Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современные представления о морфогенезе и гистологическом строении тимуса
1.2. Функции тимуса
1.3. Современные сведения о функциональном значении биогенных аминов и их участии в реакциях иммунитета
1.4. Современные представления о реакции организма на введение иммунотропных препаратов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ_
3.1. Морфофункциональное состояние тимуса гематологические показатели у интактных крыс
3.2. Морфофункциональное состояние тимуса через 14 суток
3.3. Морфофункциональное состояние тимуса и гематологические показатели после введения имунофана
3.3.1. Через 1 СуТКИ
3.3.2. через 7 суток
3.3.3. через 14 суток
3.4. Морфофункциональное состояние тимуса и гематологические показатели при комбинированном введении циклофосфана и имунофана
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ,
ВЫВОДЫ,
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Современные представления о морфогенезе и гистологическом строении тимуса
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Морфофункциональное состояние тимуса гематологические показатели у интактных крыс
Введение к работе
Актуальность темы.
В последние десятилетия наблюдается рост числа инфекционных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний. Эти болезни нередко вызваны первичным поражением иммунной» системы и* часто сопровождаются вторичными нарушениями ее функций. Различные травмы, длительный стресс, интоксикации, неблагоприятные экологические условия, химио- и лучевая терапия также могут приводить к развитию вторичной иммунологической недостаточности (Караулов А.В., 2000; Ильина Н.И.' и др., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000).
Поддержание адекватного иммунного статуса при химио- и лучевой терапии опухолей является важнейшей клинической проблемой, однако до настоящего времени остается недостаточно изученной. Наслоение индуцированной цитостатиками иммунодепрессии на неблагоприятный общий иммунодефицитный фон, присущий течению опухолевых заболеваний, ведет к увеличению частоты вторичных осложнений (Гершанович М.Л., 1982; Ильина Н.И. и др., 2000; Кузьмина Е.Г. и др., 2003). При этом резко повышается восприимчивость к инфекциям, возможна также индукция вторичных злокачественных опухолей (Гершанович М.Л., 1982). Это связано, в основном, с повреждающим действием цитостатиков на лимфоидную ткань (Wang G.J., Cai L., 1999). Несмотря на очевидную важность проблемы, имеющиеся в литературе сведения в указанном аспекте крайне немногочисленны и фрагментарны, касаются, главным образом, токсического действия отдельных противоопухолевых препаратов на гемопоэз (Zandvoort A. et al., 2001).
Лимфоидная ткань, являясь основным местом развития специфических иммунологических реакций, содержит многочисленные клеточные популяции, участвующие в обеспечении генетического постоянства внутренней среды организма (Сепиашвили Р.И., 2003). При этом тимус рассматривается как «полигон», на котором посредством биологически активных пептидов формируются приобретенный и естественный иммунитет (Акмаев И.Г., 2001). Иммунорегуляторными факторами, обеспечиваюшими функции тимуса, наряду с цитокинами и тимическими гормонами, являются биогенные амины (Кветной И.М. и др., 2003; Hadden J.W., 1992, 1998). Несмотря на кажущуюся изученность различных структурно-функциональных характеристик, тимуса, следует отметить, что роль биогенных аминов в его функции, особенно в условиях иммунодефицита, изучена недостаточно. Отсутствуют сведения о состоянии биоаминсодержащих структур тимуса при цитостатической иммунодепрессии.
Среди препаратов иммунодепрессивного действия широкое распространение получил циклофосфан, который входит во многие схемы противоопухолевой терапии (Переводчикова Н.И., 1993; Allison А.С., 2000), используется для профилактики отторжения трансплантантов (Gorantla V.S. et al., 2000), для лечения аутоиммунных заболеваний (Дранник Г.Н. и др., 1994; Думай В.Л., 2002; Raza К. et al., 2000; Lamprecht P. et al., 2002). Ингибирование функциональной активности клеток иммунной системы является одним из главных причин токсического действия циклофосфана (Зуева Е.П., Яременко К.В., 1989; Zusman I. et al., 2002), поэтому проблема снижения его побочных действий является весьма актуальной (Земсков A.M. и др., 1994; Zusman I. et al., 2002).
Одним из путей повышения эффективности лечения онкологических и других заболеваний химиотерапевтическими препаратами является их комбинирование с иммуномодуляторами (Земсков A.M. и др., 1994; Менек Т.А. и др., 2000; Жданов В.В. и др. 2002; Мирюнусов М.Ш. и др., 2002). Имеются сведения о том, что применение препаратов тимического происхождения до начала или после химиотерапии у больных с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями способствовало подъему ранее сниженных показателей иммунитета и улучшению состояния больных (Дранник Г.Н. и др., 1994; Garaci Е., 2000). Одним из тимических препаратов последнего поколения, использующимся при лечении различных иммунодефицитных состояний и в онкологической практике, является имунофан (Покровский В.И. и др., 1998; Лебедев В.В. и др., 1999; Караулов А.В., 2000). В доступной литературе мы не встретили работ, касающихся морфологических аспектов иммуномодулирующего действия имунофана.
