Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Морфология артериального русла поджелудочной железы кошки 11
2.2. Ишемия поджелудочной железы и методы её исследования 15
2.2.1. ЭПР - спектроскопия как метод изучения структуры тканей.. 17
2.2.2. ЯМР - спектроскопия как метод изучения структуры тканей.. 22
2.3. Биологические эффекты ксимедона 26
3. Материалы и методы исследования 32
3.1. Объект исследования 32
3.2. Приготовление коррозионных препаратов сосудов поджелудочной железы 32
3.3. Моделирование ишемии 32
3.4. Морфологические методы исследования 33
3.5. Метод ЭПР - спектроскопии 35
3.6. Метод ЯМР - спектроскопии 38
3.7. Исследования воздействия ксимедона на поджелудочную железу 39
3.8 Статистическая обработка 39
4. Результаты исследования 40
4.1. Исследование артериального русла поджелудочной железы кошки с помощью приготовления коррозионных препаратов 40
4.2. Морфология поджелудочной железы кошки на разных сроках после нарушения артериального кровотока 42
4.2.1. Морфология поджелудочной железы через 5 минут ишемии . 42
4.2.2 Морфология поджелудочной железы через 15 минут ишемии. 48
4.2.3. Морфология поджелудочной железы через 30 минут ишемии. 53
4.2.4. Морфология поджелудочной железы через 60 минут ишемии. 55
4.2.5. Морфология поджелудочной железы через 90 минут ишемии. 60
4.3. Морфология поджелудочной железы кошки на разных сроках после нарушении артериального кровотока на фоне действия ксимедона 62
4.3.1 Морфология поджелудочной железы через 5 мин. ишемии на фоне действия ксимедона 62
4.3.2. Морфология поджелудочной железы через 15 минут ишемии на фоне действия ксимедона 62
4.3.3. Морфология поджелудочной железы через 30 минут ишемии на фоне действия ксимедона 63
4.3.4. Морфология поджелудочной железы через 60 минут ишемии на фоне действия ксимедона 64
4.3.5. Морфология поджелудочной железы через 90 минут ишемии на фоне действия ксимедона 67
4.4. Исследование поджелудочной железы кошки методом ЭПР - и ЯМР - спектроскопии в норме, на различных стадиях ишемии, а также при применении ксимедона 68
4.4.1. ЭПР - спектроскопия поджелудочной железы на разных стадиях ишемии 68
4.4.2. ЭПР - спектроскопия поджелудочной железы при ишемии органа на фоне применения ксимедона 72
4.4.3. ЯМР - спектроскопия поджелудочной железы на разных стадиях ишемии 76
4.4.4. ЯМР - спектроскопия поджелудочной железы при ишемии органа на фоне применения ксимедона 86
5. Обсуждение результатов исследования 92
Выводы 101
Практические рекомендации 102
Библиографический список использованной литературы. 103
- Ишемия поджелудочной железы и методы её исследования
- Приготовление коррозионных препаратов сосудов поджелудочной железы
- Морфология поджелудочной железы через 5 минут ишемии
- Морфология поджелудочной железы через 60 минут ишемии на фоне действия ксимедона
Введение к работе
Актуальность. Проблема ишемических повреждений различных органов и тканей остаётся одной из самых актуальных и недостаточно изученных в медицине и биологии. Эта актуальность обусловлена в первую очередь запросами клинической медицины, где врачам приходится сталкиваться с ишемическим повреждением различных органов [6, 7, 67]. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность последствий гипоксии для многих органов и тканей, в целом, механизмы ишемических повреждений разнообразных клеток и возможность их последующей регенерации остаются не до конца исследованными[1, 16, 66,]. В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с воздействием ишемии на поджелудочную железу[17, 27, 31, 81]. Этот интерес связан не только с конкретными клиническими ситуациями (тромбоз, эмболия, спазм сосудов поджелудочной
железы), но и определяется малой изученностью последствий ишемии для данного органа, в частности, нет однозначных данных о времени развития необратимых изменений в железе в зависимости от степени ишемии. При ишемических повреждениях органов и тканей перед врачами стоит задача - максимально уменьшить повреждающее воздействие ишемии для обеспечения полноценной регенерации органа, а также максимально увеличить время до наступления необратимых изменений. Перспективным в этом направлении может оказаться подход с фармакологической коррекцией ишемических повреждений, что активно используется в клинике при лечении последствий ишемии ряда органов.
