Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Потенциалозависимьіе натриевые каналы 11
1.2. Потенциалозависимьіе натриевые каналы Navl .8 16
1.3. Na+,K+-AT Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Метод краткосрочного культивирования диссоциированных сенсорных нейронов 58 2.2. Экспериментальные растворы 61 2.3. Регистрация ионных токов и управление программой эксперимента 62 Глава 3. Результаты 3.1. Исследование влияния 5-гидрокси-2-гидроксиметил- у-пиридона и 5-г14дрокси-1-метил-у-пиридон-2-карбоновой кислоты на медленные натриевые каналы 68 3.2. Исследование влияния сердечных гликозидов на медленные натриевые каналы 3.2.1. Действие оуабаина 78 3.2.2. Эффект оуабагенина 87 3.2.3. Действие дигоксина 87 Глава 4. Обсуждение 4.1. Механизмы действия у-пиридонов 89 4.2. Механизмы действия сердечных гликозидов 96 Заключение 109 Выводы по Список сокращений 112 Список работ, опубликованных по теме Диссертации 113 Список цитируемой литературы Введение к работе В основе многих физиологических процессов (передача электрических и химических сигналов, сокращение, секреция) лежит работа ионных каналов биологических мембран. Ионным каналам свойственны избирательная проницаемость для ионов и способность открываться и закрываться при различных воздействиях на мембрану. Несколько упрощенно ионные каналы можно разделить на лиганд-управляемые и потенциалозависимые. Эта классификация, однако, постоянно требует уточнения в связи с обнаружением как новых каналов, так и новых молекулярных механизмов их модуляции. В этом отношении большой интерес представляет способность мембранных рецепторов, расположенных вблизи ионных каналов, регулировать функциональную активность последних. Выяснение физиологической роли таких новых молекулярных структур, образующих единую систему мембранный рецептор - ионный канал, представляется весьма актуальным. Физиологически активные вещества, воздействуя на систему мембранной сигнализации мембранный рецептор — ионный канал, могут иметь несколько "рецептирующих" зон, представляющих собой части аминокислотных последовательностей макромолекул рецептора и канала. В последнем случае применима гипотеза о так называемом "модулированном рецепторе" (Strichartz, 1973; НШе, 1977; Можаева и др., 1980). В первом случае, когда центром связывания атакующей молекулы служит мембранный рецептор, включаются 5 трансдукторные процессы, усиливающие на порядки молекулярный рецепторный сигнал и передающие его на мембранный ионный канал. Воздействия на указанные трансдукторные процессы открывают новые возможности модулирования возбудимости ионного канала, что должно иметь важные физиологические последствия на системном уровне. Такой подход особенно интересен в практическом отношении при исследовании механизмов ноцицепции. Потенциалозависимые натриевые каналы (Navl.l - Nav1.9) являются важнейшими молекулярными структурами, обеспечивающими возбудимость. Большой интерес представляет исследование роли натриевых каналов в передаче ноцицептивной информации. Существует две причины, по которым потенциалозависимые натриевые каналы считаются перспективными мишенями для исследования антиноцицептивного эффекта. Во-первых, они лежат в основе генерации потенциалов действия, в результате выключения этих каналов полностью блокируется передача нервных импульсов и, тем самым, прерываются все сигналы, включая ноцицептивные. Во-вторых, представляется особенно перспективным осуществление рецептор-опосредованной модуляции возбудимости ответственных за кодирование ноцицептивных ответов медленных натриевых каналов (Nav1.8). Подход такого рода позволит сохранить способность передачи ноцицепторами сигналов других модальностей (тактильных и температурных), избирательно выключив высокочастотную компоненту их импульсной активности, кодирующую болевой сигнал при возникновении хронической боли. Медленные тетродотоксиннечувствительные (ТТХГ5 Nav1.8) натриевые каналы определяют процесс кодирования ноцицептивных сигналов в афферентах и сенсорных нейронах (Borovikova et al., 1997; Cardenas et al., 1997). Модуляторы активности этих каналов являются субстанциями, применение которых представляется перспективным с точки зрения разработки новых аналгетических лекарственных препаратов. В 1999 году был предложен