Всестороннее исследование влияния иммунотропных препаратов на органы иммунной системы, особенно на тканевом уровне, необходимо для избирательного, целенаправленного воздействия на нарушенные гистофизиологические процессы, что, в свою очередь, является обязательным условием успешной иммуномодуляции, иммунокоррекции и иммунореабилитации (Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., 2002). Поэтому детальное исследование морфофункционального состояния тимуса при иммуносупрессии, вызванной циклофосфаном, изучение морфологических аспектов иммуномодулирующего действия имунофана, а также возможностей коррекции имунофаном циклофосфан-индуцированных изменений представляет большой интерес как для практической медицины, так и для гистологии, иммунологии и иммуноморфологии.
Цель исследования — изучить морфофункциональное состояние тимуса и показатели крови через 1, 7 и 14 суток после изолированного введения циклофосфана, имунофана и их комбинации.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
Исследовать уровень биогенных аминов и их соотношение в люминесцирующих структурах тимуса, изучить популяцию тучных клеток и провести морфометрию коркового и мозгового вещества долек тимуса через 1, 7 и 14 суток после изолированного введения циклофосфана.
Определить содержание биоаминов и их соотношение в люминесцирующих структурах тимуса, изучить популяцию тучных клеток, провести морфометрию долек тимуса через 1, 7 и 14 суток после курсового введения имунофана.
Исследовать уровень биогенных аминов и их соотношение в люминесцирующих структурах тимуса, изучить популяцию тучных клеток, провести морфометрию долек тимуса через 1,7 и 14 суток после введения циклофосфана с последующим курсовым введением имунофана.
Определить количество эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, содержание гемоглобина, а также уровень иммуноглобулинов в крови после изолированного введения циклофосфана, имунофана и их комбинации.
Научная новизна работы
Впервые показано, что острая инволюция тимуса, развивающаяся после введения циклофосфана, сопровождается увеличением количества люминесцирующих гранулярных клеток тимуса на фоне усиления люминесценции тимоцитарнои паренхимы, возрастанием в них уровня биогенных аминов, особенно гистамина, повышением соотношения (серотонин+гистамин)/катехоламины.
Впервые представлены результаты исследования цитоархитектоники тимуса после применения имунофана. Увеличение размеров коркового и мозгового вещества долек тимуса, снижение соотношения (серотонин+гистамин)/катехоламины в клетках тимуса может рассматриваться как одно из проявлений иммунокоррегирующего действия препарата.
Установлено, что введение циклофосфана в комбинации с имунофаном сопровождается менее выраженными изменениями структуры тимуса, увеличением размеров коркового и мозгового вещества долек, уменьшением уровня биогенных аминов и со
Впервые описаны изменения количественного и качественного состава популяции тучных клеток тимуса после введения циклофосфана, имунофана и их комбинации, показано участие тучных клеток в процессах восстановления ткани тимуса после повреждения циклофосфаном.
Приоритетными следует считать данные о том, что использование имунофана после введения циклофосфана снижает степень инволютивных изменений в тимусе и способствует ускорению восстановления структуры органа.
Научно-теоретическая значимость
Результаты исследования дополняют представление о морфофункциональном состоянии тимуса в условиях иммуносупрессии (введение циклофосфана) и иммунокоррекции (введение имунофана). Полученные данные об изменениях биогенных аминов в тимусе при острых инволютивных процессах, их связь с изменениями количества люминесцирующих гранулярных и тучных клеток представляют интерес для гистологии и иммунологии.
Практические рекомендации
Результаты исследования могут служить морфологическим обоснованием применения имунофана для уменьшения повреждающего действия циклофосфана на лимфоидную ткань тимуса и позволяют рекомендовать комбинированное использование циклофосфана и имунофана в онкологической практике. Работа представляет несомненный интерес для практических врачей: онкологов, гематологов, иммунологов и терапевтов.
Результаты работы используются в материалах лекций, при проведении практических занятий и семинаров на кафедре функциональной и лабораторной диагностики Чувашского госуниверситета, кафедре терапии и семейной медицины ГОУ "Институт усовершенствования врачей" МЗ Чувашской республики, а также в практической работе врачей-онкологов Республиканского клинического онкологического диспансера МЗ Чувашской республики. Результаты исследования нашли отражение в опубликованных статьях и тезисах.
