Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Цитокины: определение и классификация 12
1.2. Рецепторы цитокинов и трансдукция сигнала 13
1.3. Молекулы семейства ИЛ-1 14
1.3.1. Члены семейства ИЛ-1 и их свойства 14
1.3.2. Регуляция ИЛ-1 16
1.3.3. Функции ИЛ-1 17
1.4. Физиологические функции цитокинов в ЦНС 18
1.5. Регуляция цитокинов в ЦНС 22
1.6. Цитокины при патологии нервной системы 25
1.6.1. Цитокины при бактериальной инфекции ЦНС 26
1.6.2. Цитокины при вирусных инфекциях ЦНС 27
1.6.3. Цитокины при травматических и опухолевых повреждениях структур ЦНС 30
1.6.4. Цитокины при неиродегенеративных и аутоиммунных заболеваниях 32
1.7. Методические подходы для исследования экспрессии цитокинов 36
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Экспериментальные животные 39
2.2. Культуры клеток 39
2.3. Вирус 39
2.4. Имплантация мозговых канюль 40
2.5. Стимуляция электрическим током 40
2.6. Обработка клеток ИЛ-1 и ростовыми факторами 41
2.7. Получение отдельных участков мозга 42
2.8. Выделение тотальной РНК 42
2.9. Анализ содержания специфических РНК 43
2.9.1. Синтез радиоактивных зондов 45
2.9.2. Определение радиоактивности РНК-зонда 47
2.9.3. Гибридизация 47
2.9.4. Защита от РНКазы 48
2.9.5. Электрофорез в полиакриламидном геле 49
2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 49
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 51
3.1. Исследование синтеза мРНК цитокинов, их рецепторов, неиропептида Y. и проопиомеланокортина при вирусном энцефалите 51
3.1.1. Уровни экспрессии мРНК цитокинов в различных отделах мозга новорожденных животных, инфицированных вирусом болезни Борна 53
3.1.2. Анализ экспрессии мРНК компонентов рецепторного аппарата цитокинов при вирусном энцефалите 57
3.1.3. Исследование синтеза мРНК неиропептида Y и проопиомеланокортина 62
3.1.4. Корреляционный анализ различных параметров в контрольных и экспериментальных группах животных 64
3.2. Исследование экспрессии мРНК цитокинов, их рецепторов и компонентов нейроэндокринной системы в модели височной эпилепсии 67
3.2.1. Исследование экспрессии мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в модели височной эпилепсии: 68
3.2.2. Изучение синтеза мРНК рецепторов цитокинов в модели электрического "киндлинга" 71
3.2.3. Анализ роли неиропептида Yu проопиомеланокортина в модели височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины 74
3.2.4. Исследование влияния ИЛ-1(3 и ростовых факторов на синтез мРНК ФНО-а глиальными клетками 76
3.3. Изучение влияния хронического повышения концентрации ИЛ-10 в третьем мозговом желудочке на экспрессию мРНК цитокинов, их рецепторов, нейропептида Y и проопиомеланокортина в разных отделах мозга 78
3.3.1. Изучение экспрессии мРНК цитокинов у животных разного возраста в ответ на внутрижелудочковое введение ИЛ-1(3. 79
3.3.2. Исследование синтеза мРНК рецепторов цитокинов при внутри желудочковом введении ИЛ-1/3 животным разного возраста 82
3.3.3. Исследование экспрессии мРНК нейропептида Yu проопиомеланокортина при внутрижелудочковом введении рекомбинантного ИЛ-lfi.. 86
4. ОБСУЖДЕНИЕ 88
4.1. Экспрессия мРНК цитокинов, компонентов их рецепторного аппарата, нейропептида Y и ПОМК в модели вирусного энцефалита 88
4.2.Изменений синтеза мРНК цитокинов, их рецепторов и компонентов нейроэндокринной системы в модели височной эпилепсии 90