Поскольку основными патогенетическими звеньями ишемических повреждений являются активация перекисного окисления липидов и усиление апоптоза, то и поиск антиишемических средств должен быть проведен среди факторов, уменьшающих интенсивность этих процессов или устраняющих их.
В настоящее время для решения этой проблемы используют широкий спектр препаратов, таких как антиоксиданты, блокаторы различных ферментов, препараты, улучшающие микроциркуляцию и т.д. В последние годы на различных моделях были изучены протекторные свойства представителя группы пиридиновых оснований 1,2-дигидро-4,6-диметил-Ы-(Р-оксиэтил)- пиримидона-2, то есть ксимедона, который обладает антиоксидантным и апоптозрегулирующим действием [10,73], стимулирующим регенерацию, противовоспалительным, противоожоговым [18,22], антимутагенным [72], иммуномодулирующим [63], гепатопротекторным действием [72]. Есть данные, подтверждающие положительный эффект ксимедона в лечении остеомиелита [36], трофических язв [21], склеродермии [56], атопической бронхиальной астмы [62], перитонита [12], регенерации периферического нерва [53]. Вместе с тем не исследованы противоишемические эффекты ксимедона. Неясно, сможет ли ксимедон защитить поджелудочную железу от губительных последствий ишемии.
Ещё одним важным аспектом этой проблемы является поиск критериев и маркёров, позволяющих адекватно оценить морфофункциональное состояние любого органа, подвергшегося ишемии. Для оценки жизнеспособности органов в условиях ишемии разные исследователи в зависимости от своих интересов используют разные критерии оценки жизнеспособности органов в условиях ишемии. Поиск достоверных и универсальных показателей оценки ишемического повреждения — одна из актуальных проблем современной медицины, в том числе в той её части, которая связана с трансплантацией органов [40,79,104,105,144]. Одним из таких перспективных подходов может быть использование современных физических методов оценки состояния тканей, таких как электронно-парамагнитнорезонансная (ЭПР) и ядерномагнитнорезонансная (ЯМР) спектроскопия, вместе с тем использование этих методов в практической медицине до настоящего времени ограничено.
Эти методы, ввиду их быстроты и информативности, а также возможности применения in vivo могли бы решить проблему оценки морфофункционального состояния органов и тканей в каждой конкретной клинической ситуации.
Цель исследования: Изучение морфологии поджелудочной железы кошки на разных сроках (от 5 минут до 90 минут) после нарушения артериального кровотока.
Задачи исследования:
1.Изучение морфологических характеристик поджелудочной железы кошки при помощи классических гистологических, гистохимических, иммуногистохимических, ультраструктурных методов исследования, а также методами ЭПР- и ЯМР- спектроскопии на сроках от 5 до 90 минут полного прекращения артериального кровотока для определения времени наступления необратимых изменений
2.Изучение влияния однократного внутрибрюшинного введения ксимедона в дозе 3,3мг/кг на структуры поджелудочной железы кошки при помощи гистологических, ультраструктурных методов исследования, а также методами ЭПР- и ЯМР- спектроскопии на сроках от 5 до 90 минут полного прекращения артериального кровотока.
Научная новизна. Новыми следует признать данные, полученные при изучении ишемических повреждений поджелудочной железы кошки методами ЭПР- и ЯМР-спектроскопии, ультраструктурными методами, свидетельствующие о том, что патологические изменения в сосудах и тканях органа, появляются уже через 5 минут от начала полного прекращения артериального кровотока.
Несомненной новизной обладают сведения о том, что наиболее ранними постишемическими нарушениями в поджелудочной железе являются изменения в микроциркуляторном русле, что в первую очередь сопровождается ультраструктурными изменениями в эндотелиальных клетках, свидетельствующими об их повреждении. Все последующие нарушения в органе являются следствием нарушения микроциркуляции.
Впервые методами ЭПР- и ЯМР-спектроскопии показано, что при полном прекращении артериального кровотока в поджелудочной железе кошки время развития необратимых ишемических изменений составило 60 минут.
