (Проценко Л.Д., Булкина З.П., 1985).
С химической точки зрения циклофосфан представляет собой N -бис-((З-хлорэтилуЪГ-О-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты или 2-оксо-2-ди-(3-хлорэтил)-аминотетрагидро-2,1,3-фосфоксазин и является представителем группы алкилирующих препаратов, в начале 40-х годов XX века положивших начало современной химиотерапии опухолей. В эти годы стали проводиться подробные исследования боевых отравляющих веществ, в частности азотистого иприта, или трихлорэтпламина. Исследования показали, что азотистый иприт оказывает специфическое цитотоксическое влияние на лимфоидные ткани и обладает противоопухолевой активностью. Вскоре был синтезирован ряд производных бис-(Р-хлорэтил)-амина и некоторые из них нашли применение в качестве противоопухолевых средств.
В терапевтических дозах циклофосфан ингибнрует синтез ДНК. Предполагают, что действие состоит в образовании поперечных сшивок между цепями ДНК, что препятствует ее репликации. Этими поперечными сшивками соединяются атомы азота двух остатков гуанина в положении 7, о чем свидетельствует наличие большого количества ди-(гуанин-7-илэтил)-суль-фида в гидролизате после взаимодействия ди-(2-хлорэтил)-сульфида с ДНК. На РНК препарат влияет значительно меньше.
Циклофосфан, как и другие производные хлорэтиламина, ввиду низкой избирательности механизма действия обладает многочисленными токсическими свойствами. Однако в эксперименте на животных его токсичность относительно невысока: LD5o его для крыс при однократном внутри-брюшинном введении - 200 мг/кг, а при внутривенном - 100 - 160 мг/кг. Препарат обладает очень высокой кумуляцией токсического действия: введение его в течение четырех дней по 1А LD50 приводит к более выраженной интоксикации, чем при однократном применении такой же суммарной дозы. Токсическое влияние однократной высокой дозы циклофосфана выражается в ухудшении общего состояния животных, снижении их массы, сонливости, вялости, появлении цистита, нарушении функции желудочно-кишечного тракта, угнетении гемопоэза (Проценко Л.Д., Булкина З.П., 1985). У животных возникают конъюктивиты, мелкие кровоизлияния, а иногда и некрозы на коже. Гибель животных при LD50 наступает в течение трех недель.
Метаболизм и фармакокинетика. Циклофосфамид и ифосфамид относятся к оксазафосфариновым пролекарствам, биоактивация которых осуществляется с помощью цитохромов Р450, преимущественно в печени. Гид-роксилирование в положении С-4 оксазафосфоринового кольца обусловливает образование 4-гидроксициклофосфамида, который находится в равновесии с его таутомерным альдофосфамидом. Последнее вещество может подвергаться спонтанной Р-элиминации с образованием акролеина и ипритных производных (фосфорамида иприта и изофосфорамида иприта) или может быть альтернативно инактивировано путем катализируемой альдегидде-гидрогеназой конверсии до карбоксифосфамида (Sladek N.E., 1988). К другим неактивным метаболитам относятся дихлорэтилциклофосфамид, образующийся при отдельной окислительной реакции N-деалкилирования, и 4-кетоциклофосфамид, который образуется при окислении 4-гидроксицикло-фосфамида (Sladek N.E., 1988).
Показано, что разные изоферменты цитохрома Р450 человека способны активировать оксазафосфорины in vitro, в частности, CYP2A6, CYP2B6, CYP3A (Chang Т.К.Н. et al., 1993; Walker D. et al., 1994) и все четыре индивидуальные формы CYP2C (Chang Т.К.Н. et al., 1997).
Синтез циклофосфамида был произведен с таким расчетом, чтобы препарат обладал избирательной противоопухолевой активностью, т.е. чтобы он был неактивным, находясь в крови, но при проникновении в опухолевые клетки быстро разлагался под влиянием содержащихся в них в относительно большом количестве фосфатаз (фосфамидаз) с освобождением алки-лирущего вещества - бис-((3-хлорэтил)-амина.