4.3. Изменение уровней мРНК цитокинов, их рецепторов, НП Y и ПОМК при хроническом внутри желудочковом введении ИЛ-ір 93
4.4. Роль цитокинов, их рецепторов, нейропептида Y и ПОМК при нейропатофизиологиях различной этиологии 95
ВЫВОДЫ 102
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103
- Цитокины: определение и классификация
- Экспериментальные животные
- Исследование синтеза мРНК цитокинов, их рецепторов, неиропептида Y. и проопиомеланокортина при вирусном энцефалите
- Экспрессия мРНК цитокинов, компонентов их рецепторного аппарата, нейропептида Y и ПОМК в модели вирусного энцефалита
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокины играют ведущую роль в реализации взаимодействий двух интегративных систем организма: нервной и иммунной. Уровень цитокинов в мозге возрастает не только при патофизиологических процессах, таких как центральное и периферическое введение бактериальных эндотоксинов [77], ишемические повреждения мозга [106], конвульсивные припадки [227] или развитие опухолевых новообразований [104], но и при физиологических состояниях, например при стрессе, вызванном ротацией [9] или иммобилизацией [154]. Повышение концентрации цитокинов сопровождается изменением уровня катехоламинов и глюкокортикоидов, то есть приводит к активации нейроэндокринной системы [13]. В зависимости от природы конкретного патофизиологического состояния цитокины могут не только способствовать развитию нейровоспалительных заболеваний, но также участвовать в восстановительных процессах при повреждении различных структур мозга [175].
Одной из наиболее адекватных моделей исследования роли цитокинов во взаимодействии нервной и иммунной систем является экспериментальный стресс [5]. В качестве экспериментальных воздействий, вызывающих стрессовую реакцию, могут быть рассмотрены вирусные и бактериальные инфекции ЦНС, электростимуляции структур головного мозга, центральное введение иммуномодулирующих препаратов. Модели интракраниального введения вируса болезни Борна новорожденным животным и височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины, позволяют оценить локальную продукцию цитокинов в различных структурах мозга в отсутствии воспалительных инфильтратов [31] и значительных повреждений структур ЦНС [226]. Следовательно, данные модели позволяют определить характер транскрипционных изменений в различных отделах мозга в ответ на сами экспериментальные воздействия, а не на их последствия. Кроме того, механизмы, лежащие в основе эпилептических припадков, конвульсий, вызванных превышением терапевтических доз цитокинов, и приступов
7 лихорадки, сопровождающих некоторые вирусные и бактериальные инфекции ЦНС, также имеют некоторое сходство [172], [117], [138]. В связи с этим нельзя исключать существование взаимосвязи между рядом инфекций и некоторыми хроническими типами эпилептической энцефалопатии.
Одну из ключевых ролей в мобилизации защитных реакций при повреждающих воздействиях различной природы играют члены семейства ИЛ-1: две изоформы ИЛ- 1а и ИЛ-1/3, которые являются функциональными агонистами, а также рецепторный антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1ра) [10]. ИЛ-1 обладает не только разносторонними периферическими эффектами в отношении механизмов врождённого и приобретённого иммунитета [2], но и центральным действием как один из важнейших медиаторов нейро-иммунных взаимодействий [169].
