Содержание к диссертации
Введение
Глава I . Изучение морфологических аспектов плодоОбразования Agaricus bisporus . 9
Глава II . Изучение механизма шіодообразования Agaricus bisporus. Обзор литературы . 56
Глава III. Роль различных компонентов газовой фазы и окислителей в плодообразовании Agaricus bisporus . 96
Глава ІV. Микроорганизмы, связанные с плодообразованием Agaricus bisporus . 145
Заключение. 228
Выводы. 233
Литература.
- . Изучение морфологических аспектов плодоОбразования Agaricus bisporus
- . Изучение механизма шіодообразования Agaricus bisporus. Обзор литературы
- Роль различных компонентов газовой фазы и окислителей в плодообразовании Agaricus bisporus
- Микроорганизмы, связанные с плодообразованием Agaricus bisporus
Введение к работе
Разведением грибов люди начали заниматься, по-видимому, еще в античные времена (Промышленное культивирование съедобных грибов, 1978). Шампиньоны находятся в культуре уже более четырех веков, первое упоминание о них в письменных источников датировано 1550 годом. И хотя в наше время в культуру введены уже десятки видов съедобных грибов, шампиньон по-прежнему сохраняет среди них лидирующее положение (Гарибова, 1971; Рорре, 1979). Приведем несколько цифр. К началу 80-х годов мировой урожай шампиньонов достиг 650 000 тонн (belley, 1982). За период с 1969 по 1979 г. продукция культивируемого шампиньона только в США выросла в стоимостном выражении в 5 раз и достигла 368.547 миллионов долларов. В этой стране шампиньоны производят на сумму, превышающую все овощи, кроме салата и томатов (Farr, 1983 ). В нашей стране годовой урожай составляет около 2 000 тонн и уже к концу пятилетки значительно возрастет в связи с вводом в эксплуатацию новых мощностей по производству грибов. Поэтому изучение культуры шампиньонов представляет большую народнохозяйственную важность. ХХУІ съездом КПСС (1981) и Продовольственной программой СССР (1982) поставлены задачи расширения ассортимента, увеличения выработки наиболее ценных продуктов, существенного улучшения структуры питания советских людей. Шампиньоны относятся к числу таких продуктов. По содержанию белка они превосходят почти все овощи, при этом они намного богаче по незаменимым аминокислотам. Особого внимания заслуживает содержание в шампиньонах витаминов Bj, В2» В , Bjg, Д, Д, РР и других, которые не содержатся в овощах или содержатся в малых количествах. Грибы богаче витаминами группы В, чем любые продукты питания, кроме мяса. По своей питательной ценности они занимают промежуточное положение между мясом и овощами (Горленко, 1983; Randoin, Billaud, 1956; Delmas, 1973 b,c, 1974; Edwards, 1975,1976; Geissler et al., 1976; Hayes, Hand, 1981; Lelley,1974, 1982).
Одной из причин растущей популярности шампиньонов в последние годы служит их сравнительно низкая калорийность. В 100 г свежих грибов содержится всего 20 калорий. Поэтому шампиньоны широко пропагандируют как пищу для работников умственного труда, ведущих малоподвижный образ жизни, для тех, кому приходится следить за своим весом ( Stanton, 1984). В шампиньонах мало классических Сахаров, поэтому их потребление очень желательно для диабетиков и, как утверждают, в некоторых случаях может служить эффективным медикаментом. Кроме того, у этих грибов, по некоторым данным, существует довольно сильное антиаллергическое действие ( Delmas,1973а).
Шампиньоны - не только ценный диетический продукт. Они помогают решать и такую острую проблему, как удаление отходов. Традиционно их выращивают на отходах сельского хозяйства, однако, в последнее десятилетие проведены успешные опыты по утилизации промышленных и городского мусора, сточных вод ( Grabbe,. Domsch,1974; Dawson, 1979; Ross, Haris,1983).При этом производство грибов при правильной организации не имеет отходов (Till, 1962).
Обычно урожаи шампиньонов составляют 5 - 10 кгДг, а в лучших хозяйствах, таких, как совхоз "Московский", - 20 кгЛг и более. При этом в шампиньонницах обычно собирают до 5 урожаев в год. Как легко подсчитать, с гектара полезной площади шампиньонницы уже сейчас можно получать до 1000 тонн грибов ежегодно. По своей урожайности шампиньоны не имеют равных среди сельскохозяйственных культур. Но указанные цифры далеко не исчерпывают возможности. По литературным данным, урожаи могут достигать 500 кгДг в год Яковенко, Жемойц, 1978). Но такие события бывают достаточно редко. Поэтому задача повышения урожайности шампиньонов представляет на сегодняшний день большую актуальность во всем мире.
