Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 17
1.1. Эндогенность и адаптивность околочасовых биологических ритмов 17
1.2. Околочасовые биологические ритмы в сетчатке глаза млекопитающих на различных этапах онтогенеза 31
1.3. Структура и цитохимия дефинитивной сетчатой оболочки глаза млекопитающих 35
1.4. Структура и цитохимия сетчатой оболочки глаза млекопитающих в пре- и постнатальном онтогенезе 46
1.5. Зимняя спячка млекопитающих как состояние естественного гипобиоза, адаптированное к неблагоприятным условиям внешней среды 53
1.6. Морфофизиологические особенности искусственной гипотермии 69
1.7. Повреждающее действие сероводородсодержащих газов на организм человека и других млекопитающих 73
Глава 2. Материал и методы исследования 82
2.1. Общегистологические методы исследования 83
2.2. Нейрогистологические методы исследования 83
2.3. Метод цитофотометрии 83
2.4. Радиоавтографический и биохимический методы 84
Глава 3. Собственные исследования 94
3.1. Структура сетчатой оболочки глаза на различных этапах пренатального и постнатального онтогенеза, у взрослых активных и гибернирующих сусликов 94
3.2. Динамика размеров ганглионарных нейронов, их структурных компонентов и особенности белкового метаболизма в процессе постнатального онтогенеза, а также у активных и гибернирующих сусликов 130
3.2.1. Результаты цитофотометрического метода исследования 130
3.2.2. Результаты радиоавтографического и биохимического методов исследования 179
3.3. Структура ганглионарных нейронов и околочасовые клеточные ритмы белкового метаболизма в сетчатой оболочке глаза сусликов при токсическом воздействии 191
3.4. Структура пинеалоцитов и околочасовые клеточные ритмы в эпифизе у активных, гибернирующих и подвергшихся токсическому воздействию сусликов 195
3.5. Околочасовые клеточные ритмы в сетчатой оболочке глаза активных и находящихся в состоянии холодового оцепенения амфибий 204
3.6. Околочасовые клеточные ритмы в клетках печени крыс при Токсическом воздействии и искусственной гипотермии 207
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 216
Выводы 239
Литература 241
- Околочасовые биологические ритмы в сетчатке глаза млекопитающих на различных этапах онтогенеза
- Зимняя спячка млекопитающих как состояние естественного гипобиоза, адаптированное к неблагоприятным условиям внешней среды
- Результаты радиоавтографического и биохимического методов исследования
- Околочасовые клеточные ритмы в сетчатой оболочке глаза активных и находящихся в состоянии холодового оцепенения амфибий
Введение к работе
Актуальность исследования. Пространство и время представляют собой основные формы существования материи и, следовательно, для любых живых систем свойственна пространственно-временная организация (Романов Ю.А.,1991;1994;1998). Периодически повторяющиеся во времени количественные и связанные с ними качественные изменения в живой природе, происходящие на всех уровнях организации, определяются как биологические ритмы. Факты, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют об универсальности и атрибутивности феномена биологических ритмов в живой природе. По образному выражению Я. Пэрна: «Мы можем смотреть на жизнь нашего тела как сложную ткань из бесчисленных и разнообразных ритмов».
Если пространственная организация живых систем изучалась морфологами со времён Галена и Гиппократа, то временные аспекты существования живого начали исследоваться относительно недавно (Halberg F.,Reinberg А., 1967). Между тем, хронобиологическая структура любого организма весьма лабильна и уязвима, а её нарушение - десинхроноз, характеризующийся снижением адптивной способности организма (дезадаптацией) в связи с выходом физиологических процессов за пределы гомеостатических возможностей, приводит к развитию патологических изменений и даже смерти (Фролов В.А., 1998; Мезенцев СВ., Кузьминых В.Г.,2003). Б.С Алякринский пишет, что там, где имеется патологический процесс, обнаруживаются и явления десинхроноза (Алякринский B.C., 1989).
В связи с выше изложенным, изучение биологических ритмов, их устойчивости, факторов на них влияющих, периодических изме- нений чувствительности организма к условиям внешней среды является важнейшей, но, к сожалению, малоизученной проблемой биологии, физиологии и медицины (Комаров Ф.И., 1990г.; Романов Ю.А., Голиченков В.А., 1998; Шапошников В.И. и др.,2001; Казначеев В.П., Трофимов Ф.В.,2003).
Среди всех прочих биологических ритмов особое место занимают околочасовые (циркахоральные) клеточные ритмы. Не имея явных экзогенных инициаторов, такие колебательные процессы, тем не менее, они ведут себя как выраженные осцилляторы. Околочасовые биологические ритмы в наибольшей степени эндогенны, связаны со спецификой клеточного метаболизма, отражают его нестабильность и, следовательно, могут служить вполне надёжным маркером морфологической зрелости и функциональной активности ткани (Бродский В.Я.,Дубовая Т. К. и др., 1995; Бродский В.Я., Нечаева Н.В., 1988,2000; Бродский В.Я., 2000; Бекчанов А.Н. и др. 2001 , Brodsky V.Y.et al., 2003, 2004, 2005;).
Если среднепериодные и длиннопериодные ритмы, а именно околосуточные (циркадные) и окологодовые (циркануальные) изучаются в настоящее время достаточно интенсивно, то короткопериодные осцилляции, к которым относят околочасовую ритмику, исследованы явно недостаточно. Между тем, именно понимание механизмов околочасовых колебательных процессов, их становление в процессе онтогенеза, модификация при различных функциональных состояниях, периодических и апериодических экзогенных воздействиях позволит понять процессы, происходящие на субклеточном, клеточном и тканевом уровнях организации живого, а именно: закономерности' синтеза и распада внутриклеточных и экспортных белков, перенос ионов через клеточную мембрану, динамику электрической активно- сти клеток, механизмы межклеточных взаимодействий и процессы синхронизации клеток в клеточных популяциях и тканях.
