Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
2. Материал и методы исследования 22
3. Результаты собственных исследований 28
3.1. Отдаленные изменения в эпителии канальцев почки у крыс после слабого радиационного воздействия 29
3.2. Некоторые особенности отдаленных этапов развития компенсаторной гипертрофии эпителия почечных канальцев у необлученных крыс. 39
3.3. Особенности развития компенсаторной гипертрофии эпителия канальцев почки на фоне пострадиационных изменений. 47
3.4. Особенности пострадиационных изменений почки в условиях развивающейся компенсаторной ее гипертрофии 55
4 Обсуждение 60
Выводы 73
- Материал и методы исследования
- Некоторые особенности отдаленных этапов развития компенсаторной гипертрофии эпителия почечных канальцев у необлученных крыс.
- Особенности развития компенсаторной гипертрофии эпителия канальцев почки на фоне пострадиационных изменений.
- Особенности пострадиационных изменений почки в условиях развивающейся компенсаторной ее гипертрофии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Экологическое неблагополучие, все возрастающее в течение последних десятилетий в большинстве стран мира, в значительной степени связано с угрозой слабого радиационного воздействия на большие группы населения (профессиональная деятельность, техногенные катастрофы). Решение научных аспектов этой проблемы явно запаздывает, хотя социальная ее цена оказывается чрезвычайно высокой. До сих пор нет определенности в оценках степени биологической опасности умеренных и малых (близких к пороговым) доз ионизирующих излучений. Представления о безусловной вредности облучения в любых дозах периодически возрождают сомнения в оправданности официально регламентируемых уровней допустимых лучевых нагрузок. Однако все чаще появляются публикации в поддержку точки зрения о полезности и даже необходимости такого облучения ( 2Гр) для стимуляции физиологических систем организма, усиливающей адаптационную устойчивость и резистентность (111,120,21).
Вместе с тем, накапливается информация (84, 54, 62, 87, 38, 36, 23) о значительном повышении уровня общей соматической заболеваемости, инвалидизации и смертности в группах населения, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях и/или когда-либо подвергавшегося воздействию облучения в умеренных или малых дозах, в том числе и не превышающих нормативный порог (0,25Гр). Отмеченные в этих случаях заболевания не имеют специфики, связанной с предшествующим радиационным воздействием, и отличаются широкой индивидуальной вариабельностью в сроках позднего проявления (годы после облучения), темпах прогрессии и тяжести течения (5, 6, 47, 48). Остается неясной их зависимость от столь отдаленного по времени и весьма слабого радиационного воздействия. Совершенно непонятно и значительное разнообразие возможного появления тех или иных нозологических форм
патологии в этих случаях. Но крепнет убеждение, что предшествующее лучевое повреждение благополучно репарируется, а рост заболеваемости является последствием психогенной (стрессорной) реакции, результатом радиофобии и хронического тревожного психоэмоционального напряжения (24).
Изучение этого вопроса в экспериментах на животных могло бы существенно упростить и прояснить сложившуюся дискуссионную ситуацию. Можно предположить, что если какие-либо следы слабого радиационного повреждения действительно сохраняются и даже прогрессируют, давая начало развитию выраженного патологического процесса, то их, конечно, следовало бы искать прежде всего в тех тканях организма, которые не обновляют или очень медленно обновляют свой клеточный состав. После облучения в больших (сублетальных) дозах именно такие ткани оказываются критическим звеном в развитии поздних осложнений (52, 4, 97). Именно в них развертывается большинство необратимых изменений, приводящих к серьезным нарушениям в деятельности нейро-эндокринной, сердечно-сосудистой, выделительной, костной систем организма, ухудшающих качество жизни и даже лимитирующих его существование (85, 133, 183, 42, 17, 18, 94, 104, 93, 10, 199, 1, 55, 90, 99, 147, 49, 20). Подобные ткани, однако, имеют давнюю репутацию радиорезистентных, поскольку значительное заметное повреждение относительно быстро обнаруживают лишь после облучения в дозах, превышающих ЮГр (97, 147, 168), в полном согласии с представлениями о прямой зависимости между радиочувствительностью и уровнем пролиферативной активности. Недоразумение с определением степени радиочувствительности медленнообновляющихся тканей выяснилось при использовании более значимых критериев оценки, учитывающих репарационную специфику таких клеточных систем в течение длительного времени после облучения (Стрелин Г.С.). Справедливо было бы
говорить не о высокой толерантности подобных тканей к лучевому повреждению, а о своеобразии его проявления там - в склонности длительно сохраняться в «скрытом» (латентном) состоянии, медленно и неполно его репарировать почти исключительно на внутриклеточном уровне, без восполнения клеточной убыли, поздно его проявлять в явной форме, усиливаться при неблагоприятных условиях и функциональных нагрузках (43-45, 142, 10, 13). Внутриклеточные процессы, лежащие в основе этих изменений, до сих пор не раскрыты, что не только оставляет существенные пробелы в теоретических концепциях развития лучевого повреждения вообще и формирования отдаленной лучевой патологии в частности, но также затрудняет понимание причин, стимулирующих появление разнообразных соматических болезней в отдаленные сроки после облучения в малых дозах, затрудняет разработку обоснованных мер профилактики и лечения отдаленных осложнений радиационного воздействия. Достижению успеха в этом направлении может содействовать изучение основополагающих закономерностей развития лучевого повреждения в интерфазных высокодифференцированных долгоживущих клетках медленно обновляющихся тканей.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является выяснение возможности проявления и прогрессии патологических изменений в тканях почки после воздействия ионизирующих излучений в диапазоне малых доз. Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:
• определить характер, масштабы и степень устойчивости изменений в эпителии проксимального отдела канальцев почки после облучения в малых дозах, с выделением деструктивных и репарационных компонентов;
• уточнить количественные характеристики адаптационных преобразований и деструктивных изменений в эпителии проксимальных
извитых канальцев почки на разных этапах компенсаторной ее
гиперфункции у необлученных крыс после односторонней нефрэктомии;
• установить особенности пострадиационных изменений в эпителии почечных канальцев при стимуляции там процессов компенсаторной гипертрофии в отдаленные сроки после воздействия ионизирующих излучений в малых дозах;
• установить возможность искажения структурных преобразований, сопровождающих компенсаторную гипертрофию почки, при дополнительном воздействии ионизирующих излучений в малых дозах.