Принципиально новыми следует признать данные о том, что однократное внутрибрюшинное введение ксимедона в дозе 3,3мг/кг до ишемического воздействия уменьшает выраженность деструктивных изменений и увеличивает время возникновения необратимых изменений.
Научно-практическая ценность работы. Результаты исследования позволяют оценить степень развития деструктивных изменений в паренхиме и сосудистом русле поджелудочной железы на разных сроках ишемии органа.
Полученные экспериментальные данные ЭПР-спектроскопии и ЯМРспектроскопии в совокупности с комплексом морфологических исследований позволяют приблизиться к пониманию механизмов любых повреждений органа, а с другой стороны могут быть использованы для оценки морфологического состояния поджелудочной железы при любых неблагоприятных воздействиях: токсическом поражении, инфекциях, травматическом повреждении, диабете. Данные работы свидетельствуют о возможности использования спектральных методов в клинической практике для оценки морфологического состояния органов и тканей. Также полученные данные могут быть использованы для оценки степени повреждений в поджелудочной железе, обусловленных деструктивным воздействием ишемии.
Кроме того, полученные в исследовании данные являются обоснованием возможности применения ксимедона для уменьшения повреждающего воздействия ишемии на поджелудочную железу, что необходимо для хирургической практики.
Положения, выносимые на защиту:
1. Использование ЯМР- и ЭПР-спектроскопии позволяет оценивать морфологическое состояние органа в условиях ишемии.
2.0днократное введение ксимедона в дозе З.Змг/кг
а) увеличивает сроки наступления необратимых ишемических повреждений при нарушении артериального кровоснабжения поджелудочной железы кошки,
б) предотвращает развитие ишемических повреждений на сроке до 60 минут от возникновения ишемии.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на международном конгрессе «Физическая культура, спорт и здоровье нации» (Санкт - Петербург, 1996); научной конференции, посвященной 190 - летию кафедры анатомии КГМУ и 100 - летию со дня рождения член корр. АН СССР проф. И.Г. Колосова «Влияние антропогенных факторов на структурное состояние органов, тканей организма и клеток организма человека и животного (Казань, 1997); на 5-й научно-практической конференции молодых ученых (Казань, 2001); на 11-м международном Евроазиатском конгрессе хирургов и гастроэнтерологов (Баку, 2008).
Публикации. По теме диссертация опубликовано 6 научных работ в Российских и Международных научных изданиях, в том числе одна статья в рецензируемом ВАК издании (Казанский медицинский журнал).
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка основной использованной литературы.
Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами, 85 рисунками. Список использованной литературы включает 150 наименований, из которых 80 отечественных и 70 зарубежных источников.
Ишемия поджелудочной железы и методы её исследования
Диагностика повреждения тканей имеет важное клиническое значение для профилактики и лечения различных заболеваний. Достоверными маркерами повреждения тканей могут служить молекулярные структуры, которые являются составными частями клеток, появление их в крови, в межтканевой жидкости может свидетельствовать о разрушении клеток. В качестве маркеров могут быть использованы мембраносвязанные молекулы и отдельные молекулы, содержащиеся в цитоплазме или органеллах клеток. Это наиболее распространенный подход к трактовке результатов энзимологических исследований в клинике и касается тех ферментов, которые выполняют свойственные или физиологические функции, находясь внутри клеток, а в межклеточное пространство и в кровь попадает лишь при патологии, когда целостность клеточных мембран нарушена в результате воспалительного или некротического процесса [5, 27, 125].
Чем тяжелее повреждение, тем большее количество фермента выходит из клеток в межтканевую жидкость, а оттуда в кровь. Исследование активности органоспецифических ферментов в плазме или сыворотке крови применяют для топической.диагностики, то есть для решения вопроса о том, какой орган и в какой степени затронут патологическим процессом. Каждая ткань имеет достаточно характерный для нее набор ферментов.
К прямым показателям повреждения тканей относятся фермент 5 -нуклеотидаза и циклический аденозинмонофосфат, активность которых увеличивается при различных заболеваниях, сопровождающихся повреждением плазматической мембраны и выходом содержимого цитоплазмы наружу [5, 61, 138].
Альтернативным направлением является разработка тестов с использованием моноклональных антител к органоспецифическим белкам , что позволит с высокой степенью точности определять локализацию очага деструкции [5, 35].