Установлено также, что в организме образуются фосфоросодержащие активные метаболиты циклофосфамида, также играющие важную роль в противоопухолевом эффекте. Основным метаболитом некоторые авторы считают г\РМ -ди-(2-хлорэтил)-диамид фосфорной кислоты. После метаболического раскрытия фосфорнолактонового цикла, происходящего в опухолевых клетках, образуется азиридиниевый ион активного метаболита. Изучение этой реакции с применением !Р показало, что алкилирующая способность азиридиниевого иона возрастает при падении рН от 7 до 5. Таким образом, избирательность направлена против злокачественных клеток с пониженным значением рН (Альберт А., 1989).
Активация циклофосфамида в организме происходит сравнительно быстро. Уже через 15 мин после внутрибрюшинного введения циклофосфа-на экспериментальным животным отмечается его максимальная концентрация в сыворотке крови, которая сохраняется в течение 1 ч. Затем происходит постепенное снижение содержания препарата и через 2 ч определяется лишь 50% максимальной радиоактивности. Продолжительность циркуляции его в крови около б ч (Проценко Л.Д., Булкина З.П., 1985). Через 30 мин после внутривенного введения меченого циклофосфами-да крысам радиоактивность во всех тканях (кроме мозга и костей) становится выше, чем в крови. Особенно значительно препарат накапливался в печени, содержимом кишечника, почках, мочевом пузыре, лимфатических сосудах и узлах, слюнных железах, костном мозге, соединительной ткани кожи. В некоторых органах (вилочковая железа, пульпа селезенки) накопление циклофосфамида происходит в более поздние сроки - через 6 - 12 ч. Медленнее всего препарат удалялся из почек, печени и содержимого кишечника.
После внутривенного введения 14С-циклофосфана препарат быстро проникает в жидкости и ткани больных со злокачественными заболеваниями. Максимальная активность после введения в дозе 40 мг/кг определяется через 2 ч, длительность циркуляции составляет 24 ч.
Отмечены значительные различия в метаболизме циклофосфамида у людей (Boddy A.V. et al., 1992; Yule S.M. et al., 1995). Так, за 4 дня с мочой выделяется 68% введенного препарата, наиболее интенсивно выделение происходит в течение первых .суток. В неизмененном виде с мочой экскре-тируется около 20%. В то же время установлено, что у некоторых пациентов экскреция циклофосфамида с мочой может быть недостаточной, что обусловлено фенотипическими вариациями в активности альдегиддегидрогена-зы. В кислой среде циклофосфамид спонтанно разрывается с образованием nor-азотистого иприта. Это свидетельствует о том, что при резких изменениях рН также могут регистрироваться различные профили метаболитов циклофосфамида в моче (Ludeman S.M. et al., 1992).
Тканевая реорганизация миокарда крыс при действии циклофосфана и производных бетулина
Тканевые изменения в миокарде крыс линии Вистар через 3 сут после введения циклофосфана сравнивали с контролем. Миокард интактных крыс Вистар имел строение, свойственное всем млекопитающим. Паренхиматозные клетки - кардиомиоциты - имели вытянутую форму, соединялись друг с другом с помощью вставочных дисков. На продольных срезах хорошо была видна поперечная исчерченность сердечных миоцитов. Ядра кардиомио-цитов овально-вытянутой формы, со светлой кариоплазмой, содержали небольшие глыбки гетерохроматина и одно-два ядрышка.
Кардиомиоциты в субэндокардиальном, среднем и субэпикардиаль-ном слоях миокарда желудочков сердца в большинстве случаев равномерно воспринимали обычные гистологические красители. У некоторых животных отмечалась неоднородность окрашивания мышечных сегментов, особенно в среднем слое миокарда обоих желудочков. Более интенсивное окрашивание саркоплазмы соответствовало контрактурным изменениям миофибрилл. Наоборот, разрежение саркоплазмы сердечных миоцитов соответствовало явлениям лизиса миофибрилл и саркоплазматического матрикса.
Вены в субэпикардиальном и среднем слоях миокарда были иногда расширенными и полнокровными. Интрамуральные артерии среднего и мелкого калибра находились преимущественно в состоянии вторичного пареза, реже спазма. Строма органа содержала немногочисленные фибробла-сты, расположенные между мышечными волокнами, а также нежные пучки коллагеновых волокон. Периваскулярно и перикапиллярно встречались тучные клетки.