Научная новизна
Впервые проведен комплексный морфологический (в том числе ультраструктурный) анализ динамики деструктивных и репаративных изменений в эпителии проксимального отдела нефрона почки крыс в течение длительного времени после воздействия ионизирующих излучений в диапазоне малых доз. На примере популяции нефроцитов получены новые доказательства специфики лучевого повреждения в медленно обновляющихся тканях, с характерным длительным и стойким его сохранением, наличием «скрытых» (латентных) компонентов. Получены новые сведения о возможности реализации такого латентного персистирующего повреждения в явной форме при дополнительной функциональной перегрузке, сопровождающейся гиперактивностью внутриклеточных метаболических процессов. Кроме этого установлено, что адаптационные преобразования в эпителии канальцев почки при ее компенсаторной гипертрофии искажаются при дополнительном воздействии малых доз ионизирующих излучений. Обнаружены, также ранее неизвестные, закономерности численных и размерных изменений митохондрий в клетках проксимального отдела нефрона после облучения,
при функциональной нагрузке и при разных вариантах их сочетанного воздействия.
Теоретическая и практическая значимость
Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием, уточняющим представления о ключевых механизмах формирования поздних осложнений лучевого воздействия на организм. Полученные результаты, в частности, могут представлять интерес для теоретических обобщений в малоизученной области радиобиологии медленно обновляющихся клеточных систем, содействовать разработке новых положений концепции о прогрессирующем пострадиационном ухудшении возможностей внутриклеточных механизмов репарации и риске стимуляции в этих условиях функциональных перегрузок и адаптационных перестроек в тканях, позволяют приблизится к решению вопроса о степени и характере биологической опасности воздействия ионизирующих излучений в диапазоне малых доз. Особое значение имеют полученные в работе подтверждения на примере эпителия канальцев почки и новые подробности о возникновении в медленно обновляющихся тканях необычного и пока еще плохо исследованного радиобиологического феномена, проявляющегося устойчивым ростом спонтанной повреждаемости и частоты отмирания клеток, независимо от митотического деления и связанного с длительным сохранением в клеточных популяциях необратимых латентных лучевых нарушений.
Полученные результаты могут быть полезными и в практическом плане, так как указывают на принципиально новые подходы к разработке мер предупреждения тяжелых патологических изменений в организме в отдаленные сроки после облучения и привлекают внимание к характеру опасности, которую несет облучение в диапазоне доз, близких к пороговым, что должно быть учтено в коррекции административных
решений, направленных на защиту социальных прав граждан и регламентацию условий их труда и быта как в условиях слабого радиационного воздействия, так и после его прекращения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Общее уоблучение крыс в дозах 0,25 и 1,5Гр вызывает устойчивое, длительно поддерживающееся, дозонезависимое повышение уровня спонтанной гибели в эпителии почечных канальцев, а также появление в большинстве клеток популяции комплекса разнообразных нелетальных изменений, а также репарационных и компенсаторных преобразований, сопровождающихся активизацией внутриклеточных метаболических процессов.
2. Дополнительное воздействие - стимуляция функции почки (после операции односторонней нефрэктомии) в отдаленные сроки после облучения вызывает значительное повышение уровня частоты появления поврежденных и гибнущих клеток.
3. Состояние гиперфункции ткани является фактором риска, усиливающим ее реакцию на слабое радиационное воздействие и ухудшающим отдаленные последствия этого воздействия.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000); на Всесоюзных конференциях «Медицинские последствия экстремальных воздействий на организм» (Санкт-Петербург, 2000) и «Новые технологии медицинской радиологии (Санкт-Петербург, 2001); на IV всесоюзном съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 2001); на V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург,
2002), на Всероссийской конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Московская область, 2002); на молодежной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», (Санкт-Петербург, 2003); на Экологическом форуме с международным участием "Environment and human health" (St.Petersburg, 2003); на научной конференции, посвященной 85-летию со дня основания ЦНИРРИ МЗ РФ «Современные технологии в клинической медицине», Санкт-Петербург, 2003.
Публикации. По результатам исследования опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение), выводов и списка цитированной литературы. Работа содержит 126 страниц машинописного текста, 61 рисунок. Библиографический указатель включает 204 работы. Весь материал в диссертации получен, обработан и проанализирован лично автором.
