Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Общая характеристика цианобактерий родов Spirulina и Nostoc 8
1.1.1. Таксономическое положение и экология 8
1.1.2. Культивирование 10
1.1.3. Биохимический состав и ценность биомассы 11
1.2. Влияние КВЧ-излучения на фотосинтезирующис организмы 14
1.3. Физиолого-биохимическая роль отдельных микроэлементов 18
1.3.1. Классификация элементов минерального питания 18
1.3.2. Биологическая роль В, Mo, Sc и Zn 19
1.3.2.1. Бор 20
1.3.2.2. Селен 25
1.3.2.3. Молибден 29
1.3.2.4. Цинк 32
1.3.3. Накопление элементов микроорганизмами 36
1.3.4. Взаимодействие элементов ; 40
1.3.5. Методы определения элементов в биологических образцах 43
2. Объекты и методы исследования 46
2.1. Культивирование 46
2.2. Микроскопирование 49
2.3. Определение биомассы 49
2.4. КВЧ-облучение 50
2.5. Условия введения исследуемых элементов 50
2.6. Фракционирование биомассы 50
2.7. Аналитические методы определения элементов 51
2.8. Статистическая обработка 53
3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Определение оптимальных концентраций Мо, В, Sc, Zn и времени их введения в среду культивирования 54
3.2. Действие КВЧ-облучения на аккумуляцию исследуемых элементов клетками S. platensis и N. commune 68
3.3. Изменение элементного состава под действием различных факторов 73
З.З.1.Изменение элементного состава цианобактерий S. phtensis и N. commune при КВЧ-облучении 73
З.З.1.Изменение элементного состава клеток цианобактерий при действии химического фактора 76
3.3.2.1. Бор 77
3.3.2.2. Молибден 80
3.3.2.3 Селен 82
3.3.2.4. Цинк 84
3.4. Распределение Mo, Se, Zn по клеточным фракциям 87
Заключение 90
Выводы 93
- Влияние КВЧ-излучения на фотосинтезирующис организмы
- Микроскопирование
- Статистическая обработка
- Действие КВЧ-облучения на аккумуляцию исследуемых элементов клетками S. platensis и N. commune
Введение к работе
Цианобактерии являются широко распространенными объектами научных исследований, по вопросам их физиологии существует обширная литература [Гусев, Никитина, 1979; Гусев, Минеева, 2003]. Отдельные представители цианобактерии также являются перспективными объектами фотобиотехнологии благодаря значительному содержанию белка, полиненасыщенных жирных кислот, /?-каротина, витаминов и других биологически активных веществ [Vonshak et а!., 1987; Henrikson, 1994; Borowitzka et ai, 1999]. Пластичность метаболизма цианобактерии позволяет получать биомассу, обогащенную отдельными необходимыми элементами, путем направленного изменения условий культивирования, что используется при создании биологически активных добавок (БАД) [Минюк и др., 1999; Блинкова и др., 2001; Пронина и др., 2002]. Наряду с хорошо изученной культурой Spirulina platensis в последние годы появляется значительный интерес к другому представителю цианобактерии - Nostoc commune, который интенсивно изучают и используют в пищу в ряде стран [Воронихин, 1953; Martinez, 1998; Kajiyama et ai, 1998; Qiu et ai, 2002]. Mo, Se и Zn относятся к эссепциальным (жизненно необходимым) микроэлементам, недостаточное поступление которых может приводить у человека к возникновению ряда заболеваний, что особенно важно для регионов, являющихся биогеохимическими провинциями с недостаточным содержанием этих элементов [Авцын и др., 1991; Скальный и др., 2000]. Бор относится к элементам, роль которых в организме человека пока не установлена, однако интерес к данному элементу значительно возрос в последние годы, в связи с появлением новых данных о гиполипидемических, противовоспалительных и противоопухолевых свойствах его соединений, таких, например, как аминокарбоксибораны [Hall et а!., 1994].
Изучение влияния В, Mo, Se и Zn, вводимых в питательную среду в повышенном количестве, на рост и выход биомассы цианобактерий позволяет определить концентрации, оптимальные для получения весьма ценной биомассы, обогащенной исследуемыми элементами в органической форме.