Характерной особенностью околочасовых осцилляции является вариабельность их периодов. Выбор частот колебаний при различных функциональных состояниях организма способствует наиболее оптимальному режиму работы клетки и, следовательно, является одним из механизмов клеточных и органных адаптации.
Изучение процессов синхронизации околочасовых колебаний позволит по-новому взглянуть на проблему десинхроноза, интенсивно обсуждаемую в литературе о циркадных ритмах. Если для среднепе-риодных и длиннопериодных ритмов десинхроноз это рассогласование внутренних ритмов организма с факторами внешней среды выполняющих роль датчиков времени, то для околочасовых ритмов выявление неколебательной, линейной кинетики чаще всего обусловлено недостатком синхронизирующих факторов в межклеточной среде (Brodsky V.Y. et al., 2004). Это может свидетельствовать как о наличии патологического процесса, так и-о крайней степени функционального напряжения организма.
Как показано в целом ряде исследований, в основе хронобио-логической системы организма млекопитающих лежит деятельность «биологических часов», к которым большинство исследователей относит супрахиазматическое ядро гипоталамуса и эпифиз (Klein D.C., Moore R.Y.,1979; Hasting M.H., 1997; Арушанян Э.Б.,1996, 2001,Арушанян Э.Б. и др., 1998, ,2003). Именно к этим структурам, посредством ретиногипоталамического тракта и геникулогипо-таламического пути, передаётся поток световой информации от ганглионарных клеток сетчатой оболочки глаза. Непременный участник в проведении фотопериодического воздействия - эпифиз. Роль эпифиза как облигатного эндокринного посредника в реализа- ции деятельности супрахиазматического ядра состоит в коррекции, трансформации и синхронизации вегетативных функций организма в ответ на изменения условий внешней среды (Мс Arthur A.J., Gillette M.U., 1991; Комаров Ф.И. и д.р., 2000). В настоящее время не вызывает сомнений, что у млекопитающих интегрированная мор-фофункциональная система «сетчатая оболочка глаза - супрахизма-тическое ядро гипоталамуса - эпифиз» является ведущей в формировании биоритмологической структуры организма и, в особенности, регуляции сезонных ритмов млекопитающих. Однако в литературе в основном рассматривались лишь отдельные аспекты структурной и функциональной организации этой системы (Антонов др.,1997, Комаров Ф.И. и др., 2000, Хужахметова Л.К., Сентюрова Л.Г., 2004). Вопросы онтогенетического системогенеза, возникновения и формирования взаимосвязей этих органов, их функционирование на различных этапах онтогенеза и при различных физиологических состояниях организма изучены явно недостаточно. В таких исследованиях практически не изучались околочасовые клеточные ритмы, хотя эти колебательные процессы могут использоваться для временного контроля тканевых и органных функций.
Такие состояния жизнедеятельности, как холодовое оцепенение у земноводных зимняя и спячка млекопитающих, являются различными формами физиологического покоя - конзекутивного, лежащего в основе вынужденных сезонных ритмов, возникающего вследствие прямого воздействия климатических факторов и не требующего от организма специальной подготовки и проспективного, представляющего специальную, генетически детерминированную сезонную адаптацию, регулирующуюся нейрогуморальными механизмами (Чернышов В.Б.,1980). Эти состояния возникли в процессе филогенеза, как формы приспособления организмов к регулярно наступающим небла- гоприятным условиям внешней среды (Голдовский A.M., 1981). Пристальный интерес исследователей к этим формам физиологического покоя связан с тем, что они, не только предназначены для «консервации энергии», но и моделируют такие состояния человека как некоторые формы естественного и медикаментозного сна, наркоз, искусственную гипотермию и длительную гиподинамию (Колаева С.Г. и др.,1986; Khomutetskaia О.Е. et al.,1989).
Из тканей зимнеспящих выделены биологически активные вещества белковой природы, резко замедляющие скорость метаболических процессов у теплокровных, не способных к гипобиозу в естественных условиях (Игнатьев Д.А. и др.,1992; Сухова Г.С. и др., 1992). Изучение структуры и механизма действия этих веществ является весьма перспективным для теоретической и практической медицины.
Исследование процессов белкового метаболизма нейронов ЦНС во время зимней спячки и холодового оцепенения представляется актуальным для разработки вопросов хранения и передачи информации, криобиологии и криотерапии. Между тем, околочасовые ритмы белкового метаболизма, способные служить надежным маркером мор-фофункциональной активности ткани и органа и выполняющих важную роль в процессах адаптации при этих состояниях не изучались.
Совершенно не рассмотрен характер изменений околочасовых ритмов белкового метаболизма при токсическом воздействии продуктов Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ). Являясь мощным антропогенными токсическим и стрессорным фактором и оказывая прямое и косвенное негативное воздействие на организм человека серосодержащие соединения, не только вызывают выраженные морфофизиологические нарушения, но и изменяют структуру биологических ритмов (Асфандияров Р.И. и др.,1995; Полунин
И.Н. и др., 1999; Тризно Н.Н. и др., 2005; Рожкова И.С, 2006, Берлякова Е.М. и др., 2006).
Также не проводилось изучение околочасовых колебаний белкового метаболизма при искусственной гипотермии применяемой в трансплантологии, при операциях на сердце, головном мозге и ряде патологических состояний.
Цель исследования.
