Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Классификация и маркеры нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва 11
1.2. Реакции чувствительных нейронов на повреждение их центральных и периферических отростков 14
1.2.1. Посттравматическое выживание чувствительных нейронов и регенерация их отростков 14
1.2.2. Экспрессия нейротрофических факторов в чувствительных нейронах в условиях дегенерации и последующей регенерации 21
1.3. Апоптоз в нервной системе 24
1.4. Роль антиоксидантной системы в посттравматической нейропротекции и регенерации периферического нерва 30
1.4.1. Активные формы кислорода 30
1.4.2. Участие свободных радикалов в окислительном стрессе ... 34
1.4.3. Ферменты, участвующие в антиоксидантной защите клетки 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Экспериментальные группы 40
2.1.1. Центральная аксотомия и травма периферического отростка нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов L4-L5 40
2.1.2. Морфометрический и иммуногистохимический методы 42
Определение концентрации Cu(II) и NO в чувствительных узлах спинномозговых нервов L4-L5 и седалищном нерве методом ЭПР 42
Результаты исследования 49
Характеристика нейронов чувствительного узла спинно мозгового нерва L5 интактной крысы 49
Количественные и фенотипические характеристики субпопуляций нейронов чувствительного узла L5 после центральной аксотомии, травмы периферического нерва и их комбинации 51
Экспрессия каспазы-9 в нейронах чувствительного узла спинномозгового нерва L5 62
Анализ уровня Cu-содержащих соединений и N0 в чувствительных узлах спинномозговых нервов L4-L5 и седалищном нерве 67
Обсуждение 72
Выводы 82
Литература 84
- Посттравматическое выживание чувствительных нейронов и регенерация их отростков
- Участие свободных радикалов в окислительном стрессе
- Центральная аксотомия и травма периферического отростка нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов L4-L5
- Количественные и фенотипические характеристики субпопуляций нейронов чувствительного узла L5 после центральной аксотомии, травмы периферического нерва и их комбинации
Введение к работе
Актуальность. Успех регенерации периферического нерва в значительной мере определяется способностью нейронов выживать после травмы. Феномен по-сттравматической дегенерации и гибели чувствительных нейронов детально описан в работах с повреждением их периферического отростка (Cajal, 1928; McKay et al., 2002). Имеются единичные работы, свидетельствующие о том, что фенотип регенерирующих чувствительных нейронов существенно различается при травме центрального или периферического отростков (Broude et al., 1997; Smith, Skene, 1997; Gavazzi et al., 2000). Данных о поведении чувствительных нейронов при нарушении целостности их центральных отростков явно недостаточно. Сравнительные исследования посттравматической гибели нейронов при повреждении центрального или периферического отростков практически отсутствуют.
При анализе поведения нейронов следует учитывать характер травмы. Становится очевидным, что чувствительные нейроны по-разному реагируют на перерезку и лигирование периферического отростка. В первом случае регенерация отростка разрешена, а при лигировании нерва она запрещена, что сказывается на способности этого нейрона к выживанию (Челышев, Рагинов, 2002, 2003). При центральной аксотомии регенерирующие аксоны псевдоуниполярных нейронов не могут проникнуть в спинной мозг через барьер в зоне входа задних корешков, образованный глиальными клетками, и в результате действия здесь ингибиторов роста аксонов (Fournier et al., 2001; Grimpe, 2005). Для преодоления этого барьера представляется принципиально важным исследование молекулярных и клеточных механизмов, контролирующих регенерацию центральных отростков чувствительных нейронов.
Количество псевдоуниполярных нейронов, вступающих в посттравматический апоптоз после повреждения периферического отростка, зависит от их принадлежности к конкретной субпопуляции (Рагинов, Челышев, 2003). Пере-
резка седалищного нерва у половозрелых крыс вызывает гибель части нейронов в поясничных чувствительных узлах (McKay et al., 2002; Рагинов, Челышев, 2003). При этом раньше и в наибольшем количестве гибнут малые нейроны с темным перикарионом и безмиелиновым отростком (В-клетки) и в меньшей мере большие нейроны со светлым перикарионом и миелинизированным отростком (А-клетки) (Tandrup et al., 2000). При лигировании седалищного нерва уменьшение количества малых непептидергических нейронов, связывающихся с изолектином В4 (IB4), более выражено, по сравнению с NF200 -нейронами (проприоцептивные нейроны большого диаметра и тактильные нейроны среднего диаметра) (Рагинов, Челышев, 2003). Однако, до сих пор остается неясной реакция чувствительных нейронов, принадлежащих конкретным субпопуляциям, в ответ на центральную аксотомию.