У некоторых животных отмечались умеренные гемодинамические расстройства: субэпикардиальные венозные синусы и капилляры были расширены и полнокровны, интрамуральные артерии в состоянии спазма. Ад-вентиция артерий слабо инфильтрирована мононуклеарными клетками.
Тканевая реорганизация миокарда при введении циклофосфана. При введении циклофосфана миокард экспериментальных животных через 3 сут эксперимента сохранял нормальную архитектонику. В миокарде обоих желудочков сердца отмечалась умеренно выраженная мозаичность окрашивания кардиомиоцитов кислыми красителями: встречались как интенсивно воспринимающие эозин клетки, поврежденные по контрактурному типу, так слабоокрашенные кардиомиоциты, с разреженной саркоплазмой - значительными литическими повреждениями (рис. 1).
Для циклофосфанового повреждения миокарда характерным было появление кардиомиоцитов с выраженным лизисом саркоплазмы вокруг ядер (рис. 2, 3). Регистрировались также кардиомиоциты в состоянии некробиоза (рис. 4) и мелкоочаговые некрозы миокарда. Одновременно в миокарде преимущественно в периваскулярных зонах появлялись «малые» кардиомиоциты (см. рис. 2) — клетки, длина которых не превышала 40 мкм (средняя дли на основной массы кардиомиоцитов составляла 69,7±1,2 мкм), содержавшие по два близко расположенных ядра, что можно считать морфологическим эквивалентом прошедшего кариокинеза. Регистрировались кардиомноциты, в которых происходило митотическое деление ядер (рис. 5); такие кардиомноциты также чаще располагались вблизи сосудов и образовывали небольшие скопления. Часть мышечных волокон имела волнообразный вид.
У всех животных этой группы манифестировали гемодинамические нарушения: прежде всего венозное и капиллярное полнокровие, лимфостаз, периваскулярный и интерстициальный отек (рис. 6), иногда встречался сладж эритроцитов. Интрамуральные артерии находились в основном в состоянии спазма. Строма органа слабо инфильтрирована мононуклеарными клетками. Вокруг сосудов микроциркуляторного русла также встречаются скопления мононуклеаров.
Через 14 сут после введения циклофосфана в миокарде обоих желудочков сердца отмечалась более интенсивно выраженная мозаичность окрашивания кардиомиоцитов кислыми красителями по сравнению с предыдущим сроком. Возрастало количество интенсивно воспринимающих эозин клеток, поврежденных по контрактурному типу (рис. 7). Увеличивалось по сравнению с предыдущим сроком также количество кардиомиоцитов с признаками некробиоза, с литическими и вакуолеобразными изменениями цитоплазмы. Наблюдались небольшие очаги некроза и некробиоза кардиомиоцитов и их инфильтрация мононуклеарами (рис. 8). Некоторые сердечные миоциты выглядели атрофированными. Выраженным был полиморфизм ядер кардиомиоцитов, которые часто смещались на периферию клеток. В этот срок эксперимента в миокарде также встречались кардиомноциты небольших размеров, как двуядерные, так и одноядерные (рис. 9).
Строма миокарда была диффузно инфильтрирована мононуклеарными клетками, наблюдались также небольшие диффузно расположенные очаги инфильтрации - как периваскулярно, так и в интерстициальных пространствах. Строма миокарда также выглядела более отечной; сохранялись нарушения гемодинамики. В целом и ткань миокарда выглядела более разволок-ненной по сравнению с предыдущим сроком.
Интрамуральные артерии находились в основном в состоянии спазма, ядра эндотелиальных клеток выдавались в просвет сосудов, мышечный слой артерий был утолщен. Вены и капилляры расширены, заполнены плазмой и форменными элементами крови. В просвете капилляров некоторых животных наблюдался сладж эритроцитов. В периваскулярных пространствах располагались утолщенные пучки коллагеновых волокон (рис. 10). В межмышечной ткани миокарда некоторых животных наблюдались геморрагические и плазморрагические очаги.