Целью исследования является выявление закономерностей процессов морфогенеза и становления ритмической организации белкового метаболизма в нейронах сетчатой оболочки глаза у млекопитающих с дневным типом зрения в пре- и постнатальном онтогенезе, а также сравнительный анализ околочасовой ритмики белкового метаболизма в клетках ритмообразующих структур «эпифиз - сетчатая оболочка» и печени при различных формах естественного гипо-биоза, искусственной гипотермии и токсическом воздействии.
Задачи исследования.
Изучить особенности пренатального и постнатального онтогенеза и строение дефинитивной сетчатой оболочки глаза малого суслика - млекопитающего с дневным типом зрения,, а так же динамику околочасовой ритмики белкового метаболизма, в нейронах этого органа у животных 1, 7, 14, 19, 30 дней жизни и половозрелых .
Провести сравнительный анализ околочасовой ритмики белкового метаболизма в нейронах сетчатой оболочки глаза и пинеа-лоцитах у взрослых активных и гибернирующих сусликов.
Сравнить характер изменений околочасовых клеточных ритмов в нейронах сетчатки и пинеалоцитах.у активных, гибернирующих и подвергшихся токсическому воздействию сусликов.
4. Изучить околочасовые осцилляции'интенсивности белкового метаболизма в нейронах сетчатой оболочки глаза у активных и на ходящихся в состоянии холодового оцепенения амфибий.
5. Сравнить степень и характер модификации околочасовых колебаний содержания общего белка и альбумина в клетках печени крыс, подвергшихся токсическому воздействию продуктов АГКМ, ис кусственной гипотермии и после состояния искусственной гипотер мии.
Научная новизна исследования.
Впервые с помощью общегистологических, нейрогистологиче-ских, цитохимических методов и электронной микроскопии изучен морфогенез и строение дефинитивной сетчатки глаза малого суслика обладающего дневным типом зрения. Показаны общие закономерности и отличия в процессах пре- и постнатального онтогенеза и строении дефинитивной сетчатки незрело рождающихся млекопитающих связанные с типом зрения.
Впервые у этих животных проведено комплексное изучение структурной и временной организации интегрированной морфофунк-циональной системы «сетчатая оболочка глаза - эпифиз», обеспечивающей гомеостатические реакции и адаптацию организма к факторам внешней среды, в процессе индивидуального развития, при различных формах гипобиоза и воздействии такого мощного токсического и стрессорного антропогенного фактора как серосодержащий газ Астраханского газоконденсатного месторождения.
Впервые в подобных исследованиях применён хронобиологиче-ский подход и рассмотрена иерархия биологических ритмов с различными периодами, а околочасовые клеточные ритмы белкового метаболизма служили объективным маркером морфологической зрелости и функционального состояния ткани.
Получены первые данные об околочасовой ритмике белкового обмена в нейронах сетчатой оболочки глаза позвоночных стоящих на различных ступенях эволюционного развития и находящихся в состоянии активной жизнедеятельности, зимней спячке, холодовом оцепенении и при токсическом воздействии.
Также впервые исследованы околочасовые клеточные ритмы белкового метаболизма в пинеалоцитах активных, гибернирующих и подвергшихся токсическому воздействию млекопитающих с дневным типом зрения.
Впервые изучена модификация околочасовой ритмики содержания общего белка и альбумина в осуществляющих барьерную функцию клетках печени крыс, подвергшихся токсическому воздействию природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения.
Также впервые изучены изменения в кинетике этих печеночных белков у млекопитающих в состоянии искусственной гипотермии и после холодового воздействия.
Впервые показано, что околочасовые ритмы белкового метаболизма объективно характеризуют не только степень морфологической зрелости, но и функциональное состояние ткани и органа при различных формах естественного гипобиоза, искусственной гипотермии и токсическом воздействии. Модификация околочасовых осцилляции при различных физиологических состояниях организма и токсическом воздействии имеет адаптивный характер и связана с выбором оптимальных частот колебаний. Научно-практическая значимость.
В диссертационной работе выявлены общие закономерности морфогенеза сетчатой оболочки глаза незрелорождающихся млекопитающих. Показаны особенности строения дефинитивной сетчатки глаза млекопитающих с дневным типом зрения.
Данные, полученные при изучении околочасовых ритмов белкового метаболизма в нейронах развивающейся сетчатой оболочки глаза, позволят применять хронобиологический подход в онтогенетических исследованиях и использовать эти колебательные процессы в качестве объективного критерия морфологической зрелости ткани.
Сведения, полученные при сравнительном изучении околочасовых осцилляции белкового метаболизма при различных формах естественного гипобиоза и искусственной гипотермии, позволяют использовать кинетический подход в исследованиях в области криобиологии и криомедицины для объективной оценки уровня метаболических процессов.
Данные о влиянии серосодержащего газа на морфологию и хро-нобиологическую структуру белкового метаболизма клеток печени, эпифиза, сетчатой оболочки глаза позволяют объективно оценивать степень и характер морфофункциональных нарушений возникающих при токсическом и стрессорном экзогенном воздействии. Положения, выносимые на защиту.
Для сусликов, обладающих дневным типом зрения, характерна сложная, высокодифференцированная сетчатка с абсолютным преобладанием колбочковых клеток. Наибольшее развитие получают внутренний ядерный и внутренний сетчатые слои и слой ганглио-нарных нейронов. Полиморфизм клеток внутреннего ядерного и ганглионарных слоев обеспечивает в сетчатой оболочке преобладание вертикальных связей над горизонтальными и служит механизмом, повышающим остроту зрения беличьих.