Материал и методы исследования
Выбор методических решений задач, поставленных в настоящей работе, потребовал учета особенностей изучаемой ткани. Эпителий канальцев почки отличается очень низким уровнем интенсивности пролиферативного обновления и, поэтому, как можно полагать, весьма своеобразно должен реагировать на лучевое повреждение (Г.С.Стрелин). С учетом этой специфики в нашем исследовании предусматривалось: —согласованное изучение внутриклеточных и популяционно-клеточных изменений; —последовательное изучение кинетики структурных изменений на протяжении длительных сроков после воздействия; —дифференцированный анализ реактивных, деструктивных, структурных и репарационных изменений с одновременной оценкой функционального статуса ткани; —выявление элементов скрытой недостаточности ткани и степени сохранности механизмов репарации после воздействия ионизирующих излучений с помощью дополнительной функциональной нагрузки; —применение методов количественной регистрации тканевых и внутриклеточных изменений с изучением реакции на воздействие не только по усредненным значениям показателей для всей клеточной популяции (ткани), но и по их вариабельности (вариационные распределения) в разных клеточных группах; —сопоставление изменений показателей во времени для определения возможности преемственной связи или согласованности процессов в ходе внутриклеточных и тканевых перестроек с использованием методов корреляционного и регрессионного анализа. 2.2. Экспериментальный материал Материалом для исследования послужили почки 115 белых беспородных крыс-самцов с исходной массой 180—200г. Выбор экспериментальных животных обусловлен тем, что грызуны являются традиционной биологической моделью в радиобиологических исследованиях и условия их содержания тоже относительно легко унифицировать. Животные были получены в питомнике РАН «Рапполово», содержались в стандартных условиях: клетки располагались в хорошо отапливаемом, освещенном и вентилируемом помещении, рацион питания устанавливался из расчета ЗОг пищи (стандартная диета) и 10 мл воды в сутки. 2.3. Структура эксперимента Проведено 3 серии опытов, включавших или только облучение животных, или различные комбинации этого воздействия с функциональной перегрузкой, стимулирующей процессы компенсаторной гипертрофии в изучаемой ткани. / Серия.
Общее однократное у-облучение в дозах 0,25 и 1,5Гр, с анализом возникающих изменений в отдаленные сроки (через 2 нед, 1-6мес) после этого воздействия. Контролем служили одновозрастные необлученные здоровые животные, находившиеся в тех же условиях содержания и питания, и подвергавшиеся таким же воздействиям, сопутствующим облучению («ложное облучение»). II Серия. Сочетание общего облучения животных в дозах 0,25 или 1,5Грс дополнительным воздействием - стимуляцией процессов 4 функциональной гипертрофии в тканях оставшейся почки после оперативного удаления контрлатеральной почки в различные сроки после лучевого воздействия (через 1 нед и 4 мес) - для анализа адаптационных возможностей тканей почки на фоне процессов, связанных с развитием отдаленных процессов - для установления особенностей постлучевых трансформаций долгоживущих (редкопролиферирующих в нормальных условиях) клеток, в условиях функциональной их перегрузке разной продолжительности (Знед и 2 мес) в ближайшие (1мес) или отдаленные (4мес) моменты радиационного периода. III Серия. Облучение ( в дозах 0,25 или 1,5Гр) предварительно оперированных (односторонняя нефрэктомия) животных - для изучения особенностей прохождения пострадиационных процессов в тканях оставшейся почки, находящихся в состоянии компенсаторной гипертрофии (гиперфункция продожительностью Знед, 2, 3 и 5мес) Для всех групп контролем служили одновозрастные интактные животные; животные необлученные оперированные (динамика процессов компенсаторной гипертрофии в оставшейся почке изучалась на протяжении от 3 нед до 5 мес после односторонней нефрэктомии, а также животные ложно-оперированные облученные и необлученные). 2.4,Облучение Животных подвергали без наркоза общему у-облучению1. Каждое животное фиксировали в специальной клетке-пенале из оргстекла, помещали в поле источника у-облучателя «НЕГО» на растоянии 1м (мощность дозы на рубеже облучения 195Р/час). Коэффициент необнородности поля составлял величину не более 8%. Отсчет дозы проводили по времени с контролем по дозиметру. Интактных необлученных животных подвергали аналогичным процедурам, сопутствующим облучению. 2.5. Оперативное вмешательство Операцию односторонней нефрэктомии проводили у наркотизированных эфиром животных. Используя брюшинный доступ, удаляли левую почку с предварительной перевязкой почечной артерии. «Ложно оперированные» животные подвергались тем же самым манипуляциям за исключением удаления почки. Реабилитационный период происходил и у оперированных, и у «ложно» оперированных животных в одинаковых условиях. і І / І 1 Облучение проводили на базе НИИ ВМ РФ. Автор выражает благодарность N[ сотрудникам за оказанную помощь при проведении облучения. 2.6. Объекты и методы исследования Ткань почки для исследований брали у животных после их декапитации. Умерщвление животных проводили всегда в одно и то же время (в 11-12 часов). Материал для световой микроскопии фиксировали в смеси Буэна. Фиксированный материал после обезвоживания заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5мкм окрашивали гематоксилин-эозином для общей характеристики структурных изменений в тканях почки и более подробного анализа эпителия проксимальных канальцев нефронов (изменение количества и размеров клеток), производили также подсчет количества лимфоцитов, инфилтрирующих в корковую зону почечной ткани. Для электронной микроскопии кусочки ткани почки размером 1мм3 фиксировали в модифицированном фиксаторе Карновского (смесь 2,5% глютаральдегида и 1,65% формальдегида, свежеприготовленного из параформа, на 0,2М фосфатном буфере, рН 7,4). Кусочки коркового вещества почки вырезали в фиксаторе и фиксировали в течение 2 часов при комнатной температуре, дополнительно фиксировали 1% раствором тетроксида осмия на том же буфере и после обезвоживания в этаноле через этиловый эфир заливали в аралдит. Первый этап контрастирования производили при обезвоживании кусочков ткани (в насыщенном растворе уранилацетата в 70% спирте, в течение 12 часов). Ультратонкие срезы (серебристого цвета) помещали на опорные сетки без подложки, дополнительно окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу, просматривали и фотографировали на электронном микроскопе JEM-100В. Учитывая задачи количественного анализа, все этапы обработки материала были строго унифицированы. Фотографическая съемка на электронном микроскопе проводилась (всегда) при первичном увеличении х8000, с постоянным контролем за калибровкой степени увеличения. При ультраструктурном исследовании оценивалось общее состояние клеток различных отделов нефрона и эндотелия сосудов.