Поскольку различные воздействия отражаются не только на продукции ИЛ-1/3 [175], для получения полного представления о цитокиновом профиле того или иного патофизиологического процесса целесообразно также проводить анализ экспрессии мРНК ИЛ-1ра, компонентов рецепторного аппарата ИЛ-1 и других цитокинов, фактора некроза опухоли-а (ФНО-а), трансформирующего ростового фактора-/31 (ТРФ-/31), нейропептида Y (НП Y) и проопиомеланокортина (ПОМК). Одновременное исследование различных компонентов системы ИЛ-1/3, а именно лиганда, сигнального рецептора и его аксессорных белков, а также эндогенного ингибитора предоставит информацию о вкладе каждого компонента в систему регуляции биологической активности ИЛ-1/3. Анализ экспрессии мРНК провоспалительного цитокина ФНО-а и противовоспалительного ТРФ-/31, а также компонентов рецепторного аппарата других цитокинов позволит получить информацию о регуляции межцитокиновых взаимодействий по принципу позитивной или негативной обратной связи. Более того, поскольку при различных патофизиологических состояниях имеют место взаимодействия цитокинов с эндогенными опиоидами и с НП Y [169], также целесообразно исследовать изменения синтеза мРНК ПОМК и НП Y. В связи
8 с этим для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе тех или иных нейроиммунных процессов, необходимо комплексное исследование экспрессии мРНК цитокинов, компонентов их рецепторного аппарата и факторов ГГНС при нейропатологиях различной этиологии.
Цель исследования заключалась в изучении экспрессии цитокинов, их рецепторов и регуляторных факторов в структурах головного мозга при различных патофизиологических состояниях.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать изменения экспрессии мРНК цитокинов, проопиомеланокоргина и нейропептида Y в ЦНС неонатально заражённых вирусом болезни Борна крыс.
Проанализировать синтез мРНК компонентов рецепторного аппарата цитокинов при интракраниальном заражении новорожденных животных: вирусом болезни Борна.
Оценить экспрессию мРНК цитокинов, их рецепторов и регуляторных факторов при височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины.
Исследовать экспрессию мРНК цитокинов, компонентов их рецепторного аппарата и факторов нейроэндокринной системы при хроническом внутрижелудочковом введении ИЛ-ір животным разного возраста.
Научная новизна работы. Впервые на примере неонатального внутричерепного заражения животных вирусом болезни Борна было показано увеличение экспрессии мРНК ИЛ-1/3, ИЛ-1ра, ФНО-а, ТРФ-01 и компонентов рецепторного аппарата цитокинов в различных отделах мозга в отсутствии значительных воспалительных инфильтратов и нейрональных повреждений в структурах ЦНС, что свидетельствует об участии целого спектра цитокинов с про- и противовоспалительными свойствами в нейропатофизиологических изменениях, происходящих при данном
9 заболевании. Впервые показана зависимость экспрессии мРНК цитокинов и нейропептидов в различных отделах мозга от стадии развития животного.
Получены новые данные, демонстрирующие избирательную модуляцию синтеза мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в кортикальных зонах и лимбических структурах мозга при височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины. Впервые показано отсутствие сигнала, соответствующего мРНК противовоспалительного ИЛ-1ра, что свидетельствует о зависимости цитокинового профиля от природы подлежащего патофизиологического процесса. Впервые в модели электрического "киндлинга", вызывающего минимальные нейрональные потери, но повышающего риск возникновения глиозов, показано изменение синтеза мРНК мембрано-связанной формы аксессорного белка рецептора ИЛ-1 первого типа, что говорит о модуляции биологической активности ИЛ-1/3 на уровне рецепторного аппарата в различных отделах мозга. Впервые показано синергетическое действие ИЛ-ір и ростовых факторов на уровень синтеза мРНК ФНО-а клетками крысиной глиомы.