Созревание рецепторного отдела зрительного анализатора сусликов характеризуется гетерохронией и происходит изнутри к наружи и от центра к периферии. Последовательность формирова- ния ядерных и сетчатых слоев у животных с колбочковой организацией сетчатки такая же, как и у других незрелорождающихся млекопитающих, вне зависимости от типа зрения.
Наиболее выраженные изменения в размерах ганглионарных нейронов сетчатой оболочки глаза и массе содержащегося в них белка происходят с 1-го по 19-тый день жизни и максимальны перед прозреванием животного.
Околочасовые ритмы в популяции ганглионарных нейронов впервые регистрируются только после возникновения морфологической основы для синхронной деятельности этих клеток.
В процессе индивидуального развития происходит модификация околочасовых колебаний связанная с возрастающей в процессе онтогенеза синхронизацией процессов метаболизма как в одной клетке (самосинхронизация), так и в клеточной популяции.
Околочасовые ритмы белкового метаболизма в нейронах сетчатой оболочки глаза и эпифиза, входящих в единую систему регуляции гомеостаза, синхронизируются, что обеспечивает оптимальные условия для функционирования этих органов при осуществлении процессов адаптации.
При различных формах естественного гипобиоза, искусственной гипотермии и токсическом воздействии не только угнетаются процессы белкового метаболизма, но и . модифицируются околочасовые клеточные ритмы.
Отбор частот околочасовых осцилляции белкового метаболизма, происходящий при различных физиологических состояниях организма и экзогенных воздействиях, обеспечивает наиболее оптимальный режим функционирования ткани и органа, являясь эффективным способом клеточных и органных адаптации.
9. Околочасовые колебательные процессы могут служить маркером морфологической зрелости и функционального состояния ткани и органа в процессе онтогенеза, при различных физиологических состояниях организма и экзогенных воздействиях.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях, съездах, конгрессах: IV симпозиуме СССР-ГДР «Хронобиология и хрономедицина» (Астрахань, 1989), конференции «Нарушение механизмов регуляции и их коррекция» (Москва, 1989), европейском конгрессе «Chronobiology and chronomedicine» (Краков, 1989), XI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Смоленск, 1992), международной конференции, посвященной 100 летию со дня рождения профессора Н.В. Поповой-Латкиной - проблемы экологии в медицине (Астрахань, 1996), VIII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 1998), Международной конференции «Актуальные проблемы биологии и медицины» (Астрахань, 2000), Международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2000), Втором Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), X международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2001), IV Международной конференции по функциональной нейромор-фологии (Санкт-Петербург, 2002), X Юбилейной Международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002), XI международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2003), VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), конференции «Актуальные проблемы современной биологии, медицины, химии и экологии» (Томск, 2005), научно - практической конференции с международ- ным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань - Волгоград - Москва, 2006).
Внедрение результатов исследования в практику. Данные о процессах морфогенеза зрительного анализатора у млекопитающих с дневным типом зрения, становлении и модификации околочасовых клеточных ритмов при различных формах естественного гипобиоза, искусственной гипотермии и токсическом воздействии используются при проведении онтогенетических, нейробиологических, физиологических, гигиенических и хронобиологических исследований, а также чтении лекций и проведении практических и лабораторных занятий на кафедрах соответствующего профиля Астраханской государственной медицинской академии, Астраханского технического университета, Астраханского государственного университета, Волгоградского государственного медицинского университета.
Реализация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 43 научные работы (монография - 1, в центральной печати - 23, иностранных журналах -2) . По материалам исследования издано учебное пособие, применяемое в учебном процессе профильных кафедр Астраханской государственной медицинской академии, Астраханского университета, Астраханского технического университета.
Структура и обьём диссертации. Диссертация изложена на 309 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы I - обзора литературы, представленной семью частями, в которой изложены современные данные по изучаемой проблеме. Глава II содержит подробную информацию о материалах и методах исследования. В главе III, состоящей из б разделов и 2 подразделов, представлены результаты собственных исследований. В главе IV проводится обсуждение полученных результатов, которые сформулированы в виде 9 выводов. Диссертация иллюстрирована б таблицами и 105 рисунками и микрофотографиями. Библиографический указатель содержит 533 источника: 341 отечественных и 192 зарубежных авторов.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории цитологии Института Биологии Развития РАН, и сотрудникам лаборатории количественной микроскопии РГМУ за оказанную помощь по освоению методик настоящего исследования.
Околочасовые биологические ритмы в сетчатке глаза млекопитающих на различных этапах онтогенеза
Изучению процессов становления и модификации оклочасовых ритмов белкового метаболизма в различных нейронах сетчатки в постнатальном онтогенезе и при изменении функционального состояния организма незрелорождающихся животных с дневным и сумеречным типом зрения посвящено ряд работ - В.Я. Бродский, М.Е. Неверова (1968), Э.В. Чернышова, (1969), A.M. Арефьева, Е.И. Санкова (1972), В.Я. Бродский и др. (1975), И.М. Кунина (1976, 1977) A.M. Арефьева, И.М. Кунина(1979), А.Н. Бекчанов (1980) .
В этих исследованиях показано, что сухой вес и масса белков в ганглионарных нейронах сетчатки, а также интенсивность включения меченых предшественников в фотосенсорные, биполярные и ганглионарные клетки взрослых животных, подвергающихся световой стимуляции, ритмически меняется со средним периодом от 40 минут до 1.5 часов. Математическая обработка позволяет выделить 60, 80 и 120 минутные периодические составляющие, имеющие наибольшее значение в процессах изменения белкового синтеза (Арефьева A.M., Кунина И.М., 1979).