Основные положения, выносимые на защиту:
Введение циклофосфана приводит к значительному увеличению количества люминесцирующих гранулярных клеток и тучных клеток в тимусе на фоне деформации долек, фрагментации и уменьшения размеров коркового и мозгового вещества и замещения паренхимы жировой тканью. Во всех изучаемых структурах тимуса, особенно в паренхиме, отмечается значительный рост уровня гистамина. Выявленные изменения являются следствием развития острой инволюции тимуса в ответ на введение цитостатика.
Курсовое введение имунофана сопровождается увеличением размеров коркового и мозгового вещества долек тимуса, волнообразными изменениями уровня биогенных аминов в люминесцирующих клетках и их микроокружении с тенденцией к более значительному повышению уровня катехоламинов в тимоцитарной паренхиме к 14 суткам после окончания инъекций.
Введение циклофосфана в комбинации с имунофаном приводит к менее выраженным и более кратковременным изменениям морфологии тимуса, способствует снижению уровня гистамина и увеличению доли катехоламинов в его структурах, особенно в тимоцитах, по сравнению с изолированным введением циклофосфана, что свидетельствует о способности имунофана снижать степень инволюции тимуса и ускорять восстановление его структуры.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на Всероссийской научной конференции."Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей" (С.-Петербург, 2001), IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения-2002" (С.-Петербург, 2002); V Юбилейном съезде иммунологов и аллергологов СНГ (С.-Петербург, 2003), 1-ой Всероссийской конференции по иммунотерапии (Сочи, 2003), на гистологической конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей" (С.-Петербург, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ в материалах международных и всероссийских научных конференций, из них 1-статья, 5 - тезисы.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста (собственно текста — 125 страниц), состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех разделов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами, 63 рисунками. Список литературы включает 307 источников, в том числе 137 зарубежных.
Современные представления о морфогенезе и гистологическом строении тимуса
Тимус (вилочковая железа) является центральным органом иммунной системы и одновременно эндокринной железой (Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996; Хлыстова З.С. и др., 2000-2002; Kendall M.D, 1981; Hadden J.W., 1992-1998).
Для всех органов иммунной системы характерна ранняя закладка в эмбриогенезе (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996), Закладка тимуса у человека происходит в конце первого месяца внутриутробного развития в виде двух тяжей многослойного эпителия в шейной области, отрастающих от покровного эпителия III и IV жаберных карманов. На 5-6-й неделе клетки тяжей приобретают отростчатую форму, постепенно преобразуясь в ретикулоэпителий (Хлыстова З.С, 1987). На 7-й неделе развития в эпителиальной строме тимуса появляются первые лимфоциты. На 8-11-й неделе врастающая в эпителиальную закладку органа мезенхима с кровеносными сосудами подразделяет орган на дольки. На 11-12 неделе развития происходит дифференцировка лимфоцитов, и уже определяются корковое и мозговое вещества (Хлыстова З.С, 2000; Афанасьев Ю.И., Юрина НА., 2002; Arya S. et al., 1982). Начиная с этого периода происходит заселение периферических органов иммунной системы Т- и В-лимфоцитами.
К моменту рождения тимус полностью сформирован и функционально зрелый (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996). Дольки крупные, разделены узкими междольковыми септами, корковое вещество преобладает над мозговым (Туаева З.С, Тотоев Н.М., 1993; Kendall М., 1990). После рождения масса тимуса увеличивается и достигает максимума к периоду полового созревания, после чего вскоре она начинает уменьшаться пропорционально возрасту (Сапин М.Р., Этинген Л.Е., 1996). Возрастная инволюция характеризуется уменьшением объема паренхимы, фрагментацией коркового вещества, разрастанием соединительной и жировой ткани, укрупнением тимусных телец за счет их слияния и образования кистозных структур, уменьшением их количества, снижением функциональной активности клеток тимуса (Петренко В.М., 1998; Ерофеева Л.М., 2002; Ярилин А.А., 2003; SteinmanmG.G., 1986; Bodey В.. et al., 1997). Однако, несмотря на инволюцию, тимус продолжает участвовать в иммуногенезе (Забродин В.А, Галкина Ю.М., 1992; Sempowski G.D., et al., 2000; Haynes B.F. et al., 2000; Shiraishi et al., 2003).
Зрелый тимус представляет собой эпителиально-лимфоидный орган. Основную массу клеток тимуса представляют лимфоциты (тимоциты), имеющие мезодермальное (костномозговое) происхождение. Нелимфоидные клетки тимусной микросреды представлены отростчатыми эпителиальными клетками (эпителиоретикулоцитами), образующими мягкую строму органа, и вспомогательными клетками — дендритными клетками тимуса и макрофагами (Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., 2002; Николаева О.Я., 2002).