Получены новые данные, демонстрирующие одновременную модуляцию системы про- и противовоспалительных цитокинов в разных отделах мозга в нормальном и стимулированном ИЛ-1)8 состоянии у старых и молодых животных. Впервые показано снижение конститутивного уровня мРНК проопиомеланокортина в старости, что приводит к снижению эффективности компенсаторных механизмв и на фоне высокой продукции цитокинов повышает риск возникновения нейровоспалительных и нейротоксических симптомов.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования экспериментальные данные расширяют и дополняют представление о роли про- и противовоспалительных цитокинов в регуляции различных патофизиологических процессов, затрагивающих структуры центральной нервной системы. Результаты проведённых экспериментов
10 свидетельствуют о зависимости функциональной активности цитокинов от природы подлежащего патофизиологического процесса, что даёт новые представления о биологии данных иммуномедиаторов. Использование моделей внутричерепного заражения новорожденных животных вирусом болезни Борна, височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины, и центрального введения рекомбинантного ИЛ-1/3 животным разного возраста позволяет по-новому взглянуть на механизмы, лежащие в основе таких нейродегенеративных заболеваний, как аутизм, эпилепсия, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Полученные данные могут лечь в основу новых подходов для; диагностики и прогнозирования течения различных форм эпилепсии и вирусных энцефалитов. Также результаты данного исследования могут быть использованы в преподавании различных медицинских и медико-биологических дисциплин.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Вирусный энцефалит, вызванный заражением новорожденных животных вирусом болезни Борна, без образования значительных воспалительных инфильтратов вызывает увеличение синтеза мРНК про- и противовоспалительных цитокинов и нейропептида Y в различных отделах мозга, но снижает экспрессию мРНК проопиомеланокортина в гипоталамусе.
Неонатальное внутричерепное заражение животных вирусом болезни Борна изменяет функциональную активность цитокинов, модулируя экспрессию мРНК компонентов их рецепторного аппарата.
Височная эпилепсия, индуцированная электростимуляцией миндалины, несмотря на отсутствие значительных нейрональных повреждений, стимулирует синтез мРНК про- и противовоспалительных цитокинов и всех компонентов рецепторного аппарата ИЛ-1/3, а также нейропептида Y в различных областях коры и лимбических структурах мозга, но не оказывает влияния на уровень экспрессии проопиомеланокортина.
4. Снижение активности компенсаторных механизмов при старении не отражается на способности животных развивать лихорадочную реакцию в ответ на центральное введение рекомбинантного ИЛ-ір.
Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, были представлены на XIII Российской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, Россия, 1997), на 4-й международной конференции "Нейропротективные агенты: клинические и экспериментальные аспекты" (Аннаполис, Мэрилэнд, США, 1998) и 29-й ежегодной конференции общества нейробиологов США ( Майами Бич, Флорида, США, 1999).
Диссертационная работа была апробирована на заседания совместной научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН и кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета 20 мая 2003 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов, трёх глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и одну таблицу. Список литературы включает 245 источников.
Цитокины: определение и классификация
Цитокины - это индуцибельные молекулы преимущественно полипептидной природы, имеющие специфические рецепторы на различных клетках. Они играют ключевую роль в передаче сигнала между отдельными клетками и могут действовать аутокринно, паракринно, как эндокринные сигналы, а также как хематтрактанты [10]. К цитокинам относятся интерлейкины, хемокины, интерфероны, факторы некроза опухолей, колоние-стимулирующие факторы и другие ростовые факторы [2]. На основе структурных и функциональных особенностей цитокины подразделяют на отдельные семейства.
Основными продуцентами цитокинов являются моноциты, макрофаги, дендритные клетки и другие клетки гемопоэтического происхождения, отвечающие за врождённый иммунитет [12]. В качестве основного критерия участия цитокина в развитии защитной реакции рассматривается: его продукция и уровень в крови [9]. Именно цитокины запускают воспалительный процесс, стимулируют гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему (ГГНС), вызывают лихорадочную реакцию и медленно-волновой сон [4] и активируют иммунокомпетентные клетки, обеспечивающие защитные реакции организма [46]. Нейроэндокринная система регулирует продукцию цитокинов повышая уровень глюкокортикоидов корой надпочечников, структурами парасимпатической нервной системы, иннервирующими тимус и селезёнку, а также на местном уровне - в очагах воспаления, где периферийные цитокины активируют ЦНС [208].