Большое значение для цитопротекции и восстановления функции травмированных нейронов имеют свободные радикалы и антиоксидантная система клетки (Rosenfeld et al., 1997; Borchelt et al., 1998). Молекулы свободных ради-калов, таких как NO, обладают значительной реакционной способностью (Реутов и др., 1997). NO выступает в роли ключевого регулятора функций клетки, в том числе процесса апоптоза (Брюне и др., 1998). Травма нейронов и нейроде-генеративные нарушения сопровождаются окислительным стрессом. На модели хронической травмы седалищного нерва установлено,' что активные формы кислорода ухудшают микроциркуляцию в иннервируемой ткани-мишени и замедляют восстановление функции нерва (Khalil, Khodr, 2001). Антиоксидантная система, в состав которой входит ряд функционально важных ферментов, защищает структуры нерва от повреждения. В последние годы активно исследу-ют роль Cu/Zn-супероксиддисмутазы (Cu/Zn-СОД) в антиоксиданти ой защите нейронов в центральной и периферической нервной системе, включая ее проти-воапоптозное действие (Rothstein et al., 1994; Sanvicens et al., 2004; Vaziri et al., 2004). Учитывая немногочисленные данные о влиянии Cu-содержащих соединений на регенерацию в периферической нервной системе, представляется ак-
7 туальным изучение содержания меди (Си) в чувствительных узлах и в седалищном нерве после травмы.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является оценка количества нейронов различных субпопуляций в чувствительном узле спинномозгового нерва крысы после центральной аксотомии и/или травмы их периферических отростков, а также уровня Cu-содержащих соединений в чувствительных узлах и седалищном нерве при его повреждении. В работе были поставлены следующие задачи:
1. Оценить общее количество нейронов в чувствительном узле спинномоз
гового нерва L5, а также количество NF200 - и IB4 -нейронов на 30-е и 60-е
сутки после:
-перерезки задних корешков (центральная аксотомия);
-перерезки седалищного нерва;
-лигирования седалищного нерва;
-центральной аксотомии в комбинации с перерезкой седалищного нерва;
-центральной аксотомии в комбинации с лигированием седалищного нерва.
Исследовать экспрессию каспазы-9 для оценки вероятности вступления в посттравматический апоптоз нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва L5 на 30-е сутки после центральной аксотомии.
Определить уровень Cu-содержащих соединений в чувствительных узлах спинномозговых нервов L4-L5 и седалищном нерве крысы на 1-е сутки после его перерезки методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
Научная новизна. Впервые экспериментально обосновано представление о том, что посттравматическая гибель нейронов чувствительного узла спинномозгово-го нерва более выражена при повреждении периферического, а не центрального . отростка. Впервые установлено, что поведение чувствительных нейронов, принадлежащих конкретным субпопуляциям, различается в ответ на центральную
аксотомию: количество NF200 -нейронов уменьшается в большей степени по
+ сравнению с IB4 -нейронами. Получены новые данные о различной динамике
численности нейронов этих субпопуляций в ходе регенерации после травмы периферических отростков и при центральной аксотомии. Новые результаты по исследованию динамики экспрессии каспазы-9 позволяют высказать предположение о том, что увеличение уровня этого фермента в клетке не может расцениваться как признак необратимого вступления клетки в апоптоз. Впервые показано, что после травмы периферического нерва концентрация Cu(II), входящей в состав молекул антиоксидантной защиты клетки, увеличивается в центральном отрезке нерва и не изменяется в периферическом отрезке.