новый механизм (Крылов и др., 1999) модулирования возбудимости медленных натриевых (Nav1.8) каналов, связанный с активацией опиоидоподобных рецепторов. Трансдукторную функцию в этом случае выполняет Na+, К+-АТФаза. Механизмы этой модуляции исследуются в настоящей работе при непосредственном воздействии на мембранный рецептор производными гамма-пиридонов (все воздействия устранялись неспецифическими блокаторами опиоидных рецепторов налоксоном, налтрексоном) и при воздействии на Na+, К+-АТФазу сердечными гликозидами. Многие у-пиридоны широко используются в различных областях медицины для лечения заболеваний, вызванных избыточным содержанием в плазме крови различных микроэлементов (Thompson et al., 2006). Благодаря своим свойствам у-пиридоны представляют интерес как перспективный материал для создания аналгетиков нового поколения, мембранной мишенью действия которых могут служить опиоидоподобные рецепторы. В клинической практике и в физиологических экспериментах сердечные гликозиды используют для специфического ингибирования активности Na+, К+- 7 АТФазы - натриевого насоса, утилизирующего энергию гидролиза АТФ для активного транспорта ионов Na+ и К+ через мембраны клеток. Эта насосная функция Na+, К+-АТФазы хорошо известна. Она необходима для поддержания мембранного потенциала клетки в строго определенном диапазоне. В настоящей работе исследуется дополнительная — трансдукторная — функция натриевого насоса. Она была обнаружена при исследовании сенсорных нейронов (Крылов и др. 1999), кардиомиоцитов (Xie and Askari, 2002). В настоящее время эта функция интенсивно исследуется в клетках разных тканей (Mohammadi et al., 2001; Lencesova et al., 2004; Zhang et al., 2006). Важно, что трансдукторная функция Na+, К+-АТФазы может активироваться оуабаином (Xie and Askari, 2002; Liang et al., 2007). Поскольку очень низкие (наномолярные) концентрации оуабаина были обнаружены в системном кровотоке (Schoner and Schiener-Bobis, 2005) представляется важным исследование физиологической роли трансдукторной функции Na+, К+-АТФазы, при воздействии указанных очень низких концентраций сердечного гликозида. Можно предположить, что эндогенный оуабаин может вызывать антиноцицептивный эффект. Учитывая тот факт, что специфическое рецептор-опосредованное или трансдуктор-опосредованное модулирование характеристик медленных натриевых каналов остается малоизученным, можно предположить, что результаты, полученные в этой области, окажутся востребованными при разработке новых фармакологических подходов к решению проблемы хронической периферической боли (Gold, 2008). 8 Цель и задачи исследования: Целью работы было исследование механизма системы мембранной сигнализации: опиоидоподобный рецептор - Ыа+,К+-АТФаза - медленные натриевые каналы (Nav1.8) сенсорных нейронов. В ходе исследования были поставлены и решены следующие задачи: Выяснить возможные молекулярные механизмы действия у-пиридонов на медленные натриевые каналы (Nav1.8). Изучить возможные механизмы воздействия ряда представителей сердечных гликозидов на модулирование возбудимости медленных натриевых каналов (Nav1.8). Основные положения, выносимые на защиту: С помощью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp method) получены доказательства, свидетельствующие о рецептор-опосредованном действии у-пиридонов на мембрану сенсорного нейрона. Установлено, что представители сердечных гликозидов - оуабаин, дигоксин и кардиотонический стероид оуабагенин различаются на порядки по своей эффективности модулировать трансдукторную функцию Ка+,К+-АТФазы путем снижения потенциалочувствительности активационной воротной системы медленных натриевых каналов Nav1.8. Полученные результаты свидетельствуют о том, что кроме сайта связывания сердечных гликозидов, ответственного за 9 ингибирование насосной функции, в молекуле №+,К+-АТФазы присутствует еще один сайт, специфическое связывание гликозидов с которым модулирует трансдукторную функцию №+,К+-АТФазы. Научная новизна. Впервые было показано, что 5-гидрокси-2- гидроксиметил-у-пиридон (АК1) и 5-гидрокси-1-метил-у-пиридон-2-карбоновая кислота (АК2) способны уменьшать потенциалочувствительность натриевых каналов Nav1.8, причем наблюдаемый эффект устранялся при предварительном приложении в наружный раствор неспецифического