У животных с сумеречным типом зрения интенсивность включения меченого предшественника в различные нейроны сетчатой оболочки глаза характеризуется следующей убывающей последовательностью: фотосенсорные, ганглионарные, биполярные клетки. При стимуляции мелькающим светом с частотой 2 гц и мощностью 100 люкс скорость включения радиоактивного метаболита в фотосенсорных клетках и биполярных нейронах падает, а в ганглионарных повышается (Кунина И.М., 1977). А.Н. Бекчанов (1980) показал, что вне зависимости от типа зрения для выявления околочасового ритма содержания белка в целой сетчатке или отдельной клеточной популяции этого органа необходима морфологическая основа для синхронной деятельности клеток. Так изучая околочасовую ритмику содержания белка в ганглионарных нейронах сетчатки глаза в процессе индивидуального развития голубей, кроликов и кошек, подвергшихся световой стимуляции автор не выявил околочасовых осцилляции у 4-х дневных животных, хотя анатомическая основа для проведения зрительного раздражения от сетчатой оболочки глаза и вплоть до коры мозга на этом этапе онтогенеза уже сформирована. Колебания белковой массы ганглионарных клеток впервые зарегистрированы у 7-ми дневных животных имеющих сформированные горизонтальные связи амакриновых клеток с ганглионарными нейронами. О том, что и для выявления околочасового ритма в целом органе необходима его достаточная морфологическая зрелость, пишет В.И. Фатеева с соавторами (1982), изучавшая динамику включения 3Н-лейцина в новосинтезирующиеся белки железистых клеток.
С возрастом метаболический ответ нейрона на раздражение изменяется однотипно - происходит сглаживание кинетической кривой, снижение амплитуды колебаний и уменьшение частоты ритма. (Арефьева A.M., Санкова Е.И., 1972; Бродский В.Я.и др., 1975; Кунина И.М., 1977; Бродский В.Я., 2000). Следует отметить, что сухой вес ядер и цитоплазмы ганглионарных нейронов у животных с сумеречным типом зрения колеблется в противофазе. Однако, несмотря на принципиальное сходство ответных реакций ганглионарных клеток у животных различной организацией сетчатки глаза (колбочковая, палочковая и смешенная), отмечены и значительные отличия в амплитуде колебаний сухого веса цитоплазмы и ядра, непосредственно связанные с типом зрения. Так, у голубей и цыплят, обладающих дневным типом зрения, отмечена более высокая амплитуда колебаний сухого веса ядер клеток по сравнению с пе-рикарионом. У кроликов и мышей, характеризующихся ночным зрением, наоборот: амплитуда колебаний выше в перикарионе по сравнению с ядром. У кошек, сетчатка которых относится к смешенному типу, но с преобладанием палочковых нейросенсорных клеток, обнаружена значительная амплитуда колебаний сухого веса, как пе-рикариона, так и ядра, хотя в перикарионе она несколько выше (Бродский В.Я., Неверова М.Е., 1968; Санкова Е.И., 1972; Санкова Е.И., Арефьева A.M., 1972 а,б; Кунина И.М., 1976; 1977; Бек-чанов А.Н., 1976, 1980).
Характер околочасовых колебаний белкового метаболизма в ганглионарных нейронах меняется при изменении функционального состояния зрительного анализатора. По данным Е.И. Санковой и A.M. Арефьева (1972), Е.И.Санковои (1972) интенсивная световая нагрузка существенно снижает уровень ответной реакции ганглио-нарных нейронов на стимуляцию мелькающим светом.
Таким образом, имеющиеся к настоящему времени литературные данные свидетельствуют о том, что околочасовые клеточные ритмы в различных нейронах сетчатой оболочки глаза в процессе онтогенеза изучены явно недостаточно. Имеющиеся данные получены при изучении динамики содержания белка в клеточных элементах сетчатой оболочки у незрелорождающихся млекопитающих с сумеречной активностью. Изучение оклочасовых колебаний белкового метаболизма в нейронах сетчатки глаза у животных с дневным типом зрения в процессе онтогенеза практически не проводилось. Если в достаточно большом количестве исследований оказано, что околочасовые ритмы могут служить вполне надежным маркером морфологической зрелости ткани, то остается не вполне ясным, могут ли такие колебательные процессы являться и. показателем ее функциональной активности. Имеются лишь единичные работы, посвященные этому вопросу, причем изменения в физиологической активности органа вызывались искусственно. В этом плане представляется актуальным провести сравнительное изучение оклочасовых ритмов белкового метаболизма в различных нейронах сетчатой оболочки глаза сусликов, имеющих дневной тип зрения с момента рождения и до прогревания, а также у взрослых животных в активном периоде и в состоянии зимней спячки, являющейся одной из форм естественного гипобиоза. Изучение околочасовых колебаний белкового синтеза в нейронах зрительного анализатора сусликов представляет на наш взгляд особый интерес, так как именно белковый обмен угнетается в период спячки в наибольшей степени.
Зимняя спячка млекопитающих как состояние естественного гипобиоза, адаптированное к неблагоприятным условиям внешней среды
Ритмичность физиологических процессов является одним из фундаментальных свойств живой материи и лежит в основе её организации (Питтендрай К., 1964; Уодингтон К.Х., 1970; Романов Ю.А., 1985, 1991, 1994, 1998; Гласе Л, Меки М.,1991; Бродский В.Я., 2000; Арушанян Э.Б. и др., 2003). Регулярно возникающие изменения условий внешней среды привели к возникновению в организме животных и человека циклических колебаний физиологических процессов, имеющих адаптивный характер (Саркисов Д.Си др., 1975; Моисеева Н.И., Сысуева В.М., 1981; Сапов И.А., Новиков B.C., 1984; Катинас Г.С, 1985; Арутюнян А.В. и др., 2003; Ару-шанян Э.Б. и др., 2003). Такие колебания зарегистрированы как на уровне одной клетки (Гудвин В., 1966; Hess В., 1976; Селько-ва Е.Е, 1985), так и в целостном организме (Слоним А.Д., 1976; Шилов И.А., 1985; Ягодинский В.Н., 1985; Дедов И.И., Дедов В.И., 1992) .