Первые научные разработки в области культуры грибов появились в конце XIX - начале XX века, когда крупные овощеводческие фирмы, способные оплатить дорогие исследования, стали вкладывать средства в строительство шампиньонниц. Сейчас шампиньонами занимаются такие известные исследовательские центры, как Пенсильванский университет В США, Институт тепличного хозяйства (Glasshouse Crops Research institute) в Великобритании, до последнего времени велась исследования в Институте им.Макса Планка (мах plank insti tut) в ФРГ. Кроме того, научные разработки ведут частные фирмы, в том числе somycel - транснациональная корпорация, которой принадлежит большая часть мирового производства посадочного мицелия, white Queen ltd. в Англии, Hauser в Голландии и другие. Грибоводов всего мира объединяет организация MGA - Mushroom Growers Asвос. Она устраивает ознакомительные поездки, школы по обмену опытом, издает ежемесячный журнал «The Mushroom Journal». Существуют и другие специализированные журналы: «Mash-room News" в США, «Der Champignon ФРГ, »Der Champignon-kultuur" Голландии, "Journal of Applied Mushroom Science" в Японии. С начала 50-х годов проводятся раз в три года международные конгрессы "Mushroom science», которые выпускают одноименные сборники трудов. Интенсивное изучение культуры шампиньонов ведется не только во всех развитых странах, но и в некоторых странах "третьего мира", например, в Индии.
Технология культивирования непрерывно совершенствуется (Humfeld, 1948; Rasmussen, 1959} Plegg, 1967; McCanna, Flagnan, 1972j Chang, Hayes, 1978; Kinrus, 1979; Flegg, Smith, 1979 и MH. др.).
Первые серьезные исследования шампиньона в СССР провела доцент МГУ Е.С.Клюшникова. Она показала гомоталличность культивируемого шампиньона, что было впоследствие подтверждено и зарубежными авторами (Клюшникова, 1938; Wahl, 1950; Elliott, 1972; Raper, Raper, 1972; Raper, 1978). Исследования культуры шампиьонов проводятся сейчас в ряде учебных и научных центров Советского Союза. К их числу относятся Институт биохимии им.А.Н.Баха, Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Институт ботаники АН УССР им.Н.Г.Холодного, Кишиневский сельскохозяйственный институт им. М.В.Фрунзе и другие учреждения (Горленко, 1983). Свой исследовательский центр имеет и, например, совхоз Заречье Одинцовского района Московской области.
Работа над диссертацией проводилась в рамках комплексной программы "Биотехнология". Основная задача нашего исследования - найти подходы к активизации процесса плодообразования для увеличения урожайности шампиньонов. Чтобы стимулировать плодообразование грибов, нужно знать его механизм, который до сих пор плохо поддается контролю. Известны многочисленные попытки раскрыть механизм плодообразования шампиньона, однако, никому из исследователей пока не удалось добиться решающего успеха. Поэтому для того, чтобы получить урожай, в наше время применяют, в основном, те же методы, что и 100 лет назад. Цель настоящего исследования заключалась в поиске путей оптимизации этой последней стадии технологического цикла, а в связи с этим - изучение особенностей плодообразования культивируемого шампиньона в различных взаимосвязанных аспектах морфологии, физиологии и экологии.
То новое, что мы вносим в исследование проблемы плодообразования культивируемого шампиньона, можно обобщить следующим образом. При изучении морфологии A.bisporus и других агариковых грибов нами использованы простое визуальное наблюдение большой по объему выборки живых плодовых тел, что позволило регистрировать редко встречающиеся события, а также комбинация световой и растровой (сканирующей) электронной микроскопии. Новизна подхода заключается в попытке создать условия, которые позволяют максимально контролировать процесс плодообразования в целом и регулировать ход морфогенеза отдельных плодовых тел. Для этого была предложена новая система экспериментального культивирования шампиньонов, особенности которой позволили нам подать заявку на изобретение. Впервые для изучения культуры грибов нами применен метод химических моделей. В ходе комплексного анализа микрофлоры, сопутствующей плодообразованию культивируемого шампиньона, были применены как традиционные методы косвенного учета микроорганизмов высевом на твердые питательные среды, так и прямые методы исследования гифосферы шампиньона под световым и растровым электронным микроскопами. Выделенные чистые культуры микроорганизмов исследованы на способность вызывать плодообразование культивируемого шампиньона.
Те основные положения, которые мы считаем возможным вынести на защиту, можно сформулировать следующим образом.
1. Гимений культивируемого шампиньона включает две разновидности элементов: базидии и базидиолы. Элементы гимения на всех этапах его развития скреплены между собой желатиноподобным веществом. Эта неизвестная ранее черта строения гимения показана нами и для других агариковых гри бов.