Научно-практическая значимость. Данные работы значимы для понимания механизмов пластичности периферических нейронов, зависимости их выживания и фенотипа от действия нейротрофических сигналов, поступающих в пери-карион по различным каналам из ЦНС и из иннервируемой ткани-мишени. Полученные данные о динамике посттравматической гибели нейронов чувствительного узла позволяют оценить перспективы полноты восстановления сенсорной функции периферического нерва в клинической практике. Результаты исследований, свидетельствующие о различном поведении NF200 - и IB4 -нейронов при центральной аксотомии и повреждении периферического отростка, имеют практическое значение для прогноза восстановления функции афферентных волокон различной сенсорной модальности (болевая, температурная, тактильная чувствительность, проприорецепция). Полученные результаты обосновывают целесообразность использования модели стандартной травмы нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва в качестве тест-системы для эффективного скрининга новых фармакологических нейро-протекторов и особенно тех, которые способны избирательно поддерживать выживание чувствительных нейронов конкретных субпопуляций. Данные об уровне Cu-содержащих соединений в периферическом нерве имеют значение
9 для анализа молекулярных и клеточных механизмов антиоксидантной защиты клеток, взаимоотношений между антиоксидантной и контролирующей апоптоз системами, что важно для предотвращения гибели нейронов при нейродегене-ративных заболеваниях и травмах.
Положения, выносимые на защиту.
Посттравматическая гибель нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва более выражена при повреждении периферического, а не центрального отростка.
Характер изменения количества NF200- и Ш4-иммунопозитивных нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва различен при центральной аксотомии и при травме их периферических отростков. При центральной аксотомии в большей мере уменьшается количество КР200-иммунопозитивных нейронов.
Уровень важных для антиоксидантной защиты процесса регенерации Cu-содержащих соединений в центральном отрезке нерва возрастает через 1 сутки после его перерезки.
Апробация работы. Материалы работы доложены на Международном молодежном научном Форуме «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях» (Оренбург, 2003), 83-й ежегодной конференции немецкого физиологического общества (Лейпциг, 2004), международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика П.Я. Герке (Минск, 2004), научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004), IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», посвященной 190-летию Казанского государственного медицинского университета (2004),
10 Бабухинских чтениях в Орле (2004), 4-м форуме европейского неврологического общества (FENS) (Лиссабон, 2004), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), VII Российской молодежной научной школе «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (Казань, 2004), юбилейной научной конференции физического факультета, посвященной 200-летию Казанского государственного университета (2004), VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 182 источников. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 10 таблицами.
Работа осуществлена при поддержке грантов Федеральная целевая программа "Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2004 годы", государственный контракт №И0061/1315 от 16.09.02; фонда НИОКР РТ 06-6.6-231/2003; программа «Фундаментальные исследования и высшее образование» Американского фонда гражданских исследований и разработок (АФГИР), НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» (REC 007).
Посттравматическое выживание чувствительных нейронов и регенерация их отростков
Успех регенерации периферического нерва в значительной мере определяется способностью нейронов выживать после травмы. Становится все более очевидным, что псевдоуниполярные нейроны чувствительного узла по-разному реагируют на перерезку и лигирование периферического отростка. В первом случае регенерация отростка разрешена, а при лигировании нерва она запрещена (Челышев, Рагинов, 2002, 2003). При травме периферического нерва незначительная часть нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов гибнет путем апоптоза (Ekstrom, 1995; Swett et al., 1995; Groves et al., 1997). Основное количество аксотомированных чувствительных нейронов переживает трав-му. Перерезка седалищного нерва у половозрелых крыс вызывает гибель части нейронов чувствительного узла спинномозгового нерва (McKay et al., 2002; Ратинов, Челышев, 2003). При этом раньше и в наибольшем количестве гибнут малые нейроны с темным перикарионом и безмиелиновым отростком (В-клетки) и в меньшей мере большие со светлым перикарионом и миелинизи-рованным отростком (А-клетки) (Tandrup et al., 2000). При лигировании седалищного нерва уменьшение количества нейронов, связывающихся с IB4 и принадлежащих субпопуляции малых непептидергических нейронов, более выражено, по сравнению с NF200 -нейронами (проприоцептивные нейроны большого диаметра и тактильные нейроны среднего диаметра) (Рагинов, Челышев, 2003).
Чувствительные нейроны конкретных субпопуляций различаются по выраженности и соматотопике спраутинга центральных отростков в соседних де-нервированных путем ризотомии сегментах спинного мозга в ответ на перерезку периферического отростка (Belyantseva et al., 1999). Центральные отростки образующих миелиновые волокна нейронов после перерезки периферического нерва ветвятся в пределах пластинки III. Энергичный несоматотопический спраутинг центральных отростков малых CGRP -нейронов наблюдается вне зависимости от повреждения периферического отростка. Спраутинг центральных отростков малых непептидергических нейронов, связывающихся с IB4, характеризуется соматотопичностью, но также не зависит от повреждения периферического отростка (Belyantseva et al., 1999).