Одним из неблагоприятных повреждающих факторов является ишемия органов [1, 3]. Известно, что эффект ишемии различен в зависимости от чувствительности тканей к гипоксии. В большинстве тканей он зависит от тренированности к малокровию и некоторых внешних условий, например, гипотермии, которая задерживает развитие дистрофических изменений. [143]
Различают циркуляторную ишемию, и ишемию выключения органов; которая характеризуется равномерным лишением крови всего органа. Определение допустимой длительности ишемии (до развития дистрофических изменений) показало наличие критических периодов ишемии для различных органов. Так, по данным Биленко В.М., продолжительность критического периода головного мозга, лишенного крови составляет 5-10 минут, печени 30-60 минут, почки 60-90 минут, тонкой кишки - 2-3 часа, яичка 60-80 минут, мышцы конечностей 6-9часов [6, 11, 52].
Поджелудочная железа очень чувствительна к ишемии. Это было показано еще в 1862 году в эксперименте на собаках датским исследователем Панумом, который вызывал геморрагический отек, а затем некроз поджелудочной железы путем введения микрокапелек воска в поджелудочно-двенадцатиперстные артерии [83].
Эксперименты, проведенные с поджелудочной железой, показали, что изменения, возникающие в ткани поджелудочной железы на сроках 60-120 минут полной ишемии, могут привести к некрозу тканей [1, 30, 54]. 2.2.1 ЭПР — спектроскопия как метод изучения струкуры тканей
Разрушение клеток сопровождается образованием свободных радикальных групп, которые можно регистрировать с помощью ЭПР-спектроскопии [23, 54, 59, 66, 67]. Суть метода состоит в следующем.
Свободные радикальные группы - это молекулы и атомы, имеющие неспаренные электроны. Они, как правило, обладают повышенной активностью и называются парамагнитными центрами. Для того чтобы охарактеризовать несколько неспаренных электронов, необходима общая координатная ось. Однако, в отсутствии внешнего магнитного поля ее нет. Спины неспаренного электрона ориентированы случайным образом. Если к образцу приложить внешнее магнитное поле, то возникает общая координатная ось, вокруг которой все электроны начнут прециссировать таким образом, что проекция их спина на эту ось будет равна либо +1/2, либо -1/2.
При наложении внешнего магнитного поля неспаренные электроны разделяются на две группы: в одной из них спины будут ориентированы параллельно направлению поля, в другой - антипараллельно.
За счет этого кванта энергии неспареные электроны, находящиеся на более низком энергетическом уровне, переходят на верхний с одновременным изменением направления спина и поглощением энергии. При этом уменьшение мощности электромагнитного излучения, проходящего через систему, регистрируется каким-либо способом, принятым в абсорбционной спектроскопии. Одновременно электроны верхнего уровня переходят на нижний, излучая квант электромагнитной энергии. Этот процесс называется «индуцированной эмиссией». Коэффициенты поглощения и индуцированной эмиссии равны между собой и следовательно, если бы на двух энергетических уровнях находилось одинаковое количество электронов, не было бы поглощения. То обстоятельство, что оно все же имеет место, объясняется тем, что на нижнем энергетическом уровне всегда находится несколько больше неспареных электронов, чем на верхнем. Это разница и определяет интенсивность реально наблюдаемого сигнала ЭПР. Она является одним из самых важных параметров, определяющих рабочую чувствительность спектрометра.
Приготовление коррозионных препаратов сосудов поджелудочной железы
Изучали поджелудочную железу кошки на различных сроках ишемии органа. После внутримышечного введения рометара в дозе 0,2мл/кг срединной лапаротомией вскрывалась брюшная полость. В операционную рану выводили желудок, печень, выделяли и перевязывали чревную и краниальную брыжеечную артерию на различные сроки от 0 до 90 минут (сроки перевязки сосудов 5, 15, 30, 60, 90 минут). Далее изучали сосудистое русло и структуру поджелудочной железы по указанным ниже методикам.