КВЧ-излучение (электромагнитное излучение миллиметрового диапазона низкой нетепловой интенсивности), широко применяемое в медицине [Бецкий, Кислов, 1990; Бецкий 1993; Девятков и др., 1994], способно стимулировать ряд физиологических процессов у цианобактерий [Тамбиев, Кирикова, 1992; Tambiev, Kirikova, 1994; 2000; Тамбиев и др., 2003], в связи с чем было интересно рассмотреть его влияние на накопление клетками отдельных элементов при их внесении в культуральную среду в оптимальных концентрациях.
Элементный состав клетки - важная физиологическая характеристика организма [Чернавина, 1970; Скальный и др., 2000]. Вопрос о роли различных элементов, характере их взаимодействия, о механизмах их влияния на различные стороны метаболизма и распределения включенных элементов по клеточным фракциям, представляет значительный интерес. В связи с этим особое внимание уделялось изучению влияния факторов физической и химической природы, к которым условно можно отнести действие КВЧ-излучения и присутствие некоторых элементов в питательной среде в повышенных концентрациях. В частности, нас интересовало влияние этих факторов на общий элементный состав клеток. Для определения элементного состава биологических объектов необходимо правильно подобрать комплекс аналитических методов, позволяющих определить как макро-, так и микроэлементный состав клеток цианобактерий, его изменения при действии различных факторов и распределение исследуемых элементов в клеточных фракциях. Выяснение этих вопросов может развить существующие представления об участии указанных элементов в метаболизме цианобактерий.
Таким образом, изучение накопления отдельных элементов клетками цианобактерий и влияние их на элементный состав, а также выяснение действия КВЧ-облучения на данные процессы представляет значительный интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте.
Влияние КВЧ-излучения на фотосинтезирующис организмы
Электромагнитные волны в миллиметровом диапазоне (КВЧ-излучение) были освоены сравнительно недавно. В 1965-66 г.г. под руководством акад. Н.Д. Девяткова и проф. М.Б. Голанта были разработаны и стали серийно выпускаться генераторы на основе широкодиапазонных ламп обратной волны. Таким образом, появилась возможность проводить широкомасштабные эксперименты как в физике, так и в различных областях медицины и биологии. В настоящее время действие КВЧ-излучения исследуется на различных биологических объектах (от бактерий до тканей и органов человека), а также используется в практической медицине при комплексном лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы [Шестопалова и др., 1989; Бецкий, Кислов, 1990; Реброва 1992; Бецкий, 1993; Тамбиев и др., 1993; Betskii, 1994; Девятков и др., 1994; Лебедева, 1997]. Первые исследования по действию КВЧ-облучения на фотосинтезирующие организмы появились сравнительно недавно, однако число работ с водорослями, высшими растениями, фотосинтетическими реакционными центрами пурпурных бактерий продолжает увеличиваться [Tambiev et. ah, 1986; Лукашев и др., 1991; Нокс и др., 1991; Тамбиев, Кирикова, 1986,1998]. В ходе изучения действия КВЧ-излучения на цианобактерию Spirulina platensis и зеленую морскую одноклеточную водоросль Platimonas viridis [Тамбиев и др., 1992] были выявлены некоторые общие закономерности и изучены различные физиологические эффекты этого влияния: ускорение роста и, как следствие этого, увеличение выхода биомассы культур [Тамбиев и др., 1990], интенсификация процессов фотосинтеза [Тамбиев и др., 1992], изменение реакционной способности экзометаболитов [Тамбиев и др., 1987], изменение транспорта ионов [Маркарова и др., 1992, 1995]. Относительно первичных механизмов действия КВЧ-излучения на клетки в литературе имеются самые противоречивые взгляды. По мнению Девяткова с сотр. [1983], механизм действия КВЧ-излучения основан на предположении об электромеханических автоколебаниях клеточных структур (например, элементов мембран) как естественном состоянии живых клеток, синхронизация этих колебаний внешним электромагнитным излучением, возможно, ведет к появлению внутренних информационных сигналов, воздействующих на регуляторные системы организма.