Непосредственно после травмы отростков переход от «медиаторного» режима функционирования к режиму роста (Titmus, Faber, 1990) в нейронах выражается в усилении синтеза быстро транспортируемого по аксону связанного с ростом белка 43 (GAP-43), медленно транспортируемых белков цитоскеле-та — актина и тубулина (Friedman et al., 1995), а также1 изменения синтеза ней-ромедиаторов и нейропептидов. Так, интактные чувствительные нейроны не экспрессируют галанин и вазоактивный интестинальный пептид (VIP), эти ней-ропептиды определяются в них после аксотомии (Zigmond et al., 1996). Эти данные согласуются с результатами, полученными на чувствительных нейронах тройничного узла. Здесь после аксотомии возрастает количество гала-нин-позитивных нейронов с 11% до 34%, нейронов, экспрессирующих нейро-пептид Y, — с 5% до 54%, VIP-позитивных нейронов — с 7 до 31%, а также увеличивается количество NO-синтаза-позитивных нейронов с 4% до 22% (Zhang et al., 1997).
Увеличение синтеза некоторых пептидов может способствовать выживанию аксотомированных нейронов и регенерации их аксонов. Например, VIP и нейропептид Y стимулируют рост аксонов в культуре нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов (White, Mansfield, 1996). Коэкспрессия пептидов и их рецепторов в аксотомированных нейронах свидетельствует в пользу представления об аутокринной и/или паракринной регуляции их синтеза (Zigmond et al., 1996).
Содержание других нейропептидов, наоборот, снижается. Так, в чувствительных нейронах после аксотомии уменьшается .экспрессия вещества Р (Zigmond et al., 1996). Не исключено, что возрастание экспрессии ряда нейропептидов в аксотомированных нейронах необходимо для поддержания уровня вторых посредников, функционирующих во внутриклеточных сигнальных путях контроля выживания и роста отростков (Sun et al., 1996).
Достаточно изучены также сдвиги «медиаторного» фенотипа чувствительных нейронов в возрастном аспекте. У интактных старых (30-месячных, т.е. середина продолжительности жизни) крыс, все из которых имели симптомы нарушения подвижности задних, но не передних конечностей, распределение чувствительных нейронов в шейном и поясничном отделах было аналогичным, что и в случае молодых животных (Bergman et al., 1996). У старых крыс отмечено увеличение экспрессии мРНК нейропептида Y и галанина и снижение уровня CGRP и вещества Р, а также незначительные изменения в содержании соматостатина (Bergman et al., 1996), что в целом напоминает сдвиги «медиа-торного» фенотипа чувствительных нейронов молодых крыс при повреждении аксона. Соотношение нейронов, экспрессирующих разные молекулярные формы тирозинкиназ trk, у старых крыс не меняется, но уменьшается экспрессия всех этих рецепторов нейротрофинов. Так как нейропептид Y присутствует в больших, а галанин в малых нейронах, более выраженный эффект со стороны нейропептида Y может свидетельствовать о том, что возрастные изменения в первую очередь затрагивают нейроны, связанные с механорецепцией, и в меньшей мере касаются ноцицептивных структур. Все зарегистрированные сдвиги преимущественно прослежены в чувствительных узлах спинномозговых нервов поясничного отдела, что соответствует проявлению симптомов нарушения подвижности именно в задних конечностях.
Существует представление, что чувствительные нейроны более уязвимы и чаще погибают, чем мотонейроны. Зарегистрированы и исключения. Так, у мышей перерезка седалищного нерва вызывает гибель 33% чувствительных нейронов и 50% мотонейронов (Houenou et al., 1996). Становится все более очевидным, что псевдоуниполярные нейроны чувствительного узла по-разному реагируют на перерезку и лигирование периферического отростка (Рагинов, Челышев, 2003). Регенерация аксонов при перерезке нерва в отличие от его ли-гирования считается разрешенной. В последнее время появляется все больше доказательств того, что возможность удлинения периферического отростка нейрона или его запрет по-разному сказываются на способности этого нейрона выживать после травмы. В первом случае вероятность гибели нейрона уменьшается, а во втором увеличивается (Челышев, Рагинов, 2002). Большинство нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов взрослой крысы выживает после передавливания нерва вплоть до 6 месяца после операции (Swett et al., 1995).