блокатора опиоидных рецепторов налоксона в концентрации 50 мкмоль/л и блокатора №+,К+-АТФазы оуабаина в концентрации 200 мкмоль/л. Это свидетельствует о возможном участии опиодоподобных рецепторов в специфическом связывании этих сигнальных молекул и также подтверждает важную роль №+,К+-АТФазьі в процессе передачи ноцицептивного сигнала на активационное воротное устройство Nav1.8 канала. Нами впервые было показано, что приложение оуабаина в низких (эндогенных) концентрациях способно модулировать возбудимость медленных натриевых каналов Nav1.8. Указанный эффект не устранялся при предварительном приложении в наружный раствор блокатора опиоидных рецепторов налтрексона в концентрации 50 мкмоль/л. В данном случае, вероятно, мишенью атакующей молекулы служит дополнительный сайт связывания оуабаина, являющийся частью аминокислотной последовательности молекулы Ыа+,К+-АТФазы. Специфическое связывание гликозидов с этим сайтом модулирует трансдукторную функцию Na+,K+- 10 АТФазы, что должно приводить, в свою очередь, к аналитическому эффекту на системном уровне. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные представляются важными для понимания молекулярных механизмов действия у-пиридонов и сердечных гликозидов на мембрану сенсорных нейронов. Результаты и выводы работы могут быть использованы для чтения учебных курсов по молекулярной биологии и нейробиологии, а также в медицине и фармакологии при создании новых аналитических лекарственных препаратов. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Политехническом симпозиуме "Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона" (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых "Наука и инновации в технических университетах" (Санкт-Петербург, 2007), конференции "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" (Санкт-Петербург - Колтуши, 2007), конференции с международным участием "Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патофизиологических состояний мозга" (Санкт-Петербург -Колтуши, 2008), 2-ой Санкт-Петербургской конференции фонда А. Гумбольдта: "Технологии 21-го века: биологические, физические, информационные и социальные аспекты" (Санкт-Петербург, 2008). Сенсорные нейроны ганглиев дорзальных корешков, связанные с С-волокнами, экспрессируют потенциалозависимые натриевые каналы, нечувствительные к тетродотоксину (Matsuda et al., 1978; Веселовский и др., 1979; Kostyuk et al., 1981; Roy, Narahashi, 1992; Caffrey et al., 1992; Cohen, Barchi, 1993; Elliott, Elliott, 1993; Jeftinija, 1994; Carrier, Ikeda, 1992). Удалось идентифицировать в этих клетках молекулу тетродотоксиннечувствительного натриевого канала (Nav1.8) (рис. 2, 3), состоящую из 1957 аминокислотных остатков (Akopian et al., 1996). Интересно, что именно в той части аминокислотной последовательности канала, которая вовлечена в связывание тетродотоксина, оказался не свойственный быстрым (TTXS) натриевым каналам гидрофильный остаток серина. Было показано, что Nav1.8 экспрессируются только в сенсорных нейронах (Akopian et al., 1996; Sangameswaran et al., 1996), причем в основном в ноцицептивных нейронах (Djouhry et al., 2003). Потенциалозависимые каналы Nav1.8 вероятно играют важную роль в процессах боли, связанной с повреждением тканей (Yamane et al., 2007). Высокая плотность этих каналов, наблюдаемая в афферентах и в теле клетки, предполагает возможное участие Nav1.8 в процессе кодирования ноцицептивных сигналов (Lai et al., 2004). Nav1.8 опосредуют гиперрефлексию и гиперчувствительность, наблюдаемые при воспалении висцеральных структур. Например, гиперрефлексия мочевого пузыря, индуцируемая уксусной кислотой, ослабляется вследствие понижения чувствительности потенциалзависимого канала Nav1.8 (Yoshimura et al., 2001). Заключение о том что, каналы Nav1.8 играют важную роль при гипералгезии и гиперрефлексии было сделано на основании результатов наблюдений увеличенных токов Nav1.8 в сенсорных нейронах: во-первых, иннервирующих желудок вследствие гастрального воспаления (Bielefeldt et al., 2002), во-вторых, иннервирующих тощую кишку/брюшную полость вследствие заражения желодочно-кишечного тракта инфекцией Nippostrongylus brasiliensis (Hillsley et al., 2006) и, в-третьих, иннервирующих повздошную кишку вследствие воспалений, индуцированных