Тканевая реорганизация миокарда при введении циклофосфана и бетулоновой кислоты. При введении экспериментальным животным циклофосфана и бетулоновой кислоты через 3 сут наблюдений общее строение миокарда сохранялось. В миокарде обоих желудочков сердца отмечалась более выраженная, чем при введении циклофосфана, мозаичность окрашивания кардиомиоцитов кислыми красителями: наряду с большим количеством интенсивно воспринимавших эозин клеток, поврежденных по контрак-турному типу, чаще встречались слабоокрашенные кардиомиоциты, с разреженной литически измененной саркоплазмой (рис. 11, 12). Регистрировалось значительное количество кардиомиоцитов с пикнотичными и смещенными к сарколемме ядрами. При этом наблюдался выраженный полиморфизм ядер. Более часто, чем в группе с введением только одного циклофосфана, встречались кардиомиоциты небольших размеров («малые» кардиомиоциты), как одноядерные, так и многоядерные с близко расположенными ядрами (рис. 13).
Как и при введении циклофосфана, отмечались выраженные нарушения гемодинамики. Интрамуральные артерии находились в основном в состоянии спазма: ядра эндотелиальных клеток выступали в просвет сосудов, мышечная оболочка выглядела утолщенной. Гемо динамические нарушения также проявлялись в виде венозного и капиллярного полнокровия и интер-стициального отека (рис. 14). В миокарде желудочков встречались очаги геморрагии и плазморрагий. При этом в ряде случаев можно было говорить о плазматическом пропитывании внеклеточного матрикса. В просветах многих сосудов присутствовала хлопьевидная масса.
Строма миокарда была умеренно диффузно инфильтрирована моно-нуклеарными клетками; скопления мононуклеаров встречались также вокруг сосудов микроциркуляторного русла. В межмышечных прослойках скопления мононуклеаров регистрировались, в основном, в тех участках, где отмечались истонченные (атрофированные) кардиомиоциты, или там, где сердечные миоциты были некробиотически изменены.
Через 14 сут в миокарде обоих желудочков сердца усиливалась моза-ичность окрашивания кардиомиоцитов кислыми красителями. Возрастало количество слабоокрашенных (литически измененных) кардиомиоцитов с разреженной саркоплазмой, но при этом в миокарде присутствовали кардиомиоциты с нормальными тинкториальными характеристиками (рис. 15). Сохранялся выраженный полиморфизм ядер сердечных миоцитов. В многих кардиомиоцитах вокруг ядер сохранялись выраженные литические изменения саркоплазмы. Усиливалась фенотипическая гетерогенность кардиомиоцитов - встречались как атрофированные, так и гипертрофированные клетки. Так же как и в предыдущих группах, в миокарде часто встречались одноядерные и двуядерные «малые» кардиомиоциты (рис. 16). Следует отметить, что в таких небольших мышечных сегментах отмечались контрактуры миофибриллярных пучков, но они были не более выраженными, чем в зрелых кардиомиоцитах и не могли существенно влиять на уменьшение их размеров.
Ткань миокарда выглядела разрыхленной, как и в предыдущем случае, что было обусловлено значительным межмышечным и периваскулярным отеком. Вены расширены, неравномерно полнокровны. Капилляры также расширены, заполнены плазмой и эритроцитами во всех слоях миокарда обоих желудочков. Интрамуральные артерии спазмированы, средний слой в них утолщен. Встречались геморрагические и плазморрагические очаги. Строма миокарда в некоторых случаях была более значительно, чем у животных предыдущей группы, диффузно инфильтрирована мононуклеарными клетками; отмечался также диффузный мелкоочаговый кардиосклероз и пе-риваскулярный склероз (рис. 17). В очагах гибели кардиомиоцитов скапливались мононуклеары (рис. 18). Периваскулярно встречались тучные клетки.
Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов крыс при моделировании циклофосфановых повреждений
Электронно-микроскопическое исследование миокарда крыс через 3 сут после введения циклофосфана в дозе 125 мг/кг выявило кардиомиоциты как с выраженными литическими и деструктивными изменениями основных органелл, так и клетки с мало измененной внутриклеточной организацией. Наиболее значительным изменениям при действии циклофосфана подвергались миофибриллярные пучки, пластинчатый комплекс Гольджи, митохонд-риальный компартмент и агранулярная саркоплазматическая сеть (АСС). Следует отметить, что эти ультраструктурные изменения в разных кардио-миоцитах встречались как изолированно друг от друга, так и носили соче-танный характер.