В своей работе для приготовления коррозионных препаратов сосудов поджелудочной железы применили пластмассу «бутакрил», являющуюся пластиком акрилового ряда холодного отвердения. Она, по нашему мнению, обладает рядом ценных преимуществ. Во-первых, ее легко можно окрасить масляными красками в различные цвета, во-вторых, процесс полимеризации этой пластмассы протекает при комнатной температуре и заканчивается уже через 1-1,5 часа. В-третьих, консистенция рабочего раствора позволяет инъецировать мельчайшие сосуды, вплоть до капилляров. Рабочий раствор «бутакрила» мы готовили из расчета 1:1 или 1:1,5 (1 часть порошка и 1-1,5 части растворителя — соответствующего мономера). При таком соотношении ингредиентов раствор оставался пригодным к употреблению в течение 5-7 минут [16]. После воспроизводства ишемии поджелудочной железы на сроках 0,5,15,30,60,90 минут вводили бутакрил. Инъекции осуществляли с помощью обыкновенного шприца через канюлю, вставленную в аорту. Для- приготовления коррозионных препаратов артерий поджелудочной железы рабочий раствор «бутакрила», окрашенный в красный цвет масляной краской, вводили в грудную аорту. Через 1,5-2 часа после завершения процесса полимеризации бутакрила поджелудочные железы с инъецированными кровеносными сосудами помещались для коррозии в концентрированный раствор соляной кислоты. Весь процесс изготовления препаратов по изложенному методу составил 2-3 дня.
Из различных отделов поджелудочной железы (головка, тело, хвост) вырезались кусочки размером 0,5 см3. Полученный таким образом материал разрезали на 2 части. Одну половину фиксировали в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Карнуа и после соответствующей проводки (обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и замещение спирта ксилолом) заливали в парафин. Вторую половину использовали для изготовления криостатных срезов и электронной микроскопии. Ишемия представляет собой нарушение обменных процессов как в паренхиме, так и строме органа. Поэтому был использован комплекс морфологических методов исследования: 1. Для анализа гистологической структуры органа использовали стандартное окрашивание срезов гематоксилин-эозином. 2. Для выявления соединительнотканных волокон окрашивали по Ван-Гизону и проводили импрегнацию серебром по Футу [25]. 3. Для анализа функционального состояния эндотелия кровеносных сосудов и клеток паренхимы железы проводили гистохимическое выявление щелочной фосфатазы по Гомори, АТФ-азы по Вахштейну-Мейзелю и РНК по Браше [25,34,35]. 4. Дистрофические изменения в строме выявляли с помощью специфических окрашиваний на кислые гликозаминогликаны (реакция метахромазии с толуидиновым синим) и нейтральные гликозаминогликаны (ШИК-реакция (по Мак-Манусу)). Фибриноидное набухание, характеризующееся гибелью компонентов соединительной ткани выявляли по методу Маллори (модификация Д.Д. Зербино) [19,25]. 5. Эндотелий кровеносных сосудов и базальные мембраны выявляли с помощью иммуногистохимических реакций с антителами против фактора Виллебрандта (эндотелий) и ламинина (базальные мембраны) [49,69,115]. 6. Ультраструктурные изменения выявляли с помощью электронной микроскопии [50]. Часть неокрашенных криостатных срезов изучали в ультрафиолетовом спектре люминесцентного микроскопа "ЛЮМАМ Р2" для выявления собственного свечения эластических волокон.
Для электронномикроскопического исследования материал фиксировали в забуференном 2,5% растворе глутаральдегида при температуре 4 С в течение 1 часа, дофиксировали в забуференном 1% растворе Os02 в течение 2 часов, обезвоживали и заливали в ЭПОН-812. Ультратонкие срезы переносили на опорные сетки и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Изучение объектов проводили в электронном микроскопе «ЭММА-4».
Для иммуногистохимического анализа ткань заливали 7% раствором желатина на фосфатном буфере (PBS) и замораживали в жидком азоте с последующим изготовлением криостатных срезов толщиной 5-7 мкм. Срезы высушивали и фиксировали холодным ацетоном или 4% забуференным раствором параформальдегида. Исследование проводили с помощью моноклональных антител (МКАТ) фирм «Dako» и «BioGenexLaboratories». Подбор оптимального разведения антител проводился по результатам инкубации срезов с удваивающимся разведением антисыворотки либо в соответствии с сопроводительным описанием коммерческих МКАТ. Иммуногистохимические реакции ставили иммунопероксидазным (РАР) методом.