Участие свободных радикалов в окислительном стрессе
Важное значение для цитопротекции и восстановления функции при травме нейронов имеет антиоксидантная система клетки. В ее состав входит ряд функционально важных ферментов. Среди них Cu/Zn-СОД (СОДІ, цито-зольный фермент), Мп-супероксиддисмутаза (Mn-СОД, СОД2, митохондриаль-ный фермент), каталаза, цитохром с оксидаза.
Каталаза относится к классу оксидоредуктаз и является одним из основных ферментов разрушения активных форм кислорода, который катализирует процесс разложения токсичной Н2О2 на ( и НгО. К антиоксидантным ферментам относят также гемоксигеназу, которая не только сдерживает развитие окислительного стресса, но и регулирует процессы клеточной пролиферации и вероятность вступления в апоптоз клеток многих типов, включая нейроны. Так, нейроны обонятельной выстилки экспрессируют гемоксигеназу-1 и 2 (Chen et al., 2003). На мутантных мышах показано, что обе формы фермента поддерживают пролиферативную активность этих нейронов, что реализуется с участием системы СО-цГМФ. Гемоксигеназа-2 стимулирует выживание нейронов, сдерживает их вступление в апоптоз, что контролируется внутриклеточным содержанием билирубина (Chen et al., 2003).
Разобщающие белки (термогенины) сдерживают выработку активных форм кислорода в митохондриях путем снижения потенциала внутренней их мембраны. Так, в клетках нейробластомы человека при увеличении концентрации глюкозы до 60 мМ в культивиральной среде зарегистрировано снижение экспрессии разобщающего белка UCP3, увеличение потенциала внутренней мембраны митохондрий в 3,5 раза и параллельное угнетение нейритогенеза на 50% (Gustafsson et al., 2004). Авторами установлено также, что инсулиноподоб-ный фактор роста IGF-1 поддерживает экспрессию этих белков, чем объясняют защитное действие этого фактора при индуцированном гипергликемией окислительном стрессе и нейродегенерации. СОД выполняет роль эндогенного антиоксиданта, катализируя переход токсического супероксидного аниона (- в О2 и Н2О2. В последние годы активно исследуют роль этих ферментов в антиоксидантной защите нейронов в центральной и периферической нервной системе, в том числе их противоапоптоз-ное действие (Sanvicens et al., 2004; Vaziri et al., 2004).
У трансгенных мышей, несущих ген Cu/Zn-СОД человека, показана корреляция между дозой гена и выраженностью дегенеративных проявлений в нервно-мышечном синапсе, обычно наблюдаемых при синдроме Дауна. Выраженность подобных отклонений с возрастом зависит от дозы гена Cu/Zn-СОД (Avraham et al., 1991).
Мутантная формы Cu/Zn-СОД человека и Cu/Zn-СОД дикого типа мыши транспортируются антероградно по аксонам двигательных и чувствительных нейронов в составе медленной фазы (Borchelt et al., 1998). Авторы высказали предположение, что мутантная форма Cu/Zn-СОД вызывает локальные повреждения аксонов двигательных нейронов. Остаются неясными причины отсутствие влияния этого фермента на структуры чувствительных нейронов. Это может быть связано с тем, что в чувствительных нейронах наиболее реакционно-способной СОД является Мп-СОД. Действительно, через 12 суток после перерезки седалищного нерва иммуногистохимически и методом иммуноблотинга показано существенное увеличение (на 30%) активности Мп-СОД в чувствительных узлах и спинном мозге (Rosenfeld et al., 1997). При этом уровень экспрессии Cu/Zn-СОД практически не менялся. Однако- и в двигательных нейронах показаны наиболее выраженные сдвиги в системе Мп-СОД. Так, методом гибридизации in situ установлено увеличение уровня мРНК Мп-СОД в ядре лицевого нерва через 12.часов после его перерезки (Yoneda et al., 1992). Эффект был наиболее выраженным спустя 4-7 суток после аксотомии и исчезал к 56-м суткам.