тринитробензол сульфоновой кислотой (TNBS) (Stewart et al., 2003). Существует много данных о том что, Nav1.8 играют важную роль в проявлениях гипервозбудимости и боли, вызванных повреждениями соматических структур. Амплитуда токов каналов Nav1.8 оказывается увеличенной в сенсорных нейронах при участии основных провоспаляющих медиаторов, таких как аденозин (Gold et al., 1996), эндотелии (Zhou et al., 2002), фактор роста нервной ткани (Zhang et al., 2002), простагландин F2 (Gold et al., 1996), серотонин (Cardenas et al., 1997; Gold et al., 1996), TNF-a (Jin and Gereau, 2006) и при активации сигнальных путей вторичных мессенджеров - от РСА (Gold et al., 1998 a, b) до р38 МАРК (Jin and Gereau, 2006). Было установлено, что плотность каналов увеличивается при сильной зубной боли (Renton et al., 2005). Посредством блокирования каналов Nav1.8 ослабляется развитие гипералгезии (Joshi et al., 2006; Porreca et al., 1999). Результаты ряда исследований указывают на то, что каналы Nav1.8 участвуют в проявлении нейропатичной боли, например, было показано, что канал сенсибилизирован при диабетической нейропатии (Hirade et al., 1999). Селективный блокатор потенциалзависимых натриевых каналов Nav1.8 может иметь огромный терапевтический потенциал. Основная проблема в поисках специфических блокаторов а субъединицы заключается в существовании значительной гомологии сайтов а субъединиц, наиболее перспективных для взаимодействия с блокатором. Например, пора канала эффективно и селективно блокируется такими макромолекулами как тетродотоксин (ТТХ) и сакситоксин, при этом, как было отмечено выше, только одним аминокислотным остатком в этой области токсин-чувствительные каналы (Navl.l - Nav1.7) отличаются от нечувствительных (Nav1.8 -Nav1.9) (Sivilotti et al., 1997). Иммобилизация сенсора напряжения препятствует открытию каналов, на этом основано действие местных анестетиков, которые, однако, относительно не селективны для каналов в инактивированном или закрытом состояниях (Gold et al., 1998 a, b). Детальный анализ механизмов действия местных анестетиков привел к понятию "блокировки в зависимости от состояния", т.е. сила воздействия блокаторов зависит от состояния канала (НШе, 1977). Блокирующие вещества имеют доступ к сайтам высокой аффинности, когда каналы находятся в открытом или инактивированном состоянии, в других случая они взаимодействуют с сайтами с низким сродством. Таким образом, даже неспецифические блокаторы, в частности лидокаин, могут блокировать каналы, демонстрирующие аберрантную активность, как например, в сердце при аритмиях или в сенсорных нервах при продолжительной боли. Не так давно обнаружили, что соединение А-803467 (Jarvis et al., 2007; рис.4) является в 100 раз более селективным для Nav1.8, чем для других потенциалозависимых натриевых каналов (Jarvis et al., 2007). А-803467 OMe " н ОМе В нашей лаборатории разрабатывается новый фундаментальный механизм модуляции активности медленных натриевых каналов за счет специфического взаимодействия агентов непептидной природы с мембранными рецепторами, связанными с медленными натриевыми каналами, ответственными за генерацию болевого сигнала. Этот механизм позволяет по-новому подойти к созданию нового класса препаратов непептидной природы с аналитическим действием. Исследуемые вещества (Рогачевский и др., 2006) обладают высоким сродством к рецепторам, которые модулируют ноцицептивные ответы медленных натриевых каналов. В случае, когда исследуемая субстанция снижает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов путем взаимодействия с мембранным рецептором, связанным с указанным типом каналов, происходит модуляция импульсного потока с выключением лишь его ноцицептивной компоненты. При этом сам канал связи остается нормально функционирующим и способным передавать сигналы других модальностей. В этом принципиальное отличие разрабатываемого подхода от, например, хорошо известного механизма полной блокады проводящих путей при действии местных анестетиков. Для исследования кинетических характеристик натриевых каналов в работе использовались стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный: NaCl - 65, СаС12 - 2, MgCl2 - 2, Choline СІ - 70, HEPES Na - 10, TTX - 0.0001, pH 7.4. Внутриклеточный: CsF - 