Особое внимание было уделено внутриклеточным изменениям в проксимальном отделе нефрона. В данном отделе производился подсчет клеток с изменениями (гибнущие и поврежденные клетки), клетки содержащие фагосомы, количество фагосом в клетке, клетки с вакуолями. Методами стереологического анализа определяли размеры индивидуальных митохондрий, удельную численность и удельный объем митохондриальной массы, количество поврежденных митохондрий. Линейную протяженность, удельные объемы и численную плотность структур или тканевых пространств определяли с помощью полуавтоматических анализаторов МОР-10 и РУА на увеличенных с помощью фото-аппаратуры (в 2—14,5раз) изображениях электронограмм, полученных при первичном увеличении электронного микроскопа х8000. Данные о численности клеток с различными изменениями получали при анализе электронограмм и непосредственно с экрана микроскопа. Подсчет количества фагосом также производили с экрана микроскопа. При этом мы полагали, что даже небольшой рост числа данных органелл в клетке увеличивает вероятность их попадания в сечение большего количества клеток. Оценку изменения популяции клеток проводили на гистологических срезах. Для этого с помощью рисовального аппарата контуры канальцев и клеток были перенесены на бумагу и проанализированы с помощью полуавтоматических анализаторов МОР-10. Каждый этап эксперимента подкреплен данными о 3-7 животных. Количественная информация по каждому животному представлена подсчетом структур и 400—600 измерениями в 100 нефроцитах, случайно выбранных на единичных срезах из 2—4 тканевых блоков. Результаты экспериментальных воздействий сравнивали с данными, полученными от одновозрастных интактных контрольных животных, находившихся с экспериментальными животными в идентичных условиях питания и содержания. 2.7.
Некоторые особенности отдаленных этапов развития компенсаторной гипертрофии эпителия почечных канальцев у необлученных крыс.
После односторонней нефрэктомии у контрольных крыс в оставшейся контрлатеральной почке обнаруживается ряд структурных изменений, связанных с компенсаторной реакцией ткани на хроническое увеличение функциональной нагрузки. Через 21 сутки после операции заметно увеличивается объем почечных телец, диаметр канальцев, высота эпителиальных клеток. В извитых канальцах проксимального отдела нефрона чаще, чем у интактных животных, появляются клетки двуядерные или содержащие укрупненные ядра. Через 3-5мес после операции иногда обнаруживаются и единичные клетки с гигантскими ядрами, превышающими размеры обычных (по площади их сечения на срезах) в 2-4 раза, а также (редко) многоядерные (3 - 4ядра). К 21сут развития компенсаторной гипертрофии почки в эпителии проксимальных канальцев еще сохраняется повышенный уровень пролиферативной активности (МИ=0,022±0,027%о), который, однако, позже (через 2-5 мес) снижается, приближаясь к уровню соответствующих значений в контроле (0,083±0,023%о). С большей частотой, чем в контроле, в эпителии канальцев после операции появляются гибнущие клетки чаще с признаками отечной дегенерации (терминальные стадии прогрессирующего клеточного отека - с разрушением мембранных структур и опустошением набухающей цитоплазмы, повреждением ядра). Через 21-60 сутки после оперативного вмешательства, имитирующего все этапы односторонней нефрэктомии, но без удаления почки («ложная нефрэктомия») значительных патологических изменений не обнаруживается. В эпителии почечных канальцев, заметно чаще, чем у интактных контрольных животных, появляются тяжело поврежденные, гибнущие клетки, но общее число их невелико. Этот эффект проявляется, однако в самые ранние сроки (на 21сут) наблюдения, когда содержание подобных клеток приближается к уровню, отмеченному в случаях развивающейся компенсаторной гипертрофии почки. В более отдаленные сроки после ложной операции вероятность появления гибнущих клеток снижается, и они встречаются почти столь же редко, как и у контрольных животных.(рис.28). В тканях коркового вещества почки оперированных крыс усиливается лимфоидная инфильтрация, поддерживающаяся на высоком уровне в течение всего периода наблюдений, хотя и с некоторым снижением через 2-3мес.