В зависимости от выполняемых функций цитокины делят на про- и противовоспалительные, а их соотношение играет важную роль в развитии иммунного ответа. Например, ИЛ-4, ИЛ-10, трансформирующий ростовой фактор-бета 1 (ТРФ-01) и рецепторный антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1ра), хотя и не обладают собственной ярко-выраженной активностью, способны смягчать или блокировать неврологические нарушения, вызванные воспалением или действием провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1/3 и фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а) [219].
Большинство исследований роли цитокинов при той или иной патологии сводится к измерению концентрации цитокинов в крови или спинно-мозговой жидкости. Определение уровней зрелых цитокинов в структурах ЦНС по ряду причин затруднено, поэтому достаточно полную информацию об изменении цитокинового профиля при различных нейропатофизиологических процессах может дать анализ уровней мРНК цитокинов и компонентов их рецепторного аппарата.
Экспериментальные животные
Для исследования уровней синтеза мРНК цитокинов и их рецепторов при вирусном энцефалите, вызванном вирусом болезни Борна, использовали крыс линии Lewis (Charles River Laboratories, США) не старше 24 ч после рождения. В экспериментах по изучению экспрессии мРНК цитокинов и их рецепторов в модели височной эпилепсии, вызванной электростимуляцией миндалины, использовали самцов крыс линии Long-Evans (Charles River Laboratories, Канада) массой 300-350 г; Исследование влияния хронического внутрижелудочкового введения ИЛ-1/3 на экспрессию мРНК цитокинов и их рецепторов проводили на крысах той же линии 3-5 или 24-26 мес. возраста. Животных содержали в стандартных полипропиленовых клетках на сухом корме для крыс (Labdiet, РМІ Feeds, США). Температура окружающей среды поддерживалась в пределах 21±2С, а искусственное освещение с 7 ч утра до 7 ч вечера.
Исследование влияния ИЛ-ір, фактора роста нервных клеток и эпидермального ростового фактора, а также их комбинаций на уровень синтеза ФНО-а проводили на культуре клеток крысиной глиомы С6 (АТСС CCL-107). Клетки культивировали в чашках Петри диаметром 60 мм (Corning, США) на среде DMEM/F12 (Life Technologies, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Sigma, США), 2 мМ L-глутамином при 37С и 5% С02. Клетки пересевали два раза в неделю, снимая их с пластика раствором 0,25% трипсина с 0,03% EDTA.
Для исследования синтеза мРНК цитокинов и их рецепторов в центральной нервной системе при вирусном энцефалите новорожденным животным интракраниально в физиологическом растворе вводили 104 ТСЮ5о штамма CRP3 вируса болезни Борна. Крысы контрольной группы (14 особей) получали эквивалентное количество физиологического раствора без вируса. Животных декапитировали на 7-й (5 крыс) и 28-й (7 крыс) дни после заражения.
Заражение животных вирусом болезни Борна проводили в рамках сотрудничества с лабораторией детских респираторных вирусных инфекций Центра по биологической оценке и исследованию вакцин FDA (Food and Drag Administration) г.Роквилла (США).
Исследование синтеза мРНК цитокинов, их рецепторов, неиропептида Y. и проопиомеланокортина при вирусном энцефалите
Для исследования экспрессии мРНК цитокинов, их рецепторов, ПОМК и НП Y при вирусном энцефалите была выбрана модель неонатального внутричерепного заражения вирусом болезни Борна. Данная модель характеризуется широким спектром неврологических нарушений без видимых воспалительных процессов, а также позволяет исследовать молекулярные механизмы некоторых нейродегенеративных расстройств, например аутизма. Анализ экспрессии мРНК цитокинов, их рецепторов, НП Y и ПОМК проводили на 7-й и 28-й дни после инфицирования. В каждой экспериментальной группе было 6 животных, а в качестве контроля на каждом сроке детекции брали 7 крыс, получивших интракраниально физиологический раствор. Роль внутреннего контроля играл циклофиллин, конститутивный белок, синтез которого остаётся неизменным при различных экспериментальных воздействиях. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.