В другой работе рассматривался вопрос о возможности возникновения акустоэлектрической волны в липидно-белковой мембране клеток [Бецкий, 1986]. Предложен также биохимический механизм воздействия миллиметровых излучений на биологические процессы [Жуковский и др., 1993], и, по мнению авторов, первичное воздействие КВЧ-излучения заключается в его влиянии на определенные молекулы в клетках организма. Такими гипотетическими молекулами, участвующими в регуляции биологических процессов, являются молекулы циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [Жуковский и др., 1993]. Несмотря на достаточно многочисленные взгляды относительно первичных механизмов воздействия КВЧ-облучения, большинство авторов считают, что важнейшей точкой приложения его влияния являются мембраны [Nosol et ai., 1986; Бецкий, Путви не кий, 1986; Тамбиев, Кирикова, 1992, 2000]. В литературе также отмечается пролонгированный характер влияния КВЧ-излучения на цианобактерию Spirulina platemis, зеленую водоросль Platimonas viridis [Тамбиев и др., 2000], гетеротрофный микроорганизм - Е. colit дрожжеподобный гриб — Endomyces fibuliger, спиртовые и пивоваренные дрожжи [Реброва, 1992]. Пролонгированность действия КВЧ-облучения ряд авторов связывают с «памятью» воды [Девятков и др., 1981; Гапочка и др., 1994]. В работе Искина с соавт. [1987] отмечается, что время «памяти» воздействия КВЧ-излучения на микроорганизмы даже при их постоянных пересевах может достигать нескольких месяцев, причем возвращение к исходным свойствам идет постоянно. Описанные в литературе возможные механизмы КВЧ-излучения, а также вызываемые им физиологические эффекты, проявляющиеся на фотосинтезирующих организмах, подробно рассмотрены в недавно вышедшей монографии [Тамбиев и др., 2003], где авторами предлагается новый механизм действия (рис. 1), сформулированный несколько ранее в работах [Тамбиев, Кирикова, 1998, 2000; Tambiev, Kirikova, 2000; Тамбиев и др., 2002]. Классификация химических элементов осуществляется по принципу количественного содержания элемента в организме, по степени необходимости и по физиологическим функциям в организме. По принципу количественного содержания в организме различают: макроэлементы: концентрация в растительных организмах может достигать сотен мкмоль/г сухой массы. микроэлементы: концентрация обычно не превышает нескольких единиц мкмоль/г сухой массы [Битюцкий, 1999]. По степени необходимости: необходимые элементы, которые должны удовлетворять следующим требованиям: - без данного элемента жизненный цикл конкретного организма не может завершиться физиологические функции, выполняемые с участием этого элемента, не могут осуществляться при его замене другим элементом - данный элемент должен непосредственно вовлекаться в метаболизм организма. полезные —такие питательные элементы, которые могут стимулировать рост и развитие растений, но в полной мере не соответствуют требованиям, предъявляемым к необходимым элементам [Битюцкий, 1999]. Важно отметить, что классификация отдельных элементов по принципу их необходимости различна для человека, высших растений, микроорганизмов.
Так, например, Se, который не является необходимым для ряда микроорганизмов, признан эссенциальным для человека. Бор, относится к элементам с неустановленной биологической ролью для человека [Скальный, 2000], в то время как для высших растений и ряда микроорганизмов, которые способны к гетероцистообразованию, показана его эссенциальность [Mateo, 1986; Bonilla, 1990; Blevins et al., 1998; Dannel era/., 2002]. По физиологическим функциям в организме необходимые элементы делят на три основные группы [Mengel et al, 1997]: структурные — задействованные в конструкции молекул или придающие им механическую прочность и адекватную конформацию (С, Н, О, S и др.); потенциалообразующие — необходимые для поддержания специфических электрохимических потенциалов и осмотических функций клетки (К, Na и др.); элементы с каталитическими функциями — участвующие в ферментативных реакциях организма, в данную группу входит подавляющее большинство микроэлементов (Fe, Си, Zn, Mo и др.) [Mengel etaiy 1997]. 1,3.2. Биологическая роль В, Mo, Se и Zn. В, Мо и Zn являются необходимыми микроэлементами для роста растений, а также микроорганизмов [Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989; Дедюхина, 1992, Битюцкий, 1999]. Se не относится к необходимыми элементам для микроорганизмов, но входит в группу эссенциальных элементов для человека [Авцын и др., 1991; Кудрин и др., 2000]. Бор относится к группе элементов с неустановленной биологической ролью для человека [Скальный и др., 2000]. Ниже приведена краткая характеристика данных элементов, показано их распространение в природе, физиологическое значение как для человека, так и для микроорганизмов. Бор относится к числу рассеянных элементов и в небольших количествах в природе встречается повсеместно [Nable et al, 1997]. Массовая доля бора в земной коре, по разным данным, составляет от 1,2 10"4 % до 4,6 10 % [Виноградов, 1962]. Почвы с высоким содержанием бора встречаются гораздо реже, чем бор-дефицитные. Зоны с высоким содержанием бора в почве находятся в Австралии [Cartwright et al., 1984, 1986], средней Азии [Ravikovitch et al, 1961], на солончаковых землях в России [Ковальский, 1974], в Израиле, на юге Чили [Caceres et al., 1999]. Поглощение бора из почвы растениями осуществляется в недиссоциированной форме (Н3ВО3, рКа - 5,8 10 10 при 25 С) (Ни et al, 1997]. В воде происходит диссоциация борной кислоты: Н3В03 + Н20 = Н4В04 + Н+ (рК = 9,23). Борная кислота и бораты способны образовывать комплексные соединения с органическими веществами при наличии у последних гидроксильных групп в ортоконфигурации [Мейчик, 1989] (Рис. 2), Такие комплексные соединения могут играть важную роль в транспорте бора [Turkina et aL, 1999; Lheto et al., 2000; Dannel et al, 2002]. Борная кислота, реагируя со спиртами, образует борные эфиры и/или цис-диол моноборатные эфиры, а также моноборатные эфиры с сахарами [Power et al, 1997; В levins et al, 1998]. Прочные соединения с бором дают молочная, дегидроаскорбиновая и яблочная кислоты [Matsunaga et al, 1995].