Помимо лимфоцитов, в периваскулярных и перитубулярных пространствах почечной ткани появляются также плазмоциты и макрофаги. После «ложной операции» степень лимфоидной инфильтрации оказывается значительно меньшей, чем в ранние сроки после нефрэктомии (рис.29). Объем эпителиальных клеток проксимальных канальцев после операции значительно увеличивается. Отклонение кривых распределения клеток по величине (по сравнению с соответствующим распределением в контроле) указывает не только на их тотальное укрупнение, но и на появление чрезмерно гипертрофированных форм, не имеющих аналогов эпителии почечных канальцев у контрольных крыс (рис.30). Степень этих изменений, определившихся к 21сут после операции, стабильно сохраняется на протяжении всего последующего периода наблюдений приблизительно на одном уровне. Гипертрофия клеток сопровождается и некоторым укрупнением их ядер. Однако амплитуда этих изменений оказывается менее значительной сравнительно с изменениями объема цитоплазматической части. Средние значения объема ядер достоверно растут Уяд=8,13±1,8отн.ед. через 2-Змес после операции, а позже уменьшаются (78±2,8отн.ед.) приближаясь к уровню значений контроля (74,5±1,7отн.ед.). Эти изменения подтверждаются и характером отклонения кривых распределения клеточных ядер по величине (по сравнению с контролем) (см.рис.ЗО). Распределение клеток эпителия канальцев по соотносительному объему цитоплазмы и ядра показывает интегральную картину преимущественного роста клеток и несущественного укрупнения их ядер со временем по мере прогрессирования компенсаторной перестройки эпителия почечных канальцев после операции. При этом обнаруживается увеличение численности в общей популяции фракции очень мелких клеток с небольшими ядрами, отдельных клеток - гигантов с умеренно укрупненными ядрами. Вместе с тем, самые крупные (гигантские) ядра обнаруживаются в единичных клетках, существенно не отличающиеся своей величиной от окружающих (рис.31). Гипертрофия клеток эпителия почечных канальцев (во всех отделах нефрона), как показывает электронно-микроскопическое исследование, сопровождается увеличением частоты появления в их цитоплазме вакуолей (часто содержащих небольшое количество хлопьевидного материала умеренной электронной плотности), лизосом, фагосом, зернистых включений. Количество клеток с крупными и гигантскими вакуолями возрастает в эпителии проксимальных извитых канальцев до 13,5-17% (в контроле таких клеток не более 1%). Общее количество эпителиальных клеток, накапливающих в своей цитоплазме фагосомы, увеличивается до 80-90% (в контроле таковых 28%) и сохраняется постоянно на этом уровне в течение всего 5-ти месячного периода наблюдений после операции. Этот процесс сопровождается ростом численности и укрупнением подобных структур в отдельных клетках, причем встречаются клетки с очень крупными или необычно большим количеством мелких фагосом. Отдельные гигантские фагосомы обнаруживаются в 23,5% клеток на 21сут после операции, а позже содержание клеток, где они появляются, варьирует от 6% (через 2 мес) до 23-11% (через 3-5мес) в проксимальных извитых канальцах, причем подобные формы можно обнаружить в клетках и других отделов нефрона (у контрольных животных они или отсутствуют, или весьма редки). Рост численности фагосом в отдельных клетках происходит в течение 2 мес после операции, после чего их содержание длительно (до 5 мес) поддерживается на стабильно высоком уровне. После ложной операции также происходит рост числа клеток, содержащих фагосомы (до 46% против 28% в контроле), причем содержание фагосом в большинстве клеток остается минимальным (рис. 32). Появляются укрупненные и гигантские формы фагосом, но этот эффект выражен гораздо слабее, чем при стимуляции компенсаторной гипертрофии (до 5% клеток; при развитии гипертрофии до -27%). В контроле такие гигантские формы обычно не встречаются. Несколько возрастает в этих случаях количество клеток с крупными вакуолями (до 2% против 1% в контроле; при гипертрофии - 17%), хотя, в общем, вакуолизация эпителиальных клеток заметно не увеличивается.
У оперированных животных, как и у контрольных, при электронно-микроскопическом исследовании в эпителии проксимальных канальцев почки обнаруживаются клетки, умеренно отличающиеся от большинства клеток этой популяции степенью электронной плотности цитоплазматического матрикса и не имеющие каких-либо признаков повреждения внутриклеточных структур. Содержание клеток, выделяющихся повышенной степенью электронно-оптической плотности цитоплазмы (в пределах диапазона вариабельности, отмечаемого в контроле) достоверно увеличивается лишь ко 2 мес после операции (до 10%; в контроле 3,2%). Через 3 мес количество их сокращается до 4% и позже они обнаруживаются крайне редко. Клетки с признаками умеренного снижения электронно-оптической плотности цитоплазматического матрикса (вариации в пределах физиологического диапазона) через 21сут после операции обнаруживаются реже, чем в контроле, где содержание их достигает 2%. Позже их количество быстро растет (до 11% через 2 мес), а затем постепенно снижается (до 7-4% через 3-5мес). После «ложной операции» содержание в ткани таких клеток с измененной степенью оптической плотности цитоплазмы (но в пределах физиологического диапазона вариабельности) оказывается незначительным: уплотненные клетки обнаруживаются крайне редко, а содержание «светлых» клеток не превышает 1%. У оперированных животных в эпителии канальцев почки также появляются гигантские клетки (без признаков отека), с резко увеличенным объемом свободной цитоплазмы, содержащие относительно небольшое количество мелких митохондрий и немногочисленные мелкие вакуоли в апикальной зоне, и клетки, не имеющие заметных патологических изменений или признаков гипергидротации цитоплазматического матрикса, но выделяющиеся значительным накоплением жидкости в расширенных канальцах эндоплазматической сети и цистернах комплекса Гольджи. Количественный анализ митохондриалъного аппарата в эпителии проксимальных извитых канальцев. Митохондриальный аппарат в клетках эпителия проксимальных извитых канальцев в процессе развивающейся компенсаторной гипертрофии существенно трансформируется. Относительное количество (в единице объема цитоплазмы) митохондрий в растущих клетках снижается. Этот эффект прослеживается на протяжении всего периода наблюдений -первоначально как явно выраженная тенденция (первые два месяцев после операции), с последующей стабилизацией изменений - сохранением значений показателя численности митохондрий на довольно низком уровне. После «ложной операции» относительное количество митохондрий в большинстве клеток эпителия проксимальных канальцев сокращается (в пределах диапазона вариабельности в контроле, и в меньшей степени, чем после нефрэктомии). Количество клеток с минимальными значениями этого показателя растет за счет трансформации клеток с умеренными его значениями, и этот процесс не затрагивает клетки с высоким относительным содержанием митохондрий (рис.33).