100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCb - 2, HEPES Na - 10, pH 7.2. Смещения pH компенсировали с помощью HC1 и CsOH. Исключение ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов (Kostyuk et al., 1975; Elliott and Elliott, 1993). Наличие во внеклеточном растворе тетродотоксина блокировало функционирование быстрых тетродотоксинчувствительных каналов, что делало возможным исследовать ответы только медленных (ТТХГ, Nav1.8) натриевых каналов. Исследуемые вещества вводили в экспериментальную камеру только после образования конфигурации регистрации активности целой клетки ("whole-cell") и стабилизации амплитуды натриевого тока клетки. В работе использовались реактивы фирмы "Sigma", за исключением 5 гидрокси-2-гидроксиметил-у-пиридона (АК1), синтезированного по методу (Heyns and Vogelsang, 1954), и 5-гидрокси-1-метил-у-пиридон-2-карбоновой кислоты АК2, полученной согласно другой методике (Molenda et al., 1994). Субстанции АК1, АК2 в концентрации 1 мкмоль/л, оуабаин в концентрации 1 пмоль/л, 100 пмоль/л, 1 нмоль/л, 10 нмоль/л, 1 мкмоль/л, 200 мкмоль/л, оубагенин, дигоксин в концентрации 100 нмоль/л, также неспецифический блокаторы опиоидных рецепторов налоксон (NLX), налтрексон (NTX) в концентрации 50 мкмоль/л добавлялись в наружный раствор. Объем экспериментальной камеры составлял 200 микролитров. За минуту происходила полная замена наружного раствора благодаря его пассивному протоку под действием силы тяжести. В работе использовали метод локальной фиксации напряжения (patch-clamp) в конфигурации "регистрация активности целой клетки" ("whole-cell") (Hamill et al., 1981). Эксперименты проводили с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего в себя усилитель - ЕРС 7 (patch-clamp L/M-EPC 7), аналого-цифровой преобразователь (АЦП) и цифро-аналоговый преобразователь (ЦАП) (ТОО "центр речевых технологий"), IBM-совместимый персональный компьютер и разработанный в лаборатории физиологии возбудимых мембран пакет программ для автоматизации научных исследований (Крылов и др., 1996). Схема экспериментальной установки показана на рисунке 13. Микроэлектроды изготавливали из мягкого стекла, вытягивали в две стадии, как описано Хэмиллом и др. (Hamill et al., 1981), добиваясь величины сопротивления в 1 - 2 МОм. С помощью пластиковой пипетки в экспериментальную камеру переносили исследуемые нейроны. Создав в заполненном внутриклеточным раствором микроэлектроде небольшое положительное давление (данная манипуляция предотвращает попадание наружного раствора в микроэлектрод), его вводили в экспериментальную камеру, содержащую внеклеточный раствор. С помощью манипулятора микроэлектрод подводили к поверхности клеточной мембраны нейрона, лежащего на дне экспериментальной камеры, и создавали плотный (высокоомный) контакт. Возникновение высокоамплитудных емкостных составляющих ионного тока сразу после прорыва фрагмента мембраны под электродом свидетельствовало о реализации конфигурации "whole-cell". Потенциал внутри пипетки (потенциал покоя) составлял обычно -60 мВ относительно потенциала внеклеточного раствора, равного нулю. После образования плотного "гигаомного" контакта клетку поднимали над дном экспериментальной камеры, что позволяло сменять внеклеточный раствор без ПК Последовательное сопротивление, влияя на точность фиксации трансмембранной разности потенциалов (Е), приводит к ошибкам в определении положения исследуемых характеристик относительно оси Е. Для устранения стационарной ошибки фиксации нами была использована формула АЕ и lNamaxRs- Здесь 1кашах - пиковое (амплитудное) значение натриевых токов. На эту величину сдвигались вправо все зависящие от потенциала функции. Если 1ка шах был не более 1 нА, то этой ошибкой, не превышающей 1 мВ, мы пренебрегали. В ходе каждого эксперимента осуществляли определение значений не только последовательного сопротивления, но и величины емкости мембраны (Ст), вычитание токов утечки (IL) и токов, протекающих через емкость мембраны (1с). Воздействия на объект происходили с помощью ступенек разности потенциалов различной величины и длительности. В ритме эксперимента строилась "пиковая вольт-амперная характеристика", по которой определяли величину "хордовой" проводимости (Gna), а также значение эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов. В