2. Мицелий культивируемого шампиньона, помимо углекислого газа, продуцирует и другие летучие (газообразные) метаболиты, способные ингибировать плодообразование. Причем, ацетон, этанол и эти-лацетат, для которых ранее предполагалось участие в пусковом механизме плодообразования, не влияют на этот механизм.
3. В ходе плодообразования культивируемого шампиньона в покровном слое наблюдаются всплески окислительной активности, наличие и продолжительность которых связаны с "волнами" плодовых тел.
4. Не существует определенный микроорганизм, специфически связанный с процессом плодообразования культивируемого шампиньона. Можно говорить лишь об определенных характеристиках микрофлоры в целом, носящих, скорее, статистический характер.
. Изучение морфологических аспектов плодоОбразования Agaricus bisporus
Не вдаваясь в терминологические споры, мы, однако, считаем нужным определить те термины и понятия, которыми в дальнейшем будем пользоваться, ввиду существенных разнотолков в литературе. Можно встретить самые различные названия культивируемого шампиньона: Agaricus campestris Fr., Agaricus campestris Fr. var, horten-sis Cke; Psalliota hortensis Cke; Psalliota bispore (Lge) Moell, et Schaeff; Agaricus campester Fr»; Agaricus campester Fr. -var. bisporus Kligman; Agaricus hortensis (Cke) Pil»; Psalliota hortensis (Cke) Lge; A,bisporus (Lge) Pil«
Встречаются даже такие названия, первоисточники которых в ботанической литературе неизвестны, например, Agaricus blazei(M.) (Block et ai,, 1956). Все это сильно затрудняет работу с литературными источниками и часто приводит к путанице. Как иллюстрацию крайней степени разногласий в области таксономии и номенклатуры культивируемого шампиньона, можно привести существующее до сих пор мнение о том, что это не самостоятельный вид, а культивируемая разновидность Agaricus campester Fr» (Miller, 1979).
Автором таксона, определяющего вид культивируемый шампиньон, Agaricus bisporus, часто признают Зингера (Мелик-Хачатрян, 1980; Singer, 1951, 1961; Hayes ,[978). Его приоритет признан Международным ботаническим конгрессом в Париже в 1954 г. В США и СССР автором, как правило, считается Имбах, в соответствии с правилами приоритета (Imbach, 1946; Kotlaba, 196. Существует также мнение, что культивируемый шампиньон был описан еще в 1900 году Пеком и в соответствии с правилами приоритета должен именоваться Agaricus brunnescens Peck (Malloch, 1976) Однако, специалисты од 10 ного из ведущих учреждений в области изучения культуры шампиньонов - Glashouese Crops Research Institute-в коллективном заявлении отвергли название A.brunnescensHa том основании, что оно относится только к коричневой форме шампиньона (Elliott, 1983). Следовательно, это название не охватывает весь вид в целом, включающий две формы, белую и коричневую. Для белой формы пришлось бы применять самостоятельное видовое название, что и неудобно, и неправомерно (Elliott, 1983). Известны экспериментальные данные, демонстрирующие идентичность двух форм по их физиологии и экологии (Wahl, 1950). Показано, что по размерам спор белая и коричневая формы статистически достоверно относятся к одному виду (Га-рибова, Мокеева, 1975). Поэтому здесь мы принимаем следующую номенклатуру культивируемого шампиньона: Agaricus bisporus (Lange) Imbach#
Структуру, несущую у шампиньона пластинки с базидиями, в литературе называют по-разному: карпофор, базидиокарп и пр, (Burnett, 1976). Шампиньоноводы всего мира чаще всего пользуются термином "плодовое тело" (fruiting body или fruit body ). Несмотря на рекомендации Международного кодекса номенклатуры культурных растений, слово "культивар" шампиньоноводы, по существу, так и не приняли. Как и прежде, культивируемые линии A bisporus называют штаммами. Закладку зачатков плодовых тел обозначают термином "инициация" (Гарибова и Дараков, 1981), а весь процесс инициации, развития и созревания плодовых тел - "плодоношение" или "плодо-образование".
Не будет преувеличением сказать, что не только каждый исследователь пользуется своей собственной более или менее продуманной и сформулированной терминологией, но и в разных работах одного автора можно встретить различные подходы к оценке одной и той же структуры. Так, в работе Вуда 1976 года (Wood, 1976) примордий - структура, превосходящая I мм в размере, состоящая из плотной гифальной сети, с гладкой поверхностью и отличающаяся визуально от узелков (knots) и мицелиальных тяжей ( stands of hyphae). А в работе того же автора 1979 года (Wood, 1979 0 под примордием понимается уже структура диаметром I см. В целом в литературе по культивированию шампиньонов нет единой терминологической системы, что приводит к значительным трудностям. В Советском Союзе ранее уже была предпринята одна попытка установления терминологического единообразия, по крайней мере, в вопросах таксономии и номенклатуры культивируемого шампиньона (Гарибова, 1970). На основании материалов настоящей работы мы предприняли вторую такую попытку (Да-раков, Чернуха, 1984).