Особенности развития компенсаторной гипертрофии эпителия канальцев почки на фоне пострадиационных изменений.
После операции односторонней нефрэктомии (на 21-60сут послеоперационного периода), проведенной в различные сроки (через 1-5мес) у предварительно облученных крыс (0,25-1,5Гр), не обнаруживается заметного укрупнения почечных телец и канальцев. В этих случаях величина эпителиальных клеток проксимальных канальцев растет в гораздо меньшей степени, чем у оперированных необлученных животных, причем значения соответствующих показателей несущественно отличаются от таковых в интактном контроле (средние значения клеток через 21сут после операции облученных животных (0,25-1,5Гр) достигают 471±17отн.ед. и 467 ±16 отн.ед., против 547±21отн.ед. у оперированных необлученных и 464±15отн.ед. у интактного контроля). Такая задержка роста клеток в условиях, стимулирующих процессы компенсаторной их гипертрофии, оказывается сходной после облучения в любой из использованных доз (0,25-1,5Гр), и воспроизводится в одинаковой степени - вне зависимости от того, в какой момент после облучения проводилась операция (1-5мес) (рис.40). Удлинение послеоперационного периода существенно не сглаживает различия в степени укрупнения клеток у облученных и необлученных оперированных животных (477± 15отн.ед. через бОсут после операции облученных в дозе 1,5Гр животных, против 575±23отн.ед. у необлученных). Кривые распределения эпителиальных клеток проксимальных канальцев по величине у облученных оперированных животных мало отличаются от таковых в интактном контроле, хотя и намечается некоторый сдвиг вправо (рис.41). Так у животных, оперированных через 4 месяца после облучения в дозе 0,25Гр или 1,5Гр (21сут после операции) объем клеток не изменяется, по сравнению с контролем, тогда как у оперированных (21 сут после операции) необлученных животных - возрастает. При сокращении временного промежутка между облучением и операцией и при такой же (21сут) и большей (бОсут) длительности функциональной нагрузки характер распределения не меняется. Таким образом, у облученных животных не происходит рост клеток после увеличения длительности функциональной нагрузки, а сам эффект задержки гипертрофии клеток длительно сохраняется после облучения в любой из использованных доз (см.рис.41). Компенсаторный рост эпителиальных клеток после операции, обнаруживающий такую существенную задержку у облученных животных, по сравнению с оперированными необлученными, сопровождается, однако, некоторым укрупнением их ядер.
Средние значения объема ядер при этом увеличиваются в такой же степени, как и у оперированных необлученных животных и одинаково после предшествующего облучения в любой из доз или при разной продолжительности послеоперационного периода. Так после операции, проведенной через 1нед или 4мес после облучения в дозе 1,5Гр, объем ядер достигает 84±2 отн.ед. и 86±3,8 отн.ед. при длительности послеоперационного периода в 21сут и 83±6,0 отн.ед. - при длительности послеоперационного периода в бОсут; после операции, проведенной через 4мес после облучения в дозе 0,25Гр - 82,5±2,1 отн.ед. и 84 ±4,6 отн.ед. при длительности послеоперационного периода в 21 и бОсут Анализ кривых распределения клеток по значениям объема их ядер также указывает на умеренный общий рост последних после комбинированного воздействия облучения и операции. При операции, проведенной через 4мес после облучения в дозе 0,25Гр, соответствующие кривые распределения отклоняются вправо (по сравнению с их положением в контроле), но меньше, чем после операции у необлученных животных (на 21сут послеоперационного периода). Такое же отклонение отмечается и после предварительного облучения в дозе 1,5Гр (рис.42). Операция, проведенная в более ранние сроки (с такой же продолжительностью послеоперационного периода) после облучения в дозе 1,5Гр (через 1нед) вызывает более значительный сдвиг кривых распределения. При большей продолжительности периода после операции сдвиг кривых распределения размеров ядер вправо увеличивается, причем эффект укрупнения клеточных ядер при операции, следующей через 4 мес после облучения в дозе 0,25Гр даже превосходит эффект, вызываемый операцией у необлученных животных, но после облучения в дозе 1,5Гр -оказывается менее значительным, чем у последних (см.рис.42). Анализ распределения эпителия проксимального отдела нефронов в системе координат, устанавливающих размерное соответствие между цитоплазматической и ядерной частями клеток, показывает, что после облучения, несмотря на стимуляцию компенсаторной гипертрофии (после операции нефрэктомии), рост цитоплазмы тормозится и появляется значительной количество клеток с небольшим объемом цитоплазмы и укрупненными или небольшими ядрами. Такой эффект отчетливо проявляется после облучения в дозе 0,25Гр (рис. 16,44). При операции проведенной в ранние сроки после облучения в большей дозе (1,5Гр) отмечается значительная задержка роста клеток, заметное количество гипертрофированных клеток появляется только при небольшой продолжительности послеоперационного периода (21сут); если операции проведена в более поздние сроки при удлинении послеоперационного периода количество гипертрофированных эпителиальных клеток снижается. В этих случаях возрастает содержание в популяции мелких клеток с укрупненными ядрами (рис. 16,43,44). Операция у облученных животных резко повышает частоту появления тяжело поврежденных и гибнущих клеток в эпителии почечных канальцев. Этот эффект дозонезависим (0,25-1,5Гр), и проявляется тем в большей степени, чем позже после облучения проводилось оперативное вмешательство и чем более продолжительным был послеоперационный период (рис.45).