Биологические ритмы, имеющие период колебаний, близкий к одному году, классифицируются F.Halberg A.Reinberg (1967) как циркануальные, а в отечественной литературе как сезонные. Сезонные биологические ритмы, по мнению, В.Б.Чернышов (1980) представляют собой сложившуюся в процессе филогенеза и наследственно закрепленную систему приспособления организма к годичной экологической динамике. Существование сезонной ритмичности различных физиологических процессов у млекопитающих показано в работах Pengelley Е.Т. et al (1971), Л.Н. Ердакова (1984), И.А. Сапова и B.C. Новикова (1984), Н.Р. Деряпы с соавторами (1985), Л.Г.Хетагуровой с соавторами (2003). Данные по сезонным биоритмам в физиологии и патологии различных функций организма человека приведены в исследованиях А.П. Голикова и П.П. Голикова (1973), Halberg F. et al.(1983), Н.Н. Лебедева (1987), СВ. Булатова (2001), Арушанян Э.Б. с соавторами (2003), Д.В. Фирсова с соавторами (2003), Н.А. Агаджаняна, М.Л. Хачатурьяна (2003), И.Г. Кайсиной с соавторами (2003).
Т.М. Тюрина, с соавторами (2003) . исследовав большое число пациентов с заболеваниями сердечнососудистой, дыхательной, нервной системы и пищеварительной систем нашла, что частота возникновения патологии в соответствующей системе коррелирует с сезоном зачатия и родов.
В основе сезонной ритмичности лежит чередование активной жизнедеятельности и физиологического покоя, адаптированное к различным сезонам года. Такое чередование имеют генетически де-терменированно, регулируются факторами внешней среды и подчиняются критериям Халберга (Heller Н., Poulson Т., 1970; Гвин-нер Э., 1984; Жегунов Г.Ф. и др., 1991).
Проявлением сезонной ритмичности служит зимняя спячка млекопитающих, являющаяся, согласно классификации Р.С. Ушатинской (1973), одной из форм проспективного физиологического покоя и позволяющая организму пережить неблагоприятные условия внешней среды (Слоним А.Л., 1971 а,б; Голдовский A.M.,. 1981; Калабухов Н.И., 1985; Пастухов Ю.Ф., 1991). Это состояние жизнедеятельности имеет ряд общих черт с некоторыми формами парадоксального сна позвоночных (Карманова И.Г.,1987; Пастухов Ю.Ф.и др.,1995). Зимняя спячка представляет биохимическую и морфофизиологическую адаптацию позволяющую уменьшить потери энергии путём выраженного снижения уровня обмена веществ (Пастухов Ю.Ф. 1991; Пастухов Ю.Ф. и др., 1995; Mel nhycuk D.O et al.,2000; Пастухов Ю.Ф.и др., 2003). Так у суслика обмен веществ во время спячки составляет 1/52, а потери воды через кожу и лёгкие 1/77 нормальной величины (Deavers, Musaccia, 1980; Хочачка П., Сомеро Дж.,1988). Важнейшим экологическим сигналом для перехода от активной жизнедеятельности к состоянию физиологического покоя, относится укорочение длины светового дня, понижение температуры окружающей среды, (Калабухов Н.И., 1985, 1986; Березин А.А., Маякова С.А,, 1981; Гвиннер Э., 1984). Регулярно наступающее, связанное со сменой сезона изменение продолжительности светового дня является наиболее точным экзогенным сигналом для перехода организма от активной жизнедеятельности к состоянию гипобиоза (Тыщенко В.П., 1980; Хоффман К., 1984). По данным В.В. Скрипчанского (1975) способность к фотопериодизму присуща почти всему живому миру. В.П. Тыщенко (1966, 1972, 1976) показал, что фотопериодизм включает в себя фотопериодическую настройку и фотопериодическую индукцию. В механизмах регуляции сезонных ритмов наибольшее значение имеет фотопериодическая индукция, когда продолжительность светового дня определяет интенсивность или смену биологических состояний, что является особенно важным для зимнеспящих. В большом числе исследований найдено, что укорочение длины светового дня является сигналом для залегания сусликов в зимнюю спячку (Калабухов Н.И., , 1985; Pengelley Е., Fisher К., 1961, 1963; Neuman R., Cade Т., 1964; Dresner D., 1967; Scott G., Fisher K., 1978; Тыщенко В.П., 1980) .
В работах Н.И. Калабухова (1985), Е. Pengelley, К. Fisher (1961; 1963), Д. Твенте, Ж. Твенте (1970), М.Г. Колпакова с соавторами (1977), Pastukhov Y.F.(1997), К.Г. Беляева (2005) убедительно показано, что убывающий режим температуры выступает как несомненный ускоритель процессов вхождения животных в состояние естественного гипобиоза.
Результаты радиоавтографического и биохимического методов исследования
В сетчатке сусликов 19-ти дней жизни в фотосенсорном слое обнаруживаются три вида клеточных элементов, являющихся вполне дифференцированными и не отличающиеся по своей морфологии от подобных клеток в сетчатке взрослых животных: преимущественно колбочковые, двойные колбочковые и в значительно меньшем числе палочковые клетки, состоящие из внутренних и наружных сегментов. Наружный сегмент колбочковой клетки имеет коническую форму, он более короткий и широкий. Внутренний сегмент клеток этого типа имеет большую толщину и непосредственно прилегает к пе-рикариону фотосенсорной клетки. Ядро колбочковой клетки отличается сетчатым расположением хроматофильнои субстанции. От тела колбочковой клетки отходит центральный отросток, который заканчивается образованием пирамидальной формы в наружном сетчатом слое. Двойные колбочковые клетки отличаются от обычных тем, что у них происходит срастание внутренних сегментов.