Исследование животных производили согласно международным и Российским этическим нормам (Хельсинская декларация Всемирной медицинской ассоциации, 1964; Европейская конвенция по биоэтике, 1966; Основы законодательства РФ// Ведомости съезда народных депутатов РФ и ВС РФ, 1993.-№33).
Морфология поджелудочной железы через 5 минут ишемии
На светооптическом уровне при классических методах окраски (гематоксилин-эозин, ван-Гизон) структура поджелудочной железы практически не отличается от нормы (контроля) (рис.16). Это касается экзокринной и эндокринной ее части, а также кровеносного микроциркуляторного русла (рис. 19).
Гистохимические исследования также не обнаруживают каких-либо особенностей строения органа на данном сроке ишемии. Сохраняется большое количество РНК в клетках экзокринной части, что определяется окраской по Браше (рис. 20). Наблюдается высокая активность щелочной фосфатазы и АТФ-азы в эндотелии сосудов (рис. 21).
Изменения на данном этапе определяются на ультраструктурном уровне, но это касается исключительно кровеносного микроциркуляторного русла. В электронном микроскопе видно набухание базальных мембран, отек субэндотелиального пространства с разволокнением на отдельных участках коллагеновых волокон. Эндотелиоциты при этом выбухают в просвет сосудов, в их цитоплазме обнаруживаются в большом количестве пиноцитозные пузырьки, увеличиваются и набухают митохондрии. В ядрах эндотелиальных клеток увеличивается содержание диспергированного хроматина за счет плотного, а ядро часто имеет неровный контур с многочисленными выемками (рис. 23). Указанный процесс определяется как «активация эндотелия».
На данном сроке определенные изменения выявляются уже светооптически, особенно в строме и системе кровеносной микроциркуляции. Наблюдается периваскулярный, местами перицеллюлярный отек, неравномерное кровенаполнение в виде чередования полнокровия с почти полностью обескровленными участками (рис. 25).В стенках сосудов имеет место мукоидное набухание с накоплением кислых мукополисахаридов, что выявляется окраской толуидиновым синим (рис. 24).В ряде случаев выявляются ШИК- положительные субстанции (рис.26). В некоторых наблюдениях при окраске по Пикро-Маллори обнаруживается «молодой» фибрин, причем часто расположенный экстраваскулярно. В эндотелии снижается активность щелочной фосфатазы. Иммуногистохимически, при сохранении экспрессии фактора Виллебрандта в эндотелии обнаруживается набухание базальных мембран сосудов, что выявлено при помощи МКАТ к ламинину. В УФ -спектре люминесцентного микроскопа наблюдается неравномерное свечение, утолщение и фрагментация эластических волокон сосудов артериального типа.
Ультраструктурные изменения в системе кровеносной микроциркуляции ещё более выражены. На фоне нарастания «активации» эндотелия и субэндотелиального отека можно было обнаружить деструкцию крист митохондрий (рис.27), появление большого количества микроворсинок на поверхности эндотелиоцитов, а также выраженное разволокнение и набухание коллагеновых волокон (рис. 28, 29).
Поджелудочная железа кошки. Уменьшение количества РНК в цитоплазме клеток экзокринной части через 30 мин. ишемии. Окраска по Браше, х 200. 4.2.3. Изменение морфологии поджелудочной железы через 30 мин. ишемии
На фоне углубления микроциркуляторных расстройств происходит изменение структуры стромы и паренхимы органа. Отмечается опустошение, а местами выраженный спазм выводных протоков желез экзокринной части (рис. 33). Снижается содержание РНК в клетках.(рис.ЗО) Базальные мембраны набухшие, гомогенизированные, в отдельных случаях с нарушением целостности. Составляющие сосудистые стенки ретикулиновые волокна подвержены мультипликации и огрубению (рис. 32). Снижена активность щелочной фосфатазы и АТФ-азы. Наблюдается отложение внутри- и внесосудистого фибрина (рис.34), мукоидное, а местами фибриноидное набухание стенок сосудов. Часто обнаруживаются ШИК-положительные субстанции. Описанные изменения, хотя и не могут пройти бесследно, все-таки являются обратимыми [1,3].