Микроскопирование
Микроскопирование проводили с помощью светового микроскопа Axiophot, фирма Carl Zeiss (Германия). 2.3. Определение биомассы Биомассу цианобактерий определяли нефелометрическим методом (ФЭК-М). Для определения биомассы (в г/л сух. веса) по величине экстинкции суспензии были построены калибровочные кривые. 2.4. КВЧ-облучение. КВЧ-облучение проводили с использованием прибора «Аквастим» (Россия), при длине волны 7,1 мм; время облучения - 45 мин, Р (плотность падающей мощности) = 1,5 мВт/см2. При изучении влияния КВЧ-облучения на способность культур к накоплению В, Mo, Se, Zn облучение проводили на 7-е сутки культивирования перед внесением в среду исследуемых элементов. 2.5. Условия введения исследуемых элементов. Для выяснения оптимального времени введения В, Mo, Se, Zn вносили в среду культивирования в трех вариантах: на 1 (вместе с инокулятом), 7 и 10 сутки роста. Указанные элементы вносили в виде соединений: Na2B407 7Н20, Na2MoC 4 2НгО; Na2SeC 3; ZnSC 4 7Н2О. Для выбора концентраций, оптимальных для получения обогащенной элементами биомассы, их вносили во время логарифмической фазы роста (на 7-е сутки). 2.6. Фракционирование биомассы. Отмытую и высушенную биомассу помещали в бидистиллированную воду (0,050 г в 3 мл НгО) и тщательно перемешивали. После этого клетки разрушали действием ультразвука (время — 25 с) с применением прибора УЗДН-А (Россия) [Смолин, 1969]. Получение фракций, содержащих липо- и гидрофильные компоненты клеток цианобактерий, осуществляли по методу Фолча [Folch et о/., 1957]. Разрушенные клетки заливали смесью №! (табл. 1), оставляли на 1 ч, после чего центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин, супернатант отделяли, осадок заливали смесью №2, центрифугировали, полученный супернатант объединяли с предыдущим. К объединенному супернатанту добавляли смесь № 3, в результате смесь разделялась на водно-метанольную (ВМФ) и хлороформную фракции (ХФ). Для определения элементного состава клеток цианобактерий биомассу подвергали полной минерализации в смеси HNOj и Н2О2, используя для этого титановые аналитические автоклавы «АНКОН АТ-2» и СВЧ-минерализатор «Минотавр» (Россия). Общий элементный состав биомассы цианобактерий (содержание Na, К, Mg, Са, Fe, Mn, Zn, Си, Мо, В) определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП) иа 48-канальном полихроматоре ICAP-9000 {Thermo Jarrell Ash) [Томпсон, 1988] Определение Zn в полученных фракциях проводили методом пламенной атомно-абсорбционной спектроскопии (ПААС) на спектрофотометре Perkin Elmer, 603, в пламени «ацетилен-воздух».