Экспрессия мРНК цитокинов, компонентов их рецепторного аппарата, нейропептида Y и ПОМК в модели вирусного энцефалита
Результаты, представленные в разделе 3.1, свидетельствуют о том, что при вирусном энцефалите в различных отделах мозга возрастает синтез мРНК провоспалительных цитокинов ИЛ-1/3 и ФНО-а на фоне повышенной экспрессии мРНК цитокинов с противовоспалительными свойствами: ИЛ-1ра и ТРФ-/31. Известно, что интракраниальное введение вируса болезни Борна сразу после рождения приводит к возникновению персистирующей вирусной инфекции без классических симптомов данного заболевания и значительных воспалительных инфильтратов [42]. Другими авторами было показано, что потенциальными индукторами нарушений морфологии, поведения» и физиологических отклонений у инфицированных в неонатальном периоде вирусом болезни Борна крыс являются ИЛ-1р и ФНО-а [31]. Также эти цитокины вызывают нарушения в процессах обучения и моторной активности, снижение аппетита и веса, изменения вкусовых предпочтений [32]. Полученные нами данные согласуются с опубликованными ранее, где было показано участие ИЛ-1/5 и ФНО-а в клинических проявлениях энцефалита, вызванного вирусом болезни Борна у взрослых животных [146], а также продемонстрирована способность ТРФ-31 ослаблять неврологические проявления при данном заболевании [209]. Следовательно, повышение уровня цитокинов в ЦНС вирус-инфицированных животных может происходить как за счёт непосредственного воздействия вируса, так и благодаря системе обратной связи различных цитокинов.
Характер изменения синтеза мРНК ИЛ-1/3, ФНО-а, ИЛ-lpa и ТРФ-/31 при вирусном энцефалите, вызванном вирусом болезни Борна, может объясняться уровнем стимуляции экспрессии мРНК цитокинов в мозжечке, в котором наблюдается максимальная вирусная нагрузка. Не исключено также, что при заражении новорожденных животных вирусом болезни Борна действие цитокинов приводит к запуску и/или способствует прогрессу нейропатологии и неврологического дефицита, наблюдаемых при данном заболевании.
Параллельно с ростом экспрессии цитокинов также изменяется синтез мРНК компонентов их рецепторного аппарата: возрастает экспрессия мРНК ИЛ-IP первого типа, аксессорных белков этого рецептора и gpl30. В нейропатогенезе данного заболевания также участвуют нейропептид Y, синтез мРНК которого изменяется в большинстве изученных отделов мозга, и проопиомеланокортин, мРНК которого выявляется в гипоталамусе, где его экспрессия достоверно снижается через 28 дней после интракраниального заражения животных вирусом.
По мнению ряда авторов увеличение уровня мРНК нейропептида Y в мозге неонатально инфицированных крыс, вероятно, связано с развитием вирус-ассоциированных неврологических дисфункций [134]. Кроме того, нейропептид Y участвует в регуляции со стороны ЦНС метаболических, эндокринных, иммунологических, сердечно-сосудистых процессов и некоторых когнитивных функций. Параллельно с изменением экспрессии НП Y в гипоталамусе вирус инфицированных крыс уменьшается уровень синтеза мРНК проопиомеланокортина - предшественника различных опиоидов, экспрессия которых зависит от питания и стрессового состояния [190]. Таким образом, снижение уровня синтеза его мРНК может приводить к изменениям в потреблении пищи и весе тела, иммунологическим и стрессовым реакциям, вызванным вирусной инфекцией. В результате хронического повышения синтеза мРНК цитокинов и компонентов неироэндокриннои системы возникают диффузные глиозы, существенные повреждения и даже атрофия мозга у неонатально инфицированных крыс. Таким образом цитокины, их рецепторы и компоненты неироэндокриннои системы вовлечены в нейропатогенез у новорожденных животных, инфицированных вирусом болезни Борна.