Результаты морфологических исследований показали, что данный срок является критическим для последствий ишемии органа. В ряде случаев имеют место необратимые процессы вплоть до некроза ткани поджелудочной железы. Так, наблюдаются выраженный отек, обширные кровоизлияния, внутрисосудистый гемолиз эритроцитов, внутри- и внесосудистое отложения фибрина, разрушение базальных мембран, сморщивание островков Лангерганса (рис. 35,36, 37). Имеются и явные участки некроза, причем, в ряде случаев, весьма обширные (рис. 38).
Очаг некроза в ткани поджелудочной железы кошки через 60 мин. ишемии. Окраска по ван - Гизону, х 100. На ультраструктурном уровне обнаруживаются дегенерирующие клеточные элементы с глыбчатым распадом ядер, деструкцией цитоплазматическои и ядерной мембран, образованием апоптозных телец и миелиноподобных структур (рис. 39, 40, 41). Следует отметить, что описанные изменения выявлены не во всех случаях, что, видимо, зависит от индивидуальных особенностей каждого животного. В то же время, на данном этапе ишемии уже нельзя гарантировать, что после прекращения воздействия патогенного фактора, поджелудочная железа сможет нормально функционировать.
Морфология поджелудочной железы через 60 минут ишемии на фоне действия ксимедона
На данном сроке имеет место нарастание расстройств микроциркуляции с наличием в большинстве случаев выраженного периваскулярного и перицеллюлярного отека (рис.45), в отдельных случаях - кровоизлияний с отложением фибрина (рис.46). В УФ-спектре люминесцентного микроскопа наблюдается разволокнение эластических мембран сосудов артериального типа. Ультраструктурный анализ показывает «активацию эндотелия», аналогичную 15 мин. сроку ишемии контрольной группы (рис.47). Снижается, хотя и незначительно, активность щелочной фосфатазы и АТФ-азы (рис. 48).
Пролиферативная активность клеток сохраняется в большинстве случаев, также, как и содержание РНК (рис. 49). Глубоких дистрофических, а тем более некротических изменений при применении ксимедона на данном этапе не наблюдается.
При исследовании ткани поджелудочной железы через 30 мин. ишемии получены спектры, на которых выявляются увеличенные по интенсивности сигналы с g=l,94; g=l,92; g=l,89 и уменьшенный по интенсивности сигнал с g=2,025, что соответствует изменениям, которые определяются через 5 минут ишемии без введения ксимедона (рис. 58,53).
ЭПР-спектры ткани поджелудочной железы через 30 минут ишемии на фоне введения ксимедона, соответствуют ЭПР-спектрам, полученным через 5 минут ишемии без ксимедона Полученные спектры через 60 минут ишемии показывают увеличение сигналов с g=l,94; g=l,92; g=l,89 и уменьшение сигнала с g=2,025, что соответствует картине 30 минутной ишемии органа без применения ксимедона (рис. 59, 54).
ЭПР-спектры ткани поджелудочной железы через 60 минут ишемии на фоне применения ксимедона соответствуют ЭПР-спектрам, полученным через 30 минут ишемии без ксимедона Спектры поджелудочной железы, полученные через 90 минут ишемии на фоне применения ксимедона примерно соответствуют спектрам на сроке 60 минут ишемии без введения ксимедона (рис. 60, 55). ЭПР-спектры ткани поджелудочной железы через 90 минут ишемии на фоне применения ксимедона Результаты статистической обработки ЭПР-спектров поджелудочной железы на фоне ишемии с применением ксимедона представлены в таблицах 4-6.
Следует отметить, что в ЯМР-спектрах тканей ex vivo появляются промежуточные фосфорные образования, участвующие в синтезе фосфолипидов мембран. Это продукты катаболизма мембран клеток. Например, фосфорилхолин, появляющийся на отметке +6ррт и фосфорилэтаноламин.появляющийся на отметке +7ррт. Фосфодиестеры появляются между линиями неорганического фосфора (+5ррт) и фосфокретина (Oppm), которые сформированы главным образом глицерофосфорилхолином и глицерофосфорилэтаноламином. Они располагаются на отметке -3-3,3ррт. Спектр АТР состоит из трех сигналов фракций: у-фракции (-3 ррт), а-фракции (-8ррт), (З-фракция(-Ібррт) [131, 132].