Определение Мо и Se в липофильном и гидрофильном компонентах фракций проводили методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии (ЭТА АС) на спектрофотометре фирмы Perkin Elmer «Зееман/3030». Определение Mo проводили по резонансной линии 313,3 нм, Se — 196,0 нм. В работе использовали печи из пористого графита и печи с пиролитическим покрытием и без него. В табл. 2. приведены температурно-временные условия определения селена и молибдена в графитовой печи. Применяемые методики были модифицированы, в связи с определением элементов во фракциях клеточных компонентов, которые содержат органические растворители (хлороформ, метанол). Модификация заключалась: а) в выборе оптимальных условий полной минерализации без потерь летучих соединений элементов (соотношение кислот, навески проб, выбор температурно-временного режима) для инструментальных методов; б) в составлении программы для определения элементного состава в растворах методом АЭС-ИСП (учет фона вблизи аналитических линий, спектральных наложений); в) в выборе условий атомизации Se и Мо в присутствии органических растворителей. Правильность определения элементов проводили, анализируя стандартные образцы водорослей (по программе - определение тяжелых металлов в водорослях, проводимой International atomic energy agency) IAEA-391, 393. 2.8. Статистическая обработка. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [Лакин, 1968]. Статистическая обработка данных осуществлена с использованием программы Microsoft Excel 97. В предварительных опытах было показано, что значительную роль в способности цианобактерий адаптироваться к элементам, находящимся в среде в повышенных концентрациях, играет время их введения в среду. Введение исследуемых элементов вместе с инокулятом (на 1 сутки роста) заметно снижало выход биомассы. Это может быть связано с токсическим действием элементов, введенных в среду в повышенных концентрациях, усиленное влиянием «культурального шока», который претерпевает культура при помещении в новую питательную среду [Хайлов, 1971]. Этого не наблюдали при внесении соединений В, Мо и Se в течение экспоненциальной фазы роста (рис. 5). Как видно из данных табл. 3, внутриклеточное содержание элементов не зависело от времени их введения. Исходя из полученных результатов, во всех последующих экспериментах элементы вносили в среду в течение логарифмической фазы роста культур (на 7-е сутки). Известно, что для большинства минеральных компонентов существует более или менее широкое плато концентраций, не оказывающих влияние на рост микроорганизмов. В то же время для ряда элементов (Se, Си, Zn) характерна очень узкая граница между концентрациями, необходимыми для роста и токсичными. Ингибирующее действие высоких концентраций элементов также различно для отдельных групп микроорганизмов [Дедюхина, 1992]. При изучении динамики роста S. platensis при внесении в среду исследуемых элементов в повышенных концентрациях, было показано, что добавление в среду культивирования S. platensis бора в концентрациях до 25 ммоль/л включительно, не вызывало изменений в скорости роста и выходе биомассы. При увеличении концентрации В (50 и 100 ммоль/л) наблюдали стимуляцию скорости роста [рис. 6 (В) кривые 2 и 3], увеличение плотности суспензии культуры уже на 11-е сутки роста, выход биомассы по отношению к контролю увеличивался на 35 и 10 % соответственно. Более высокие концентрации элемента (200 и 250 ммоль/л) вызывали подавление скорости роста культуры [рис. 6 (В) кривые 4 и 5], при внесении 300 ммоль/л наблюдали гибель клеток S. platensis на 13 сутки. Диапазон концентраций Мо, как и для В, в пределах которого возможен рост культур, достаточно широк. Ингибирование роста S. platensis и снижение выхода биомассы наблюдали при введении в среду культивирования 40 и 60 ммоль/л Мо [рис. 6 (Мо) кривые 2 и 3], Увеличение концентрации вводимого Мо до 80 ммоль/л [рис. 6 (Мо) кривая 4] приводило к сильному подавлению скорости роста культуры в логарифмической фазе, на 15 сутки плотность суспензии клеток снижалась, что указывает на гибель клеток. Внесение Мо в концентрациях, превышающих 80 ммоль/л, вызывало гибель клеток на следующий день после внесения элемента в среду культивирования. Исследование динамики роста platensis в присутствии Se в среде культивирования показало, что введение 0,06 ммоль/л элемента вызывало незначительное увеличение выхода биомассы S, platensis [рис. 6 (Se) кривая 2]. Введение в среду культивирования 0,3 ммоль/л Se незначительно снижало выход биомассы S. platensis, внутриклеточное содержание Se при этом составило 450,0 ± 30,5 мкг/г [рис. 6 (Se), кривая 3]. При введении в среду Se в концентрациях, превышающих 0,6 и 0,3 ммоль/л для S. platensis и N. commune соответственно, культуры приобретали кирпично-красную окраску.