Особенностью кардиомиоцитов с незначительными ультраструктурными изменениями было присутствие в их саркоплазме большого количества гранул гликогена, тинкториальные свойства которых отличались от таковых у интактных животных. Следует отметить, что гранулы гликогена располагались не только в межмиофибриллярных, субсарколеммальных зонах и околоядерном пространстве, но и наблюдались между миофиламентами в миофибриллярных пучках (рис. 37). Избыточное содержание гликогена в кардиомиоцитах сопровождалось процессами его секвестрации (формированием светлых ободков вокруг скопления гранул гликогена), эти явления были наиболее выраженными в субсарколеммальной и околоядерной зонах (рис. 38). Повышенное содержание гликогена в кардиомиоцитах крыс после циклофосфановых воздействий может отражать нарушения или изменения в энергетическом обеспечении клеток.
Ультраструктура ядер кардиомиоцитов через 3 сут после введения крысам циклофосфана существенно не отличалась от таковой контрольных животных, но в то же время следует отметить часто встречающиеся глубокие инвагинации ядерной оболочки (иногда образование удлиненных ядерных «отростков») и смещение ядер в субсарколеммальную зону. Ядрышки часто были крупными, петлистыми, содержали в основном фибриллярный компонент нуклеолонемы; встречались также диспергированные ядрышки. В ядрах с глубокими инвагинациями ядерной оболочки было заметно увеличено количество маргинально расположенного гетерохроматина. Более выраженными были изменения околоядерной зоны кардиомиоцитов. Здесь часто встречался пластинчатый комплекс Гольджи с развитым вакуолярным аппаратом, постоянно фиксировались окаймленные везикулы. В то же время в ряде случаев отмечалось неравномерное расширение диктиосом, нарушение целостности их мембран (см. рис. 38). Вблизи комплекса Гольджи в некоторых клетках располагались аутофагосомы, формирующиеся остаточные тельца, липидные включения, часто наблюдалась секвестрация гликогена. В малоизмененных кардиомиоцитах фрагменты комплекса Гольджи встречались также и других участках клетки.
Изменения миофибриллярных пучков заключались в очаговом или диффузном лизисе миофибрилл (рис. 39). При этом в очагах лизиса мио-фибрилл в этот срок эксперимента всегда регистрировались многочисленные полисомы и наблюдались хаотично расположенные новообразованные миофиламенты, что свидетельствовало об активации процессов внутриклеточной регенерации. В миофибриллярной зоне кардиомиоцитов с выраженными литическими изменениями миофибрилл часто наблюдались расширенные везикулы АСС, которые принимали вид вакуолей. Однако расширения АСС при циклофосфановом воздействии никогда не были столь значительными, как при доксорубициновых повреждениях.
Анализ характера и степени ультраструктурных изменений митохондрий не выявил заметных деструктивных или литических повреждений этих органелл, но в местах их локализации, особенно в миофибриллярной зоне, постоянно встречались многочисленные миелиноподобные структуры (рис. 40) - остаточные тельца, образующиеся при деградации митохондрий.
Через 14 сут после введения циклофосфана в кардиомиоцитах сохранялись литические изменения миофибриллярных пучков и расширенные везикулы АСС. В некоторых кардиомиоцитах следует отметить появление расширений межмембранного околоядерного пространства (рис. 41), смещение ядер в субсарколеммальную зону. Часто встречались ядра причудливой формы (рис. 42), что может быть следствием повреждений белков цито скелета. Литические изменения миофибриллярных пучков регистрировались редко, в основном в области вставочных дисков. В участках лизиса миофиб-рилл, как и ранее, располагались многочисленные полисомы.