эксперименте, который называется "гиперимпульс", производили контроль значений Rs и Ст. При проведении опытов по данной программе генерируются одиночные ступеньки напряжения отрицательной полярности в той области потенциалов, где натриевые токи не активируются, что необходимо для точной регистрации тока утечки и тока, текущего через емкость мембраны. В системе автоматизации реализован следующий алгоритм расчета Rs. По первым трем-пяти точкам фазы спада 1с рассчитывается величина постоянной времени т = Cm Rs. Затем определяется теоретическая величина 1с, исходя из предположения о моноэкспоненциальном процессе спада этого тока (Osipchuk and Timin, 1984). Эти данные вычитаются из экспериментальных значений тока для всех величин ступенек напряжения (Е), подаваемых на мембрану. Во всех экспериментах, как было отмечено выше, величина Rs не превышала 3 МОм. В противном случае опыт прекращался, и данные экспериментов не обрабатывались. Ток утечки рассчитывался как среднее из десяти значений тока в конце тестирующего импульса. Его длительность выбиралась достаточной для того, чтобы исследуемые токи достигали своих установившихся значений. Программа импульсов напряжения для регистрации пиковой вольт-амперной характеристики строится следующим образом. Первый импульс составляет -60 мВ (потенциал покоя). Далее следует ступенька поддерживаемого потенциала (-110 мВ). Затем подаются ступеньки напряжения положительной полярности от -60 мВ до 55 мВ, с шагом 5 мВ. Входящий. натриевый ток развивается в ответ на тестирующий импульс длительностью 50 мсек. По максимальным (пиковым) значениям каждого из токов данного семейства строили пиковую вольт-амперную характеристику. Потенциалы реверсии токов (Ег) определяли как точку пересечения правой ветви вольт-амперной характеристики с осью потенциалов. Действие оуабаина с наружной стороны мембраны приводило к изменению ряда характеристик медленных натриевых каналов (рис. 20, а, б). Для исследования влияния оуабаина на медленные натриевые каналы нами детально рассмотрены характеристики их воротных устройств. Пиковые вольт-амперные характеристики были построены обычным способом. После приложения оуабаина в концентрации 1 нмоль/л становится явным изменение крутизны левой (спадающей) ветви (рис. 21). Эффект изменения крутизны становится более наглядным при построении потенциалозависимости "хордовой" проводимости (рис. 22). Функция GNa(E) имеет начальный S-образный участок, крутизна которого отражает особенности потенциалочувствительности активационного воротного процесса. Крутизна функции GNa(E), как это было уже отмечено выше, определяется величиной 5 мс Тестирующий потенциал изменялся от -30 до 50 мВ с шагом 10 мВ. Во всех записях поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 500 мс, был равен -ПО мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом. Б,мВ. Зависимости построены по данным контрольного эксперимента и после приложения 1 нмоль/л оуабаина. Стрелка указывает на изменение начального нелинейного участка, определяющего предельное пороговое изменение потенциалочувствительности медленных натриевых каналов. Функция JNa(E) была нормирована, т. е. строилась GNa(E)norm = GN3(E)/ GNamax(E), где СгыаШах(Е) - ее максимальное значение. Показаны данные контрольного эксперимента и результаты, полученные после приложения 1 нмоль/л оуабаина. эффективного воротного заряда (Zeff), переносимого его активационной воротной системой при открывании канала. Средние значения изменения эффективного заряда во всей совокупности экспериментов после приложения оуабаина в концентрации 1 нмоль/л представлены на рисунке 24. Величина среднего значения эффективного заряда снижалась с контрольного значения Zeff =6.7 ± 0.4 (п=15) до 4.8 ± 0.5 (п=15) после добавления оуабаина. Детальное исследование эффектов низких концентраций оуабаина показало, что влияние этого гликозида на эффективный заряд и, как следствие, на трансдукторную функцию Ыа+,К+-АТФазы носит монотонный дозозависимый характер от 1 пмоль/л до 1000 нмоль/л (рис. 25). Дальнейшее повышение концентрации исследуемого агента приводит к его воздействию на насосную функцию Na+,K+-AT E a3bi, опосредованному другим механизмом. Контрольное значение Zeff= 6.7 ± 0.4 (п=15). После приложения оуабаина в