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 145 белых беспородных крысах-самках массой 115-305 г, 14 из которых были интактными. Содержание животных и все процедуры проводились согласно правилам обращения с лабораторными животными. Проведено 3 серии экспериментов, каждая из которых включала курсовое 7-кратное введение разных препаратов с интервалом в 48 часов (через день):
I — введение циклофосфана (ОАО "Биохимик", г. Саранск) в дозе 200 мг/кг однократно внутримышечно на физиологическом растворе (доза для моделирования иммунодепрессии (Черненко О.Д., Гриневич Ю.А., 1991)) с последующим 6-кратным введением через день 0,5 мл физиологического раствора — 37 крыс;
II — введение имунофана (НПП "Бионокс", г. Санкт-Петербург) по 1 мкг/кг на физиологическом растворе внутримышечно 7-кратно через день (доза препарата рассчитана, исходя из человеческой лечебной) — 34 крысы;
III — комбинация однократного введения циклофосфана и имунофана через день 7-кратно в вышеуказанных дозах — 35 крыс.
В качестве контроля использованы животные, которым вводили по 0,5 мл физиологического раствора внутримышечно 7-кратно через день (п=25).
Объектами исследования служили тимус и кровь. Материал забирали под глубоким эфирным наркозом через 1, 7 и 14 суток после последней инъекции. Тимус взвешивали, его массу выражали в мг на 100 г массы крысы. Затем изготавливали криостатные срезы органа толщиной 10 мкм.
Для исследования срезов тимуса использовали следующие методы:
1. Люминесцентно-гистохимический метод Фалъка-Хилларпа (Falk В., Hillarp N., 1962) в модификации Е.М. Крохиной (Крохина Е.М., Александров П.Н., 1969) — для выявления серотонина и катехоламинов. Метод основан на реакции конденсации катехоламинов формальдегидом, в результате чего образуются 1,2,3,4-тетрагидроизохинолины, которые при дегидратации превращаются в интенсивно флуоресцирующие 3,2-дигидросоединения изохинолина (Bjorklund A. et. al., 1973). Эти продукты образуют люминесцирующий комплекс, дающий ярко-зеленую флуоресценцию. При взаимодействии с серотонином? образуются; карболины, обладающие белым» и желтым свечением. Люминесцентно-гистохимический метод в модификации Е.М. Крохиной отличается от оригинальной методики Фалька высушиванием срезов в воздушной среде, без использования лиофилизации. Криостатные срезы тимуса обрабатывали в параформальдегидной камере в течение 1 ч при температуре 80С и заключали в полистирол.
Морфофункциональное состояние тимуса гематологические показатели у интактных крыс
На препаратах тимуса интактных крыс, окрашенных гематоксилином-эозином, хорошо определяются дольки полигональной формы. Их центральную часть составляет светлое мозговое вещество, окруженное более темным корковым веществом (рис. 1). Ширина коркового вещества составляет 0,51 мм, диаметр и площадь мозгового вещества — 0,989 мм и 0,784 мм соответственно. Дольки отграничены друг от друга четко выраженными междольковыми соединительнотканными септами.
При обработке срезов тимуса по методу Фалька корковое и мозговое вещество обладают коричневато-зеленым, а по методу Кросса — зеленым свечением за счет присутствия в лимфоцитарной паренхиме определенной концентрации биогенных аминов: серотонина, катехоламинов и гистамина. При этом мозговое вещество люминесцирует несколько слабее.
На границе коркового и мозгового вещества располагается 1-2 непрерывных ряда люминесцирующих гранулярных клеток (рис. 2), условно названных "премедуллярными" (Сергеева B.C., Гордон Д.С., 1992). Гранулы премедуллярных клеток имеют разную величину, обладают беловато-желтым, зеленовато-желтым или желто-оранжевым свечением. Обычно они расположены компактно, не оставляя визуально различимых межгранулярных промежутков (рис. 3).
Кнаружи от премедуллярных клеток в корковом веществе находятся хаотично расположенные более мелкие люминесцирующие "субкапсулярные" клетки, заполненные гранулами зеленовато-желтого свечения. Мозговое вещество, ограниченное рядом премедуллярных клеток, у интактных крыс имеет неправильную форму.
В междольковых пространствах и периваскулярно выявляются тучные клетки (до 3-4 в поле зрения), также обладающие люминесценцией, но отличающиеся от премедуллярных и субкапсулярных клеток по своей форме и величине гранул. Обычно тучные клетки имеют овальную форму, в центре клетки расположено нелюминесцирующее ядро. Гранулы имеют одинаковую величину, округлую форму и обладают зеленовато-желтой люминесценцией.
Цитоспектрофлюориметрия показала наличие биогенных аминов как в люминесцирующих клетках, так и в тимоцитарной паренхиме. Преобладающим является гистамин, содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих клетках приблизительно равное (рис. 4), в тимоцитах коркового вещества и микроокружения тучных клеток уровень катехоламинов немного выше, чем серотонина (рис. 5).