Получены свидетельства противоаптозного действия СОД. Так, подавление активности Cu/Zn-СОД при помощи aHTH-Cu/Zn-СОД-ДНК поддерживает апоптоз нейронов (Rothstein et al., 1994). Активность Cu/Zn-СОД избирательно угнетается в присутствии цианида калия (Okada et al., 1999). Введение металло-порфиринов, обладающих антиоксидантной активностью, в культуру нейронов коры мозга от нокаутных по Mn-СОД мышей замедляло гибель клеток и увеличивало их выживание (Patel, 2003).
Через 4 месяца после полной перерезки спинного мозга крысы в области травмы показано значительное увеличение экспрессии субъединицы gp91phox НАДФН оксидазы, Mn-СОД, каталазы, глютатион пероксидазы, эндотелиаль-ной NO-синтазы и нитротирозина, в то время как экспрессия Cu/Zn-СОД и ней-рональной NO-синтазы не изменялась (Lee et al., 2004). Трансплантация в область разрыва фрагмента периферического нерва в комплексе с кислым фактором роста фибробластов (aFGF), приводящая к частичному восстановлению подвижности конечностей, вызывала разнонаправленные сдвиги антиоксидант-ных и NO-образующих ферментов. Так, при трансплантации нерва с aFGF активность Mn-СОД, каталазы, глютатион пероксидазы и эндотелиальной NO-синтазы значительно возрастала, при этом экспрессия gp91phox НАДФН оксидазы, нитротирозина и Cu/Zn-СОД не изменялась, а нейрональной NO-синтазы значительно уменьшалась. Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансплантация периферического нерва в комбинации с aFGF поддерживает в области травмы спинного мозга систему антиоксидантной защиты, важную для восстановления нервных связей. Однако, роль Cu/Zn -СОД в окислительном повреждении травмированных нервных структур и ее вклад в предотвращение этих нарушений, остается неясной. Прогресс в этой области особенно важен для эффективного скрининга новых фармакологических средств с высокой активностью блокаторов свободных радикалов и, следовательно, являющихся эффективными нейропротекторами, изыскание которых актуально для предотвращения гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и травмах. Учитывая немногочисленные данные о влиянии Cu-содержащих соединений на регенерацию в периферической нервной системе, представляется актуальным изучение содержания меди (Си) в чувствительных узлах спинномозгового нерва и в седалищном нерве после травмы для оценки роли данных соединений в процессах регенерации.
Центральная аксотомия и травма периферического отростка нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов L4-L5
Более выраженная гибель нейронов при перерезке по сравнению с лиги-рованием нерва согласуется с нашими данными о том, что при комбинации центральной аксотомии и лигирования нерва погибает меньше нейронов, чем при комбинации центральной аксотомии и перерезки нерва. Значительное количество гибнущих нейронов при комбинированной травме хорошо объяснимо в рамках концепции о нейропротекторной роли нейротрофических факторов. Можно полагать, что при комбинированной травме центрального и периферического отростков количество поступающих в перикарион нейротрофических сигналов существенно снижается, а это, в свою очередь, приводит к выраженной гибели нейронов. Анализ полученного нами экспериментального материала дает основание полагать, что посттравматическая гибель нейронов чувстви-тельного узла спинномозгового нерва более выражена при повреждении периферического, а не центрального отростка.
К 30-м суткам после травмы количество NF200 -нейронов уменьшается независимо от места ее приложения. При комбинированном повреждении (центральная аксотомия + перерезка нерва) суммирования эффектов каждой травмы в отдельности не происходит. Это может означать, что снижение численности популяции NF200 -нейронов не зависит от наличия связи этих нейронов с клетками-мишенями в ЦНС или иннервируемом домене на периферии.
Иная картина на этом сроке наблюдается в отношении IB4 -нейронов. Уменьшение численности популяции этих нейронов при комбинированной травме (центральная аксотомия + перерезка нерва) соответствует суммарному уменьшению количества нейронов после центральной аксотомии и перерезки нерва по отдельности. IB4 -нейроны, как показали наши эксперименты, в меньшей степени реагируют на травму их центральных отростков. Действительно, к 30-м суткам после перерезки периферического отростка количество IB4 -нейронов в три раза меньше, чем после центральной аксотомии. Это может быть связано со значи-тельным уменьшением потока нейротрофических факторов, поступающих в перикарион по центральному отростку, по сравнению с потоком этих же или, возможно, других нейротрофических факторов, ретроградно транспортирующихся в перикарион по периферическому отростку. Подобный механизм применим для объяснения более выраженного уменьшения количества NF200 -нейронов после центральной аксотомии.
