Введение к работе
Актуальность темы. Термин "шаперон(ы)", впервые использованный для обозначения функций ядерного белка нуклеоплазмина R.A.Laskey и соавт. в 1978 году, впоследствии был распространен на разнородную обширную группу белков, осуществляющих сборку, . разборку и поддержку определенной конформации полипептидов и олигомерных структур. Молекулярные шапероны, по-видимому, образуют основу "издательской системы" клетки. Она включает в себя биосинтез и созревание полипептидов, их доставку в клеточные органеллы, а также деградацию белков, неспособных осуществлять свои функции в результате поврежда-ющих воздействий и/или ошибок биосинтетического аппарата клетки. Очевидно, что шапероны принимают участие и необходимы во многих, если не во всех процессах, в которых наблюдаются изменения конформации белков. Семейство HSP70 - один из наиболее хорошо изученных классов шаперонов. Эти белки необходимы для жизнедеятельности клетки и в нормальных условиях, и при стрессе. Несмотря на имеющийся прогресс, изучение свойств белков этого семейства, спектра белков, с которыми они взаимодействуют, и специфики этих взаимодействий является актуальной темой клеточной биологии. Она непосредственно связа-на с вопросами интеграции и тонкой регуляции метаболизма клетки в изменяющихся условиях внешней среды, а также с изучением особенностей метаболизма специализированных клеток, к которым относятся и клетки скелетных мышц млекопитающих.
Цель и задачи исследования. Основные цели представленной работы: сравнить* физико-химические свойства HSP70 скелетных мышц млекопитающих и свойства родственных им белков других клеток; изучить причины накопления и особенности функции HSP70 в мышечных клетках.
Для достижения этих целей необходимо было решить следующие проблемы: получить препарат высокоочищенного HSP70 и поликлональные антитела, специфичные к HSP70;
создать инструментарий, необходимый для определения белков, связывающихся с HSP70; отработать тест-систему для определения шаперонной активности HSP70.
В соответствии с вышесказанным были сформулированы конкретные задачи исследования:
1). выделить и очистить HSP70 из скелетных мышц КРС1 ; 2). сравнить свойства полученного белка с имеющимися в литературе данными о свойствах белков, относящихся к -"семейству HSP70; 3). получить поликлональные антитела и с их помощью оценить уровень HSP70 в клетках мышечных волокон разного метаболического профиля до и после стресса, вызванного физической нагрузкой;
4). определить спектр белков, связывающихся с HSP70; 5). определить условия, в которых реализуются эти комплексы in vitro и оценить возможность их существования in vivo;
6). используя полученные результаты определить специфику функций HSP70 в скелетных мышцах млекопитающих.
Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) - один из ключевых ферментов гликолиза -взаимодействует с HSP70, находясь в форме ацил- и апо-, но не голоэнзима. HSP70 связывается как димером, так и с тетрамером GAPDH и способен всстанавливать активность фермента, ингибированного ATP/ADP. Высокое содержание HSP72 характерно для саркоплазмы медленных оксидативных волокон скелетных мышц крысы, что, согласно выдвинутой автором гипотезе, является результатом реализации in vivo условий способствующих формированию комплекса ацил-GAPDH - HSP70.
'Сокращения: КРС-хрупный рогатый скот; АТР-аденозннтрнфосфорная
кислота; ADP-аденозпндлфосфорная кислота; NAD(H)-
никотинамидадениндинуклеотид-фосфат(восстановленный); ДДС-
додецилсульфат; РМБР-фенилметансульфонил-фторид;ЕПТА-
этиленднаминтетрауксусная кислота; DTT-дитиотреитол
Научная и практическая ценность. Успех примененной в данной работе стратегии поиска и идентификации белков, специфично связыва-ющихся с HSP70, позволяет надеяться на применимость ее в работе с другими объектами. Наличие взаимодействия между шаперонами и ферментами гликолиза указывает на возможность существования особого механизма регуляции метаболизма клетки - через стабилизацию определенных (активных или нет) конформаций ферментов.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на ежегодных сессиях аспирантов во Всесоюзном институте генетики и развития животных (г. Пушкин) в марте-апреле 1991, 1992 и 1993 гг., на семинаре в Лаборатории биохимии мышц Института физкультуры (СПб) в марте 1993 г., на годовом отчетном докладе в Отделе клеточных культур ИНЦ РАН (СПб) в ноябре 1993 г. Частично результаты были представлены на трех международных конференциях: в июне 1994 г. на 4-м Europian Congress of Се!! Biology в г. Прага (Чехия), в июне 1994 г. на ежегодной встрече American College of Sports Medicine в г. Indianapolis (США) и на 10-м Rinshoken Conference в мае 1995 г. в г. Токио (Япония).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной час-тн, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 15 отечественных и 168 зарубежных источников. Текст изложен на 81 страницах. Работа содержит 18 рисунков (оригинальные фотографии и схемы) и 2 таблицы.