Вместе с тем у облученных оперированных животных обнаруживались на гистологических препаратах редкие картины тотальной гибели эпителия единичных нефронов и дегенерация структур соответствующих клубочков. После «ложной операции», проведенной через 1нед после облучения, в эпителии проксимальных канальцев почки частота появления гибнущих клеток на 210) послеоперационного периода возрастает до 32±5%о (0,25Гр) и 36±3%о (1,5Гр), тогда как после облучения (без операции) - не превышает 19±5%о и 28±4%о, а при операции нефрэктомии после облучения -достигает 39±5%о и 51±8%о. После «ложной операции», проведенной через 4мес после облучения, частота появления гибнущих клеток на 21сут послеоперационного периода (55±9%о и 45±12%о), а на 60 сут после операционного периода - не отличается от уровня, обнаруживаемого к 6-ти месячному сроку поле облучения в соответствующих дозах у неоперированных животных (31±8%о и 29±6%о у облученных неоперированных и 34±7%о и 38±10%о у облученных «ложно оперированных»). Существенно увеличивается пролиферативная активность эпителия канальцев: при операции через 1 нед после облучения в дозе 1,5Гр МИ=0,308±0,012% и через 4мес - 0,27±0,042%о (через 21 сут после операции) и 0,2±0,01%о (через бОсут после операции); при операции после облучения в дозе 0,25Гр МИ=0,25±0,023%о и 0,18±0,019%о (через 21 и бОсут после операции). Лимфоидная инфильтрация почечной ткани в этих случаях усиливается - особенно после операции, проведенной в более отдаленные сроки после лучевого воздействия (рис.46). При электронно-микроскопическом исследовании в эпителии проксимальных канальцев у облученных оперированных крыс появляются, помимо относительно редких тяжело поврежденных и гибнущих клеток, также клетки с признаками незначительного частичного повреждения митохондрий, с небольшими очагами лизиса в цитоплазме, с крупными и гигантскими вакуолями, многочисленными или очень крупными фагосомоподобными структурами (рис.12). Такие картины редки в эпителии канальцев у интактных контрольных животных, немногочисленны у оперированных необлученных, но встречаются весьма часто у облученных оперированных. Возрастает количество эпителиальных клеток с признаками умеренного уплотнения, гиперхромии цитоплазмы или ее гипергидратации (вариации в пределах физиологического диапазона колебания и без заметных проявлений цитопатологии). У оперированных через 1 мес после облучения в дозе 0,25Гр животных частота появления таких клеток возрастает соответственно до 12 и 10%, а после облучения в дозе 1,5Гр - до26 и 11%, тогда как у интактных контрольных их содержание в популяции составляет 3 и 1,66%, а у оперированных необлученных - 3 и 3,5%. Количество клеток, где появляются крупные и гигантские фагосомы у облученных оперированных животных достигает соответственно 24,5 и 16,5% (после облучения в дозе 0,25Гр) и 11 и 24,6% (после облучения в дозе 1,5Гр). В контроле такие клетки редки: содержание клеток с крупными вакуолями колеблется около 1%, а клетки с крупными фагосомами отсутствуют. У оперированных необлученных животных количество таких клеток также значительно возрастает (соответственно до 17 и 27%), хотя общее количество клеток с крупными вакуолями и фагосомами у облученных оперированных животных достигает такого же уровня содержания, как и у оперированных необлученных 36-41 и 44%. Однако у последних степень укрупнения этих структур оказывается умеренной, а в случае сочетания воздействий часто появляются вакуоли и фагосомы гигантской величины. Количество клеток с крупными фагосомами при сочетании облучения и операции оказывается менее значительным, чем при одном только облучении в соответствующей дозе: после операции уровень накопления крупных фагосом в эпителии канальцев снижается на фоне изменений, вызванных предшествующим облучением. Количество же клеток с крупными вакуолями становится больше, чем у животных облученных неоперированных, только при сочетании операции с облучением в дозе 0,25Гр; при операции после облучения в дозе 1,5Гр содержание в эпителии канальцев таких клеток становиться меньшим, чем при одном только облучении в той же дозе. Общее количество клеток, содержащих фагосомы, в эпителии проксимального отдела почечных канальцев при сочетании облучения и операции значительно увеличивается по сравнению с интактным контролем, но в гораздо меньшей степени, чем у оперированных необлученных или у облученных (в тех же дозах) неоперированных животных
Особенности пострадиационных изменений почки в условиях развивающейся компенсаторной ее гипертрофии
У крыс, облученных на разных этапах развивающейся компенсаторной гипертрофии почки (после удаления контрлатеральной) в почечной ткани на гистологических препаратах обнаруживаются признаки умеренной гиперемии, увеличение диаметра почечных телец и канальцев, где появляются отдельные гигантские эпителиальные клетки с укрупненными ядрами или двухядерные. Митотическая активность в эпителии канальцев в этом случае возрастает более значительно, чем у оперированных необлученных или облученных неоперированных животных: при облучении в дозе 0,25Гр, проведенном через Знед или 4 мес после операции МИ составляет 0,27±0,03%о и 0,16±0,06%о соответственно, а при облучении в дозе 1,5Гр, проведенном через Знед или 4 мес после операции - 0,31±0,028%о и 0,216±0,003%о соответственно. Чаще, чем у контрольных животных, в этих случаях в эпителии канальцев встречаются одиночные гибнущие клетки (отечный тип и дегененрация), а также клетки, содержащие в цитоплазме крупные базофильные глыбчатые включения. При облучении в любой из доз (0,25-1,5Гр) - как в ранние (Знед- 2мес), так и в отдаленные (4мес) моменты после операции обнаруживаются редкие дегенерирующие нефроны. Облучение, проведенное в наиболее ранние сроки послеоперационного периода, стимулирует дополнительной увеличение (по сравнению с уровнем изменений у оперированных необлученных или облученных в той же дозе неоперированных животных) лимфоидной инфильтрации ткани коркового вещества почки, причем этот эффект оказывается наиболее значительным после облучения в дозе 1,5Гр. При облучении в более отдаленные сроки послеоперационного периода (через 4 мес) эффективность дополнительной стимуляции лимфоидной инфильтрации снижается: степень ее увеличения не превышает или незначительно превышает уровень, наблюдаемый у облученных неоперированных или оперированных необлученных животных. Следовательно, стимулирующий лимфоидную инфильтрацию почечной ткани эффект облучения падает со временем после операции — при удлинении периода функциональной перегрузки, к моменту стабилизации процессов компенсаторной гипертрофии.