Статистическая обработка
Наибольшая из изучаемых микроэлементов токсичность Zn связана с тем, что, являясь тяжелым металлом, Zn действует на весь спектр физиологических процессов цианобактерий в последовательности: деление = рост - функции клеточных мембран фотосинтез дыхание [Сенцова и др. 1985; Abdulla et al., 1989; Cid et ai, 1995] и относится к микроэлементам, обладающим наименьшим диапазоном концентраций между теми, при которых наблюдаются симптомы его недостатка, и теми, которые начинают вызывать подавление жизнедеятельности клеток [Дедюхина и др., 1992]. В связи с поставленными выше задачами нами были поставлены опыты по выявлению оптимальных концентраций В, Mo, Se и Zn. При определении оптимальных концентраций мы использовали критерий, основанный на произведении внутриклеточного содержания элемента на выход биомассы при данной концентрации. Оптимальной считали концентрацию, при которой значение этого критерия было максимальным. Оптимальная концентрация = = [внутриклеточное содержание элемента] [выход биомассы] Данный критерий предлагается нами и представляется достаточно удобным. Бор в качестве микроэлемента входит в состав сред для культивирования исследуемых цианобактерий в концентрации 0,05 ммоль/л, при этом внутриклеточное содержание В в биомассе S. platensis в 23 раза меньше, по сравнению с N commune (2,0±0,1 и 46,8±2,5 мкг/г, соответственно), что, возможно, объясняется поглощением его слизистоым чехлом. Внутриклеточное содержание бора в клетках S. platensis находилось в прямой зависимости от концентрации бора в среде культивирования (R = 0,99). Как видно на рис. 8, оптимальной концентрацией для обогащения биомассы S. platensis бором является 150 ммоль/л, величина произведения выхода биомассы на внутриклеточное содержание элемента для данной концентрации была максимальной, внутриклеточное содержание элемента составляло 907±56 мкг/г (рис. 8). Культура N. commune обладала более выраженной способностью к аккумуляции бора. Уже при введении в среду 10 ммоль/л неорганического бора внутриклеточное содержание составляло 8094,5 мкг/г сухого веса (рис. 8). Необходимо отметить, что, в отличие от S. platensis, для N. commune наблюдали лимитирование накопления клетками бора (R = 0,86), с увеличением концентраций от 15 до пороговой - 25 ммоль/л к тому же наблюдали снижение выхода биомассы N. commune, при этом внутриклеточное содержания бора не изменялось. Оптимальные концентрации для получения бор-обогащенной биомассы N. commune - 15 ммоль/л (рис. 8).
Молибден входит в состав сред для культивирования S. platensis и N. commune в качестве микроэлемента в концентрации 0,02 ммоль/л (Мо), внутриклеточное содержание для S. platensis и N. commune соответственно составляло: 2,5 ± 1,0 и 31,3 ± 8,1 мкг/г сух. веса. Оптимальные концентрации для получения Мо-обогащен ной биомассы S. platensis — 20 ммоль/л (внутриклеточное содержание молибдена — 5 912 ± 295,5 мкг/г сухого веса) (рис.9). Для культуры N. commune ингибирование роста наблюдали уже при внесении 0,5 ммоль/л; а введение 3,0 ммоль/л Мо вызывало гибель клеток. Максимальное включение Мо, наблюдаемое при введении 2,0 ммоль/л элемента, составляло 17500 ± 450 мкг/г, при данной концентрации наблюдали значительное снижение выхода биомассы (рис. 9). Оптимальной концентрацией для получения Мо-обогащенной N. commune является 1,0 ммоль/л (рис. 9). Концентрации, оптимальные для получения биомассы, обогащенной Se, для S. platensis и N. commune составили 0,3 и 0,25 ммоль/л соответственно (рис. 10). Превышение данных концентраций, как говорилось выше, приводит к накоплению неорганического Se клетками цианобактерий, о чем можно судить по появлению кирпично-красной окраски культуры [Ермаков, Ковальский, 1974; Пронина и др., 2002]. Концентрации, оптимальные для получения биомассы, обогащенной Zn для 5. platensis и JV. commune, составили 0,03 ммоль/л для обеих видов (рис. 11). Содержание Zn в биомассе N. commune при его введении в среду культивирования в концентрации 0,03 ммоль/л было выше в 3 раза по сравнению с S. platensis (табл. 4). Таким образом, изучение динамики роста и способности к накоплению В, Mo, Se и Zn клетками цианобактерий позволило выявить оптимальные концентрации для получения биомассы цианобактерий S. platensis и N. commune (табл. 4) и установить, что между содержанием микроэлементов в среде и в исследуемых объектах существует не просто линейная зависимость, а более сложные закономерности, определяемые видовой принадлежностью цианобактерий.