Наружный сегмент палочковых клеток имеет форму тонкого цилиндра, вытянутого в сторону пигментного слоя. Внутренний сегмент шире наружного, более интенсивно импрегнируется и переходит в тело клетки со значительным сужением. Тело палочковой клетки лежит в наружном ядерном слое и, в основном, занято ядром. Хроматин в ядрах палочковых клеток локализован в ядре в виде крупных глыбок. Центральный отросток палочковой нейросен-сорной клетки отходит от внутреннего сегмента в наружный сетчатый слой, где заканчивается булавовидным образованием (Рис 24).
Наружный ядерный слой имеет значительно меньшую ширину по сравнению с внутренним ядерным слоем и образован 4-6 рядами вытянутых или округлых клеток. Наружный сетчатый слой характеризуется наличием большого числа отростков нейросенсорных клеток, биполярных и горизонтальных нейронов, а также множеством синап-тических контактов, формируемых этими клетками. По своей морфологии этот слой не отличается от такового в сетчатке взрослых животных.
Внутренний ядерный слой, являющийся наиболее широким в сетчатке глаза млекопитающих с дневным типом зрения и образован 7-8 рядами клеток. На границе с наружным сетчатым слоем располагаются 2 типа горизонтальных клеток отростки, которых направлены вправо и влево. Можно выделить крупные горизонтальные клетки, от тел которых отходят многочисленные ветвления дендри-тов. Аксоны этих клеток значительно уже и заканчиваются разветвлениями с множеством окончаний, а также более мелкие горизонтальные клетки, от которых отходят мало ветвящиеся дендриты. В цитоплазме горизонтальных клеток происходит накопление хрома-тофильной субстанции. Несколько глубже горизонтальных клеток располагаются биполярные нейроны, имеющие вытянутое по вертикали тело. В цитоплазме этих клеток содержится хроматофильная субстанция, имеющая вид гранул. Все биполярные клетки, найденные нами в сетчатой оболочке глаза суслика, разделены нами на 2 типа: моносинаптические и полисинаптические. Среди моносинапти-ческих биполярных нейронов можно выделить карликовые биполярные клетки, характеризующиеся меньшим размером тела и вступающие в синаптические контакты только с центральным отростком колбочко-вой нейросенсорной клетки. Среди полисинаптических биполярных клеток, в свою очередь, нами выделено шесть подтипов в зависимости от расположения перикариона: 2 .подтипа характеризуются наружным расположением и 4 - внутренним.
Наружно расположенные биполярные клетки имеют от 3 до 5 отходящих от их тел дендритов, направляющихся в наружный сетчатый слой и располагающихся горизонтальной плоскости. Эти отростки заканчиваются на самых верхних этажах наружного сетчатого слоя пуговчатыми окончаниями. Аксоны таких клеток имеют окончания, расположенные в более глубокой части внутреннего сетчатого слоя.
Биполярные нейроны, расположенные в более глубокой части внутреннего ядерного слоя, характеризуются узким ветвлением дендритов, оканчивающихся в нижних этажах внутреннего сетчатого слоя. Нейриты этих клеток заканчиваются в наружной части внутреннего сетчатого слоя.
На границе с внутренним сетчатым слоем выявляются грушевидные амакринные клетки, являющиеся самыми крупными нейронами внутреннего ядерного слоя. В цитоплазме перикариона этих клеток выявляется хроматофильная субстанция, имеющая вид глыбок. Амакринные нейроны можно разделить на крупные, средние и мелкие. От тел амакринных клеток отходит один отросток, который разветвляется во внутреннем сетчатом слое. Среди амакринных клеток в зависимости от ширины ветвления и этажности окончания отростков нами выделено не менее пяти различных подтипов.
Ширина внутреннего сетчатого слоя несколько увеличилась по сравнению с таковым у животных 14-ти дней жизни. В этом слое обнаруживаются контакты между аксонами биполярных клеток с отростками амакринных и ганглионарных, а также амакринных нейро-цитов с амакринными и ганглионарных с ганглионарными.
Ганглионарный слой представлен 2-3 рядами клеток, расположенных на некотором расстоянии друг от друга. По размерам эти нейроны классифицируются как крупные, средние, мелкие. Ядра ганглионарных клеток могут располагаться как в центре, так и эксцентрично. В цитоплазме перикариона клеток ганглионарного слоя отмечается дальнейшее накопление хроматофильной субстанции, которая имеет на периферии вид глыбок, а в центральной части - небольших зерен. Ганглионарные нейроны разделены нами не менее чем на 10 подтипов, связанных с различиями в уровне расположения, ширине и характере ветвления их дендритных окончаний. Особый интерес представляет наличие мелких ганглионарных клеток, вступающих в синаптические связи с отростками карликовых биполярных клеток (Рис. 25, 26, 27, 28, 29).
Околочасовые клеточные ритмы в сетчатой оболочке глаза активных и находящихся в состоянии холодового оцепенения амфибий
В нем наблюдаются два типа горизонтальных клеток: крупные с многочисленным ветвлением дендритов и более мелкие, имеющие небольшое число дендритов, а также биполярные клетки моно-синаптического и полисинаптического типа. На границе с внутренним сетчатым слоем выявляются самые крупные клетки этого слоя -амакринные, которые разделены нами на три подтипа в зависимости от размеров и не менее пяти подтипов в зависимости от уровня стратификации и ширине ветвления их отростков во внутреннем сетчатом слое.