В этот срок более заметными становились повреждения митохондрий, часто отмечался очаговый лизис матрикса, деструкция крист, появление внутри органелл вакуолей с хлопьевидным содержимым. Появлялись кар-диомиоциты, в которых практически все митохондрии имели просветленный матрикс, уменьшенное количество крист, т.е. заметно отличались от типичных для кардиомиоцитов органелл (рис. 43). В этот срок эксперимента в саркоплазме часто встречались расширенные цистерны гранулярной сар-коплазматической сети с хлопьевидным содержимым (рис. 44). В саркоплазме кардиомиоцитов также присутствовало большое количество гранул гликогена, в миофибриллярной зоне и вблизи вставочных дисков регистрировались остаточные тельца, аутофагосомы.
Анализ характера и степени выраженности ультраструктурных изменений кардиомиоцитов после однократного воздействия циклофосфана в дозе 125 мг/кг выявил менее значительные повреждения их ультраструктур, чем при действии кардиотоксических доз доксорубицина или рубомицина. Эти данные коррелируют с меньшей токсичностью циклофосфана по сравнению с доксорубицином, менее выраженными проявлениями сердечной дисфункции и более низким уровнем летальности от развившейся сердечной недостаточности.
По данным проведенного ультраструктурного исследования, к основным видам ультраструктурных изменений кардиомиоцитов при действии циклофосфана можно отнести умеренно выраженные литические повреждения миофибрилл, расширения везикул гранулярной и агранулярной сарко-плазматической сети и деструкцию митохондрий с образованиехМ ми едино-подобных остаточных телец. Необходимо отметить, что однократное введение циклофосфана не подавляет длительно процессы внутриклеточной регенерации. В кардиомиоцитах, в очагах лизиса миофиламентов, постоянно регистрируются полисомы и новообразованные фибриллы. При циклофосфа-новых воздействиях в кардиомиоцитах сохраняется большое количество гликогена, который по своим ультраструктурным характеристикам отличается от а- и р-форм.
Внутриклеточная реорганизация кардиомиоцитов при введении производных бетулина в качестве моноагентов
Введение бетулоновой кислоты. Изменения кардиомиоцитов через 3 сут после ежедневного внутрижелудочного введения бетулоновой кислоты и ее (3-аланинового амида в дозе 50 мг/кг затрагивали преимущественно ядерный и миофибриллярный компартменты, а также агранулярную сарко-плазматическую сеть.
При введении бетулоновой кислоты в некоторых кардиомоцитах отмечался значительный лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне. В большинстве кардиомиоцитов чаще наблюдались выраженные расширения везикул агранулярнои саркоплазматическои сети (рис. 53). В таких расширениях регистрировались скопления хлопьевидного вещества, миелиноподобные структуры.
Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными (в основном мелкоочаговыми), в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов, хорошо были видны везикулы и трубочки агранулярнои саркоплазматическои сети. В большинстве клеток миофибриллярные пучки сохраняли свое строение.
Органеллы в сердечных миоцитах располагались в основном компактно. Митохондрии отличались полиморфизмом, располагались компактными тяжами между миофибриллярными пучками. В перинуклеарном пространстве и в подсарколеммальной зоне митохондрии имели меньшие размеры, округлую форму и свободно располагались в саркоплазме. Тонкое строение митохондрий было преимущественно сохранено.
Ядра кардиомиоцитов были овальной формы, с ровными контурами, ядерная мембрана образовывала лишь небольшие инвагинации. В ядрах содержался в основном эухроматин, гетерохроматин в небольших количествах располагался маргинально. Ядрышки были часто фрагментированными или диспергированными. Следует отметить также часто наблюдаемое умеренное расширение пространства между внутренней и наружной ядерными мембранами.
Следует отметить, что при действии бетулоновой кислоты отмечалось формирование сарколеммой пиноцитозных везикул и кавеол (рис. 54). В некоторых из таких пиноцитозных везикул различалась хлопьевидная субстанция. Подобные образования практически не выявляются в интактных кардиомиоцитах, отсутствовали они и при действии циклофосфана с или без последующего воздействия производных бетулина.
Через 14 сут ежедневного употребления бетулоновой кислоты в кардиомиоцитах не отмечалось каких-либо заметных изменений ультраструктуры. В некоторых клетках сохранялись незначительные расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети, особенно вблизи ядер. Встречались также мелкие очаги лизиса миофибриллярных пучков, в которых чаще всего наблюдались скопления рибосом и полисом.