Действие КВЧ-облучения на аккумуляцию исследуемых элементов клетками S. platensis и N. commune
В соответствии с поставленными задачами были проведены эксперименты по изучению влияния КВЧ-облучения на способность накапливать клетками элементы В, Mo, Se и Zn. Известно, что КВЧ-облучение оказывает стимулирующее действие на скорость рост и выход биомассы S. platensis, что зависит от временных параметров, мощности (плотности потока) излучения, длины волны [Тамбиев и др., 1994, 1999,2000,2003]. Максимальный прирост биомассы S. platensis при однократном облучении культуры на 7-сутки роста составил 30%. Облучение проводили с использованием прибора «Аквастим» с рабочей мощностью 1,5 мВт/см при длине волны Х= 7Д мм в течение 45 мин. Варьирование кратности облучения, времени и длины волны не показало стимулирующего эффекта на рост и выход биомассы при КВЧ-облучении другой культуры - N commune. Отличительной особенностью КВЧ-излучения является сильное поглощение миллиметровых волн молекулами воды, имеющими большой дипольный момент (- 1,84 D) [Бецкий, Путвинский, 1986]. Возможно, электромагнитные волны миллиметрового диапазона поглощаются полисахаридным чехлом, окружающим клетки JV. commune, который содержит значительное количество воды, но возможно также, что для данного вида еще не подобраны оптимальные условия облучения, В литературе отмечалось, что биологические эффекты КВЧ-облучения носят резонансный характер и зависят, в первую очередь, от длины волны: на одних длинах волн обнаружен максимальный эффект, воздействие других длин волн не вызывает существенных изменений [Dardanoni et at, 1985; Rebrova, 1994; Gos et alt 1997]. В наших исследованиях облучение культур проводили, используя длину волны 7,1 мм, что было определено техническими возможностями прибора «Аквастим». В дальнейших опытах исследовалось сочетание предварительного КВЧ-облучения культуры на 7 сутки роста и введение элементов в оптимальных концентрациях в среду культивирования. КВЧ-облучение S. platensis, проведенное перед внесением в среду В не вызывало изменений в поглощении его клетками (рис. 12). Как отмечалось выше, по отдельности эти два фактора — физический (КВЧ-облучение) и химический (внесение в среду 50 ммоль/л бора) вызывали стимуляцию выхода биомассы (на 30 и 35% соответственно), но их сочетание не приводило к дополнительной стимуляции выхода биомассы. Применение предварительного КВЧ-облучения значительно (на 47%) увеличивало внутриклеточное содержание Мо при введении его в среду S. platensis в концентрации 20,0 ммоль/л (рис. 12).
При КВЧ-облучении S. platensis без внесения в среду Se, как отмечено выше, наблюдали существенный прирост биомассы, однако введение в среду культивирования S. platensis селена снимало стимулирующий эффект, прирост биомассы облученной культуры снижался со 120%) до 105,4 % - на 10 сутки, и со 130% до 108%) - на 20 сутки (рис. 13). Согласно одной из гипотез, при КВЧ-облучении происходит образование и накопление радикальных и перекисных соединений с последующим развитием окислительных реакций типа цепных, которые идут в липидной фазе [Тамбиев и др. 1998]. Действие Se, который является компонентом антиоксидантных систем, возможно, состоит в ингибировании этих процессов, что приводит к снятию стимулирующего эффекта облучения [Тамбиев и др., 2003]. Как было отмечено выше (раздел 3.1.), Zn в концентрациях, превышающих 0,06 ммоль/л, вызывал гибель культуры S. platensis. Предварительное КВЧ-облучение при введении 0,03 и 0,06 ммоль/л Zn заметно снижало его токсическое действие, а выход биомассы увеличивался в 2,5 и 4 раза соответственно по сравнению с необлучеиной культурой при введении тех же концентраций Zn (табл. 5). Как показано на рис, 14, продолжительность логарифмической фазы роста культуры S. platensis значительно увеличивалась при КВЧ-облучении, хотя была ниже, чем в контрольном образце. Как видно из табл. 5, КВЧ-облучение не вызывало изменений в способности аккумулировать Zn (0,03 и 0,06 ммоль/л) клетками S. platensis. Можно сказать, таким образом, что действие КВЧ-облучения на накопление исследуемых микроэлементов в клетках не является однозначным: оно не влияет на поглощение В; стимулирует поглощение Мо; снижает токсическое действие, вызываемое введением в среду Zn в повышенных концентрациях; a Se в свою очередь сам снимает стимулирующий эффект КВЧ-облучения на выход биомассы. 