Ганглионарный слой состоит из 2-3 рядов клеток, лежащих на некотором расстоянии друг от друга. В зависимости от различий в уровне расположения, ширине и характере ветвления их дендритных окончаний, нами выделено не менее 10 подтипов ганглионарных клеток. Особый интерес вызывает наличие мелких ганглионарных клеток, вступающих в связь с отростками карликовых биполярных нейронов.
Сетчатка 30 дневных и взрослых сусликов по своему строению принципиально не отличаются от сетчатки 19 дневных животных.
В период зимней спячки суслика в. ганглионарных нейронах возникают выраженные ультраструктурные изменения, как в ядре, так и цитоплазме, приводящие к снижению функциональной активности клетки - увеличивается количество гетерохроматина, уменьшается число рибосом располагающихся на гранулярной эндоплазмати-ческой сети, возрастает количество моносом и уменьшается число полисом. Гранулярная эндоплазматическая сеть фрагментируется, в то время как у активных животных это целостная структура. Митохондрий полиморфны, изменяется их ультраструктура.
Размеры ганглионарных нейронов, площади их ядер и перика-рионов, а также динамика белкового метаболизма в нейронах сетчатой оболочки глаза изучалась у 1, 7, 14, 19, 30 дневных, половозрелых активных и гибернирующих животных методом сканирующей цитофотометрии. Количество клеточных белков вычислялось в условных сравнимых единицах. Результаты исследования приведены в таблицах (1, 2, 3, 4, 5, б) и показали следующее:
у однодневных усликов среднее содержание белка в ганглионарных клетках составляет 53,9 ±1,8 условных единиц, причем в ядре содержится 44,0+7,1 сравнимых единиц белка и в перикарионе 15,9±2,2 сравнимых единиц. Площадь ганглионарного нейрона у животных этого возраста в среднем равна 236,8±б,0 мкм2, ядра -202,9+12,1 мкм2 и перикариона - 38,9±б,1 мкм2. Достоверных колебаний содержания белков в ганглионарном нейроне, ядре и цитоплазме перикариона, а также размеров самого нейрона, ядра и цитоплазмы перикариона у животных одного дня жизни, не выявлено (Рис. 36, 37, 38, 39, 40, 41).
У 7 дневных сусликов отмечено возрастание количества белка, содержащегося в ганглионарных клетках, которое в среднем равно теперь 98,5±2,3 сравнимых единиц. Количество ядерных белков у животных этого возраста составляет в среднем 73,1±6,8 сравнимых единиц, а белков содержащихся в перикарионе 21,4±1,0 сравнимых единиц. Увеличивается также и площадь ганг-лионарного нейрона до 289,2±4,2 мкм2. Размеры ядра и перикарио-на у сусликов этого возраста составляют соответственно 227,5±8,6 мкм2 и 55,1±4,6 мкм2. Так же, как и у однодневных животных, у сусликов 7 дней жизни динамики содержания белка в ганглионарном нейроне и околочасовых колебаний размером самих нейронов в процессе световой стимуляции не выявлено. Тем не менее, уже у 7 дневных животных отмечена динамика массы белков содержащихся в ядре и перикарионе, а также площади ядра и пери-кариона. Так масса ядерных белков составляет у контрольных животных 83,4±1,9 сравнимых единиц. До 40 минуты содержания белка в ядре статистически достоверно не изменяется и на 50 минуте наблюдения возрастает до 104,4±2,0 условных единиц. На 60 минуте количество белка содержащегося в ядре резко снижается и равно всего 58,1±1,8 сравнимых единиц. Далее на протяжении 60 минут наблюдения количество белка в ядре ганглионарного нейрона остается практически постоянным.
Площадь ядра у контрольных темно адаптированных сусликов 7 дней жизни равна 256,3+2,7 мкм2. На 10 минуте размеры ядра составляют только 218,1+4,7 мкм2, а на 20 минуте уже 269,4±2,7 мкм2, после чего к 30 минуте площадь ядра уменьшается до 244,1±2,1 мкм2. До 50 минуты светового воздействия размер ядра достоверно не изменяется, а на 60 минуте снижается до 208,8±3,7 мкм2. Повторно площадь ядра статистически достоверно возрастает 100 минуте световой стимуляции до 230,8+.4,5 мкм2. (Рис. 42, 43, 44, 45, 46, 47).
Количество белка содержащегося в цитоплазме перикариона у контрольных темно адаптированных животных 7 дней жизни равно 13,5±7,3 сравнимых единиц. На 20 минуте наблюдения содержания белка возрастает до 29,7+3,9 сравнимых единиц. К 30 минуте количество белка в перикарионе снижается до 17,2±4,2 сравнимых единиц и повторно возрастает на 60 минуте до 32,9±б,8 сравнимых единиц. На 80 минуте наблюдения количество белка содержащееся в цитоплазме перикариона равно всего 18,2+5,0 сравнимых единиц и далее до 120 минуты достоверно не изменяется.
Площадь перикариона у контрольных темно адаптированных сусликов равна 27,5+3,3 мкм2. На 10 минуте наблюдения площадь перикариона возрастает до 60,2+7,9 мкм2 и на 20 минуте снижается до 40,7+6,5 мкм2. На протяжении.ещё 100 минут светового воздействия площадь цитоплазмы перикариона статистически достоверно возрастает ещё дважды - 60 и 120 минутах до 80,1±5,1 и 60,3±4,9 мкм2 соответственно.