Между тяжами миофибрилл располагались митохондрии, преимущественно овальной формы, плотно прилегавшие друг к другу. В большинстве кардиомиоцитов митохондрии содержали плотно упакованные кристы и варьировали по форме и размерам. Тонкое строение митохондрий преимущественно сохранялось, лишь в некоторых клетках встречались органеллы с литическими изменениями матрикса.
В центре клетки обычно располагались 1 - 2 крупных ядра овально-вытянутой формы, нуклеолемма которых иногда образовывала небольшие инвагинации. Ядра содержали гетерохроматин в виде небольших глыбок, локализованных преимущественно маргинально. Ядрышки в большинстве ядер кардиомиоцитов были либо фрагментированными, либо диспергированными.
Введение амида бетулоновой кислоты. При электронно-микроскопическом исследовании миокарда левого желудочка крыс Вистар, через 3 сут ежедневного введения раствора амида бетулоновой кислоты в дозе 50 мг/кг обнаружено, что популяция кардиомиоцитов у животных этой группы также неоднородна: наряду с клетками, сохранявшими нормальное строение, отмечалось значительное количество кардиомиоцитов с истонченными пучками миофибрилл и их мелкоочаговым лизисом.
В этой группе, как и в других, в некоторых кардиомиоцитах регистрировались в основном умеренные расширения межмембранного околоядерного пространства и везикул агранулярной саркоплазматической сети (рис. 55). В участках лизиса миофибрилл всегда регистрировались многочисленные полисомы. Несмотря на незначительную выраженность литических изменений кардиомиоцитов (рис. 56), следует отметить, что в большинстве клеток в ядрышках наблюдалась сегрегация гранулярного и фибриллярного компонентов.
Митохондрии отличались полиморфизмом - наряду с крупными орга-н ел лами присутствовали мелкие. Тонкое строение митохондрий в этот срок эксперимента было преимущественно сохранено, но иногда встречались ор-ганеллы с очаговыми литическими изменениями матрикса.
Ядра кардиомиоцитов были овальной формы, преимущественно с ровными контурами, ядерная мембрана образовывала лишь небольшие инвагинации. Ядра содержали в основном эухроматин, гетерохроматин в виде небольших глыбок располагался преимущественно маргинально. В ядрах большинства кардиомиоцитов ядрышки были петлистой формы, при этом часто отмечалась сегрегация гранулярного и фибриллярного компонентов нуклеолонемы, иногда наблюдалась фрагментация ядрышек.
Употребление амида бетулоновой кислоты в течение 14 сут вызывало более значительные изменения во внутриклеточной организации кардиомиоцитов. Прежде всего следует отметить наличие умеренно выраженных диффузных литических изменений миофибриллярных пучков во многих клетках; повсеместно в таких участках регистрировались многочисленные полисомы. Часто встречались таюке расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети, которые характерны для действия цитостатиков. В ядрах кардиомиоцитов часто присутствовали фрагментированные ядрышки.
Следующим важным обстоятельством, отличающим амид бетулоновой кислоты от других использованных химических соединений, являются изменения тонкой структуры митохондрий, которые регистрировались во многих кардиомиоцитах. Эти изменения заключались в очаговом и диффузном лизисе митохондриального матрикса, редукции крист и нарушении их упаковки (рис. 57). В некоторых кардиомиоцитах деструктивные изменения митохондрий были значительными, наблюдалось повреждение целостности их наружной и внутренней мембран; вблизи митохондрий часто обнаруживались скопления миелиноподобных структур. В то же время во многих кардиомиоцитах выявлялся хорошо развитый пластинчатый комплекс Голь-джи, в котором наблюдалась гиперплазия везикулярной составляющей (рис. 58).
По данным проведенного ультраструктурного исследования, бетуло-новая кислота и ее р-аланиновый амид вызывают сходные с циклофосфа-ном, но отличающиеся по выраженности изменения тонкой структуры кар-диомиоцитов. К основным видам повреждений кардиомиоцитов при действии производных бетулина можно отнести умеренные очаговые литическне изменения миофибрилл, расширения межмембранного околоядерного пространства; для амида бетулоновой кислоты - повреждения тонкой структуры митохондрий (лизис матрикса и дезорганизация крист).