3.3. Изменение элементного состава под действием различных факторов. 3.3.1. Изменение элементного состава цианобактерий 5 . platensis и N. commune при КВЧ-облучении. Далее нами было рассмотрено влияние КВЧ-облучения на элементный состав клеток цианобактерий S. platensis и N. commune. Как отмечалось выше, при одинаковых условиях КВЧ-облучения двух культур у N. commune не наблюдали изменений в ростовых характеристиках (Гл. 3.2.). Нами было показано, что КВЧ-облучение S. platensis приводит к значительным изменениям макроэлементного состава: происходит увеличение содержания Na, К и Mg в клетках, по сравнению с необлученной культурой (рис. 15). Поскольку содержание нуклеиновых кислот в клетках микроорганизмов, как правило, увеличивается с повышением скорости роста, высказывается предположение, что потребность клеток в ионах Mg, К, Р должна возрастать в связи с этим [Дедюхина, 1992]. Поэтому мы не исключаем, что возрастание внутриклеточного содержания Mg и К является результатом увеличения скорости роста S. platensis, индуцированного в свою очередь КВЧ-облучением. Для всех остальных исследованных элементов (Са, Fe, Mg, Zn, Си, Mo) отмечалась лишь тенденция к увеличению содержания в клетках, что скорее всего связано с техническими возможностями используемого нами КВЧ-облучателя. Известно, что КВЧ-излучение может влиять на поглощение и транспорт ионов через мембрану, при этом отмечалась неоднозначность этих процессов в зависимости от типа ионов, а также от параметров облучения [Маркарова и др., 1992; Тамбиев и др., 1992; Tambiev et al.t 1994]. Одновременная регистрация изменения концентрации различных ионов при культивировании platensis после КВЧ-облучения показала, что процессы транспорта иона Na+ из среды в клетку или выделения его из клетки меняются раньше и в большей степени, чем транспорт таких ионов, как К+, CI , NO3 . Изменение мембранного транспорта катионов (Na и К) в результате действия КВЧ-облучения определяет физиологическое состояние культуры, а для иона нитрата эффект облучения может носить вторичный характер и является следствием действия его на другие процессы, например, фотосинтез [Маркарова и др., 1995].
Полученные нами данные вполне согласуются с указанными литературными источниками. При КВЧ-облучении культуры N. commune наблюдались изменения не только в макроэлементном составе (увеличение содержания в клетках Na, К), что было характерно для S. platensis, но также наблюдали увеличение внутриклеточного содержания В (рис. 15). Для объяснения избирательного поглощения В клетками N. commune при КВЧ-облучении необходимы дальнейшие исследования, причина, возможно, заключена в способности В связываться с полисахар ид ным чехлом клеток, о чем будет говориться ниже. Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод, что элементный состав клеток подобно другим физиологическим параметрам исследованных культур цианобактерий изменяется при действии КВЧ-облучения. 3.3.2. Изменение элементного состава клеток цианобактсрий при действии химического фактора. Полученные в нашей работе данные о влиянии В, Mo, Se, Zn, введенных в среду в повышенных концентрациях, на элементный состав клеток суммированы в табл. 6. Данные, представленные в таблице, указывают на то, что известная по литературе и по нашим опытам токсичность исследованных элементов связана с затрагиванием ими элементного фона клеток, который значительней всего меняется при наибольшей токсичности элемента, в данном случае Zn. Внесение в среду культивирования S. platensis бора в повышенных концентрациях, как видно из рисунка 16, вызывает увеличение внутриклеточного содержания Zn (R = 0,99). Есть мнение, что В усиливает поступление в клетку катионов и снижает поступление анионов (Чернавина, 1970). В литературе также имеются многочисленные примеры взаимодействия В с отдельными макро- и микроэлементами, но нами не было найдено примеров взаимодействия В с Zn. Наблюдаемое увеличение внутриклеточного содержания Zn в клетках S, platensis при поглощении В в нашем эксперименте может быть связано с основной функцией Zn в составе металлофермента [Дедюхина, 1992]. Возможно, при активном поглощении В в клетках S. platensis происходит дополнительный синтез необходимых ферментов, в которые включается Zn.