концентрации 1 нмоль/л величина Zeff составила = 4.8 ± 0.5 (п=15), после приложения оуабагенина в концентрации 100 нмоль/л Zeff =4.8±0.3 (п=10). - значения статистически достоверны. Экспоненциальная функция, представленная в логарифмическом масштабе (ось ординат), позволяет определить величину Zeff по тангенсу угла наклона асимптот, проведенных к начальным участкам этих функций в контрольном опыте, после приложения налтрексона в концентрации 50 мкмоль/л, а также после сочетанного приложения оуабаина в концентрации 1 нмоль/л и налтрексона. В ответ на приложение 100 нмоль/л оуабагенина с наружной стороны мембраны изменялась амплитуда медленного натриевого тока (рис. 27, а). Помимо этого происходило, как и при воздействии оуабаина, изменениекрутизны левой ветви пиковой вольт-амперной характеристики. Изменение крутизны вольт-амперной характеристики, как и в предыдущем случае, связано со снижением величины эффективного заряда, переносимого активационной воротной системой при открывании каналов. На рисунке 27, б представлено изменение ее потенциалочувствительности, определяемое количественно изменением значения ZCff. В рассматриваемом случае эффективный заряд уменьшился с контрольного значения 6.9 до 4.2. Средние значения изменения эффективного заряда во всей совокупности экспериментов после приложения оуабагенина в концентрации 100 нмоль/л представлены на рисунке 24. Величина среднего значения эффективного заряда снижалась с контрольного значения ZCff =6.7 ± 0.4 (п=15) до 4.8 ± 0.3 (п=10) после добавления оуабагенина. Во второй части работы были исследованы два сердечных гликозида: оуабаин, дигоксин и кардиотонический стероид оуабагенин. Как и в предыдущем случае важно проанализировать влияние химической структуры выбранных для эксперимента субстанций на их способность модулирования возбудимости медленных натриевых каналов. При помощи высокочувствительного метода локальной фиксации потенциала нами впервые обнаружено, что оуабаин снижает эффективный заряд активационного воротного устройства натриевых каналов Nav1.8 в концентрации 1 нмоль/л, что свидетельствует о высокой избирательности воздействия гликозида. Действие оуабагенина оказалось менее специфичным. Тот факт, что обнаруженный эффект исследуемых веществ не устраняется предварительным действием неспецифического блокатора опиоидных рецепторов налтрексона исключает возможное участие в передаче сигнала опиоидных рецепторов, т.е. тот механизм, который был рассмотрен в предыдущей части работы по отношению к производным у-пиридона. Как мы уже отмечали выше, хорошо известна гипотеза "модулированного рецептора" (Strichartz, 1973; Hille, 1977; Можаева и др., 1980), согласно которой биологически активное вещество взаимодействует непосредственно с рецептором, представляющим собой часть аминокислотной последовательности ионного канала. Полученные результаты указывают на то, что именно по такому механизму оуабаин и оуабагенин модулируют трансдукторную функцию Ыа+,К+-АТФазы. В данном случае "модулированным" рецептором, с которым взаимодействуют указанные. субстанции, являются аминокислотные последовательности, формирующие рецепторный сайт Ма+,К+-АТФазы, отвечающий за трансдукторную функцию фермента. В наших экспериментах зарегистрирована очень высокая чувствительность активационного воротного устройства медленных натриевых каналов к оуабаину. Величина Ко при построении дозозависимости этого процесса составила 3 нмоль/л. Очевидно, что изменение возбудимости этих каналов приводит к снижению. частоты разрядов мембраны исследуемого сенсорного нейрона в физиологически адекватных условиях (Карымова и др., 2008). Эта величина близка к полученной ранее методом органотипического культивирования нервной ткани величине KD равной 1 нмоль/ л (Пеннияйнен и др, 2003; рис. 33 а, б). Можно предположить, что рассматриваемый молекулярный механизм действия очень низких концентраций оуабаина на мембрану сенсорного нейрона является пока единственным объяснением физиологических эффектов эндогенного оуабаина (его концентрация в крови человека составляет 0.5 нмоль/л). Модуляция, с помощью таких концентраций оуабаина, мембранного потенциала покоя за счет воздействия на насосную функцию №+,К+-АТФазы представляется маловероятной. Действительно, пороговая величина