В чувствительных узлах спинномозгового нерва L5 после травмы седалищного нерва (перерезка, лигирование), а также центральной аксотомии в комбинации с перерезкой этого нерва отмечено присутствие NF200 -волокон, расположенных в непосредственной близости от перикарионов NF200 - и NF200 -HeftpoHOB. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что NF200 -волокна преимущественно окружают NF200 -нейроны. Это может быть связано с выработкой в этих нейронах или окружающих их клетках-сателлитах факторов, привлекающих NF200 -волокона. Основным условием для роста и ветвления этих волокон и формирования «корзинок» вокруг нейронов является травма периферического отростка. При центральной аксотомии подобный эффект не наблюдался.
«Корзинки», образующиеся NF200 -волокнами, вокруг перикарионов нейронов чувствительного узла, могут быть сформированы афферентными периферическими отростками псевдоуниполярных нейронов, которые возвратились в чувствительный узел в поисках нейротрофической поддержки. Они могут также представлять собой отростки мотонейронов, проходящих транзитом в непосредственной близости от перикарионов чувствительных нейронов. Поскольку при одновременном нарушении целостности центральных и периферических отростков нейронов чувствительного узла формируется наибольшее количество подобных «корзинок», можно полагать, что выявленные NF200 -волокона принадлежат №200-иммунопозитивным чувствительным нейронам.
После центральной аксотомии в комбинации с лигированием седалищного нерва количество NF200 -волокон, окружающих NF200 -нейроны, на 60-е сутки в 6,6 раза больше, чем в группе с лигированием нерва, и в 2 раза больше количества таковых, окружающих ОТ200--нейроны. При перерезке нерва сохраняется возможность для прорастания периферических отростков из центрального отрезка нерва в дистальный. Иная картина развивается при лигиро-вании нерва. Не имея возможности установить контакт со своими клетками-мишенями на периферии, эти периферические отростки, как уже упоминалось, возвращаются к местам локализации перикарионов нейронов в поисках нейро-трофических факторов или растут в чувствительный узел по градиенту концентрации специфических факторов хемотаксиса для данных волокон, где и образуют специфические структуры в виде «корзинок». Именно поэтому количество NF200 -волокон, окружающих NF200 -нейроны, в условиях комбинации центральной аксотомии с лигированием нерва существенно больше, чем при комбинации центральной аксотомии с перерезкой нерва.
Просматривается прямая аналогия между ветвлением NF200 -волокон и ветвлением симпатических волокон в чувствительном узле спинномозгового нерва в ответ на травму периферических отростков псевдоуниполярных нейронов. Имеются данные о ветвлении адренергических волокон преимущественно вблизи перикарионов больших чувствительных нейронов (Abbadie, Basbaum, 1998; Zhou et al., 1999c). При частичной перерезке нерва ветвление симпатических волокон наблюдается не только вблизи перикарионов поврежденных нейронов спинальных ганглиев (Ma, Bisby, 2000). Аномальную арборизацию симпатических терминален и образование «корзинок» вокруг некоторых нейронов чувствительных узлов вызывает прежде всего нейротрофин NGF (Jones et al., . 1999), а также нейропоэтические цитокины LIF (Thompson, Majithia, 1998) и IL-6 (Murphy P.G., 1999). Ветвление симпатических волокон в спинальном ганглии L5 после перерезки соответствующего спинномозгового нерва поддерживают нейротрофины (NGF, NT-3 и BDNF) (Deng et al., 2000). Источником этих факторов, как уже отмечалось, служат расположенные вокруг этих факторов, как уже отмечалось, служат расположенные вокруг нейронов клетки-сателлиты. Ветвящиеся адренергические терминали вплотную подходят к клеткам-сателлитам, дающим положительную иммуноцитохимическую реакцию на белок. Весьма вероятно, что нейротрофины, связывающиеся с белком р75 в мембране активированных клеток-сателлитов, создают градиент, по которому ориентируются растущие симпатические аксоны.