Через 60 минут ишемии увеличивалась интенсивность сигнала от неорганического фосфата и снижалась интенсивность сигнала от фосфокреатина (рис. 66). Рис. 65. ЯМР-спектроскопия поджелудочной железы через 30 минут ишемии, дальнейшее снижение сигнала от фосфокреатина и рост интенсивности сигнала от неорганического фосфата.
При ЯМР — спектроскопии нормальной ткани поджелудочной железы определяется высокая интенсивность сигнала как от фосфокреатина, так и у-фракции НТФ (рис. 73). Через 5, 30, 60, 90 минут ишемии происходило снижение интенсивности сигнала от фосфокреатина и у-фракции НТФ (рис. 74-77). У ишемизированной поджелудочной железы на фоне введения ксимедона получены сигналы от фосфокреатина, гамма-фракции НТФ и неорганического фосфата. В результате проведенного нами комплексного исследования поджелудочной железы кошки установлено, что уже после 5 мин. после нарушения органного кровотока на ультраструктурном уровне выявляются изменения, касающиеся, прежде всего, кровеносного микроциркуляторного русла. Так, отмечается гомогенизация и набухание базальных мембран, отек субэндотелиального пространства с разволокнением на отдельных участках коллагеновых волокон. При этом эндотелий выбухает в просвет сосудов, а в его цитоплазме обнаруживаются пиноцитозные пузырьки, набухают митохондрии, увеличивается число рибосом и полирибосом. В ядрах эндотелиальных клеток увеличивается содержание диспергированного хроматина за счет плотного, а ядро имеет неровный контур с выемками. В литературе указанный процесс определяется как «активация эндотелия» [9, 74]. При этом все исследователи сходятся на том, что данный процесс является обратимым [60, 70]. ЭПР-спектроскопия на этом этапе ишемии дает увеличение интенсивности сигналов с g=l,94, g=l,92 и g= 1,89 с параллельным уменьшением сигнала с g=2,025. Это, согласно литературным данным [66, 67], свидетельствует о снижении интенсивности сигналов от железосерных белков, а также об увеличении интенсивности сигнала от окисленного центра сукцинат Со - Q редуктазы, что отражает негативные процессы, происходящие в митохондриальной дыхательной цепи. ЯМР-спектроскопия показывала снижение, по сравнению с контролем, сигнала от фосфокреатина, гамма-фракции НТФ и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата, что говорит об ухудшении энергетического метаболизма, [10, 94, 131, 132, 133, 146].
При введении ксимедона на данном этапе ишемии не удалось выявить практически никаких изменений, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При этом ЭПР и ЯМР - спектры также полностью соответствовали нормальной ткани.
Через 15 минут после нарушения органного кровотока без применения ксимедона уже на светооптическом уровне выявляются структурные изменения в ткани поджелудочной железы, которые пока проявляются в основном в микроциркуляторном русле. Имеет место мукоидное набухание, отложение фибрина с параллельным снижением ферментативной активности эндотелия. Ультраструктурные изменения при этом еще более выражены - нарастает субэндотелиальный отек, увеличивается число микроворсинок на поверхности эндотелиоцитов, деструкция крист митохондрий, а также разволокнение, набухание коллагеновых волокон. Подобные ультраструктурные изменения, связанные с кислородным голоданием, описаны в различных органах и другими исследователями [60]. Авторы считают, что в зависимости от причины, вызывающей ишемию, момента внезапности в ее приложении, длительности гипоксии и степени чувствительности к ней ткани возникают либо тонкие гистохимические изменения на уровне ультраструктур, либо грубые деструктивные изменения в плодь до циркуляторного некроза. Электронно-гистохимические изменения в очаге ишемии в виде исчезновения гликогена, снижение активности окислительно-восстановительных ферментов и деструкции митохондрий, как правило, предшествуют изменениям ядра и цитоплазмы, характерным для инфаркта.
Следует отметить, что обнаруженные нами расстройства микроциркуляторного звена не являются специфичными только для ишемии. Анализ литературы показывает, что они носят универсальный характер и обнаруживаются в различных органах уже на ранних стадиях многих заболеваний [19, 25].