оуабаин зависимого тока мембраны сенсорных "нейронов, зарегистрированная с помощью метода локальной фиксации напряжения (Hamada et al., 2003), не может превышать 10 пА при концентрации оуабаина 0.1 мкмоль/л. Тогда, поскольку входное сопротивление (оно определяется обратной проводимостью каналов тока утечки) исследованного нами сенсорного нейрона составляет в среднем 5 нОм, то оуабаин-зависимое изменение мембранного потенциала в этом случае не может превышать 2 мВ. Очевидно, что уменьшение на почти два порядка концентрации оуабаина должно привести к пропорциональному (Hamada et al., 2003) снижению оуабаин-зависимого тока и, следовательно, к такому изменению мембранного потенциала, которое будет соответствовать уровню шума. Это означает, что очень низкие (наномолярные) концентрации оуабаина не должны приводить к изменению частоты повторных ответов мембраны сенсорного нейрона в физиологически адекватных условиях. Из полученных результатов очевидно, что особенности химического строения молекул исследованных веществ безусловно определяют их способность модулирования возбудимости медленных натриевых каналов. Эксперименты, проведенные при помощи метода органотипической культуры ткани (Пеннияйнен и др, 2003; Лопатина и др., 2008; рис. 33) и результаты квантово-химических расчетов (Рогачевский и др., 2008) свидетельствуют о способности молекул оуабаина и оуабагенина активировать трансдукторный сайт связывания Na+, К+-АТФазы в виде хелатного комплекса с ионами кальция. Было показано (Пеннияйнен и др, 2003), что селективный ингибитор Na , К+-АТФазы оуабаин в концентрации 10 нмоль/л практически полностью угнетал рост как нейритов сенсорных ганглиев, так и эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов. При культивировании сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей ЭГТА (1ммоль/л) и оуабаин (10 нмоль/л), наблюдали почти полное снятие ингибирующего действия оуабаина (Лопатина и др., 2008; рис. 33 а, в). Поскольку удаление свободных ионов Са из питательной среды с помощью ЭГТА устраняло влияние оуабаина на рост эксплантатов исследуемых тканей, можно предположить, что оуабаин взаимодействует с трансдукторным сайтом связывания Na+, К+-АТФазы не в форме свободной молекулы, а в форме хелатного комплекса с Са2+. Данные систематического анализа поверхности потенциальной энергии системы оуабаин-Са позволили выявить возможные конформации хелатных комплексов. Проведенные квантово-химические расчеты указывают на существование двух принципиально различных способов хелатирования иона Са молекулой оуабаина (Рогачевский и др., 2008). Согласно разрабатываемой нами гипотезе, свободная молекула оуабаина ответственна за модуляцию насосной функции Na , К+-АТФазы, тогда как модулятором трансдукторной функции является хелатный комплекс оуабаин Са . Анализ квантовохимических расчетов (Рогачевский и др., 2008) показал, что свободная молекула оуабаина и ее кальциевый комплекс обладают значительным структурным сходством, поэтому логично предположить, что трансдукторный и насосный сайты связывания обладают существенной общностью структурных элементов. Различия в проявляемом физиологическом эффекте и действующих концентрациях оуабаина определяются различной аффинностью указанного агента к соответствующим сайтам связывания, которая, в свою очередь, зависит от физико-химической природы взаимодействий, лежащих в основе формирования лиганд-рецепторного комплекса. Согласно современным моделям связывания сердечных гликозидов с Na+, К+-АТФазой, основной вклад в энергетику образования комплекса оуабаина с данным ферментом вносит большое число слабых ван-дер Ваальсовых взаимодействий между гликозидом и Na+, К+-АТФазой и, в несколько меньшей степени, формирование межмолекулярных водородных связей (Handschuh et al., 2000; Melero et al., 2000). Подчеркнем, что в данном случае речь идет о связывании оуабаина с рецепторным сайтом, ответственным за модулирование насосной функции фермента.Потенциалозависимьіе натриевые каналы Navl .8
Экспериментальные растворы
Исследование влияния сердечных гликозидов на медленные натриевые каналы
Механизмы действия сердечных гликозидов
Похожие диссертации на Механизмы модулирования медленных натриевых каналов (Nav1.8) сердечными гликозидами и производными гамма-пиридонов