Количественные и фенотипические характеристики субпопуляций нейронов чувствительного узла L5 после центральной аксотомии, травмы периферического нерва и их комбинации
Исследование механизмов запрограммированной клеточной гибели в нескольких субпопуляциях развивающихся постмитотических малодифференци-рованных нейронов в условиях модификации генома путем выключения генов узловых проапоптозных протеаз, а именно каспазы-3 и каспазы-9, показало, что количество гибнущих клеток не изменяется (Oppenheim et al., 2001). Авторы высказали предположение, что нейроны, в том числе и чувствительные, могут погибать на более поздних стадиях дифференцировки, причем, не только путем апоптоза. Подобные каспаза-дефицитные нейроны не давали более выраженную реакцию с одним из самых надежных маркеров апоптоза TUNEL, по срав-нению с модифицированными нейронами. Эти данные свидетельствуют о том, что гибель нейронов может реализоваться по каспаза-независимым внутриклеточным сигнальным путям. В рамках этого представления объяснима зарегистрированная нами динамика количества IB4 -нейронов на фоне увеличения экспрессии в них каспазы-9. Увеличение экспрессии каспазы-9 в чувствительных нейронах после центральной аксотомии без изменения общего количества нейронов в ганглии позволяет утверждать, что увеличение ее экспрессии не является достоверным доказательством вступления нейронов в апоптоз. Это предположение согласуется с данными Cheng, Zochodne (2003). В своей работе авторы показали, что в чувствительных нейронах при диабетической полиней ропатии не было зарегистрировано положительной реакции с маркером третьей стадии апоптоза — TUNEL, несмотря на то, что при этом в нейронах была отмечена экспрессия каспазы-3 как в ядре, так и в цитоплазме. С другой стороны, при хронической гипергликемии нейроны чувствительных узлов спинномозговых нервов L5 гибнут путем апоптоза в результате окислительного стресса, что подтверждается электрофизиологическими данными, а также увеличением экспрессии каспазы-3 в их перикарионах (Schmeichel et al., 2003). Окислительный стресс вследствие усиления образования в митохондриях активных форм кислорода поддерживает экспрессию и/или внутриклеточное распределение проапоптозного белка Вах. Этот белок взаимодействует с наружной мембраной митохондрий, что приводит к выходу из них молекул, инициирующих апоптоз, например, цитохрома с. Вместе с тем, выход цитохрома с стимулирует последующее образование свободных радикалов в тех же мито-хондриях, что поддерживает работу проапоптозных сигнальных путей. Повышение содержания кальция в митохондриях может также вызывать выделение цитохрома с из митохондрий и образованию супероксида с участием Вах-независимого механизма. Кальций активирует переход проницаемости внутренней мембраны митохондрий, вызывая набухание органелл, разрыв наружной мембраны с последующей полной дезинтегацией митохондрий.
Активные формы кислорода, в свою очередь, индуцируют образование ряда транскрипционных факторов, таких как NF-kB и уже упоминавшийся АР-1. Эти транскрипционные факторы активируют гены, кодирующие антиок-сидантные ферменты (каталаза), продукты, участвующие в регенерационных процессах (коллагеназа, стромелизин), цитокины, рецепторы в плазмолемме, молекулы адгезии и факторы роста.
На культуре клеток было показано, что нейроны способны выживать в отсутствие нейротрофинов течение 2-х недель. При этом ингибирование PI 3-К и протеинкиназы С (РКС) приводило к значительному уменьшению количества выживающих нейронов, что свидетельствует о существовании нейротрофин-независимого механизма гибели клеток (Dodge et al., 2002).
Уровень важных для антиоксидантной защиты процесса регенерации Cu-содержащих соединений в центральном отрезке нерва возрастает через 1 сутки после его перерезки. Это подтверждает представление о нарушении баланса между про- и антиоксидантной системой в ткани во время окислительного стресса вследствие окислительной модификации биомолекул (Подколзин и др., 2000; Djordjevic, 2004). Активные формы кислорода нарушают функцию мито 81 . хондрий и активируют каспазы (Kovacs et al., 2002; Bissonnette et al., 2004). Эти изменения сопровождаются гибелью нейронов, что предотвращается введением антиоксидантов. Защитой от нейродегенервативных изменений служит антиоксидантная система, в состав которой входит ряд функционально важных ферментов, в том числе Cu/Zn-супероксиддисмутаза. Увеличение концентрации Cu-содержащих соединений в центральном отрезке седалищного нерва спустя 24 часа после травмы может свидетельствовать об их участии в реакциях анти-оксидантной защиты структур нерва в ответ на повреждение.