Наиболее значительным это падение оказывается после дополнительного облучения в дозе 1,5Гр.(рис.53) На фоне изменений, стимулированных в тканях остающейся почки операцией односторонней нефрэктомии, облучение вызывает резкое увеличение частоты появления поврежденных и гибнущих клеток в эпителии почечных канальцев. Облучение в более ранние сроки (Знед) после операции дает максимальный повреждающий эффект, (более значительный при большей дозе). Лучевое воздействие через 2мес после операции вызывает меньший рост частоты появления гибнущих клеток, превышающий, однако, уровень их выхода после облучения у неоперированных животных (эффект одинаков после облучения в дозах диапазона 0,25-1,5Гр) или после операции у необлученных. Облучение через 4мес после операции вновь увеличивает частоту выхода гибнущих клеток в эпителии канальцев, (рис.54) В клетках эпителия проксимальных канальцев, не имеющих явных признаков цитопатологии, растет содержание фагосом (облучение через Знед после операции) (рис.13, 55). При этом общее количество клеток, обнаруживающих фагосомы увеличивается в большей степени, чем в случаях, когда облучение предшествует оперативному вмешательству, но почти так же, как и после операции у необлученных животных (в те же сроки после операции). При облучении в дозе (0,25-1,5Гр) через 2-4мес после операции этот эффект несколько уменьшается по сравнению с таковым у оперированных необлученных животных и оказывается менее выраженным, чем у облученных неоперированных, но большим, чем при операции на фоне предшествующего лучевого воздействия. Увеличивается и численное содержание фагосом в отдельных клетках эпителия проксимальных канальцев у оперированных животных, облученных (0,25-1,5Гр)в любые сроки операционного периода, но в меньшей степени, чем после операции у необлученных (см.рис.55). В клетках эпителия проксимальных канальцев, не имеющих признаков повреждения, при облучении в дозе 1,5Гр, проведенном в различные сроки после операции, относительное численное содержание митохондрий сокращается, но в меньшей степени, чем у оперированных необлученных животных (рис.56). Аналогичный эффект уменьшения относительного содержания митохондрий наблюдается и при облучении в дозе 0,25Гр после операции, причем сдвиг влево кривых распределения клеток, по значениям этого показателя выражен в меньшей степени, чем при облучении в дозе 1,5Гр). В этих случаях сокращение в клетках относительного содержания митохондрий сопровождается общим укрупнением последних и появлением мегаформ. При облучении через Знед-2мес после операции сдвиг вправо кривых распределения митохондрий по величине оказывается менее выражен, чем у оперированных необлученных животных. Снижение эффекта укрупнения значительнее при облучении в большей дозе (1,5Гр).
При облучении в меньшей дозе (0,25Гр) задержка эффекта укрупнения касается только исчезновения мегаформ, а кривые распределения близки к таковым у оперированных необлученных животных. При облучении в дозе 1,5Гр сдвиг кривых распределения растет во времени после операции (приближение к пострадиационному уровню стимуляции роста митохондрий). Эффект задержки роста митохондрий уменьшается при облучении в более поздние сроки после операции; сохраняется уменьшенное накопление укрупненных митохондрий, появляются мегаформы, отсутствующие в контроле, но в меньшем количестве, чем у оперированных необлученных животных (рис.57,58,59). Распределение клеток эпителия проксимальных канальцев по среднему значению объема митохондрий также указывает на их общий рост, хотя и менее значительный, чем у оперированных необлученных животных, и без появления клеток, где значения показателя выходили бы за границы их максимальных значений в контроле. При облучении через 2 мес после операции рост митохондрий восстанавливается почти до уровня, наблюдающегося у оперированных необлученных животных (в равной степени при любой из доз облучения), причем в этом случае заметно растет содержание клеток с минимальными значениями показателя. При облучении через 4мес после операции кривая распределения клеток по значениям показателя занимает промежуточное положение между положением таковой в контроле и после операции (без облучения) (рис.60). Кривые распределения клеток по значениям относительного суммарного объема митохондрий при облучении в дозе 0,25Гр через Знед после операции обнаруживает сдвиг вправо, существенно превышающий степень сходного отклонения у оперированных необлученных животных. При облучении в дозе 1,5Гр подобный сдвиг едва намечается и сопровождается одновременным небольшим увеличением содержания клеток с минимальными значениями показателя. При облучении в дозе 0,25Гр через 2мес после операции сдвиг вправо сохраняется, но становится менее значительным, тогда как при облучении в дозе 1,5Гр сдвиг вправо усиливается, хотя все еще отстает от степени сдвига у оперированных необлученных животных. При облучении (0,25-1,5Гр) через 4мес после операции сдвиг вправо кривых распределения клеток по значениям показателя сохраняется, но оказывается выраженным в значительно меньшей степени, чем у оперированных необлученных животных (рис.61).