. Изучение механизма шіодообразования Agaricus bisporus. Обзор литературы
В вопросе о плодообразовании культивируемого" шампиньона трудно найти такой аспект, по которому не было бы разноречивых суждений в литературе. Это связано с хорошей изученностью объекта. Ведь хорошая изученность означает обилие научных школ и разработок, длительную историю изучения. В настоящем обзоре нами сделана попытка привести разноречивые суждения к некому общему знаменателю, где это возможно. С одной стороны, мы попытались охватить все основные существующие точки зрения, представить историю изучения вопроса, с другой стороны, мы попытались привести различные взгляды в подобие системы.
ТехнологияВначале кратко опишем технологию производства шампиньонов. Она подразделяется на ряд стадий, которые все вместе складываются в единый технологический цикл. Первая стадия цила - производство посевного мицелия. Мицелий либо поддерживают в культуре методом периодических пассажей, либо получают путем проращивания базидио-спор (Гарибова, 1969). Готовый к употреблению посевной мицелий производят на компостном или, гораздо чаще, на зерновом субстрате (компостный мицелий и зерновой мицелий). Вторая стадия - приготовление шампиньонного компоста. Как правило, компосты состоят из навоза либо птичьего помета в смеси с соломой. В их состав входят также различные минеральные удобрения и органические добавки. В последнее время отходы животноводства все чаще заменяют другими источниками питательных веществ, - это так называемые синтетические компосты. Основных требований к компосту два: урожайность и селективность для мицелия культивируемого шампиньона. В большой мере компосты приобретают эти свойства в процесае ферментации, которая протекает в строго аэробных условиях от недели до месяца и более. В конце ферментации компост обычно либо пастеризуют, либо за счет естественно выделяющегося тепла доводят его температуру до 60С и выше
. После охлаждения и удаления оставшегося аммиака производят посадку мицелия в компост. Компост смешивают с посевным мицелием при заполнении ящиков (пластиковых мешков), которые затем помещают в культивационные помещения (камеры) шампиньонниц. При других системах выращивания компост размещают в культивационных помещениях в виде грядок или на стеллажах, а затем производят посев.
В дальнейшем мы будем пользоваться термином "шампиньонная грядка" вместо перечисления различных систем. Вегетативный рост мицелия в компосте длится 2-3 недели при 24-25С, затем производят засыпку покровного слоя (гобтировку) для начала гаюдообразования. Покровный слой представляет собой чаще всего слой дерновой почвы, либо смеси торфа с известняком или доломитной крошкой.
Плодовые тела культивируемого шампиньона появляются в толще и на поверхности покровного слоя. Изучение механизма пло до образования А. Ыврогиз-это изучение покровного слоя. В практике шампиньоноводства к нему обычно предъявляют следующие требования: достаточная водоудерживающая способность для снабжения плодовых тел влагой, пористая структура для газообмена, рН 7.3 - 7.8, минимальное присутствие ионов металлов ( Levanon et al., 1984). После гобтировки температуру воздуха в шампиньоннице снижают до 14 - 20С для начала плодообразования.
Плодовые тела культивируемого шампиньона образуются в толще покровного слоя и на его поверхности спустя 2-3 недели. Они появляются в виде "волн" урожая, между которыми 7-10-дневный интервал. Наибольший урожай дают I и 2 волны, затем сбор грибов падает. После 4-6 волн компост удаляют из культвационных помещений, их подвергают дезинфекции, затем цикл выращивания повторяется. Ежегодно бывают от 2 до 6 таких циклов, чаще 4.5 - 5. Технология производства шампиньонов и ее различные варианты подробно описаны в многочисленных руководствах (Грачев, 1861; Пром.культивирование съедобных грибов, 1978; Atkins, 1974; Chang, Hayes, 1978, Purkayastha, 1981; Eicker, 1981).
Роль различных компонентов газовой фазы и окислителей в плодообразовании Agaricus bisporus
Поскольку изучение концентрации С0 в атмосфере не представляет сложной методической проблемы, влияние как избытка, так и недостатка этого газа - один из наиболее полно изученных вопросов в области культивирования шампиньонов (Гарибова и Чандра, 1979; Tschierpe, 1959; Tabac, Cooke, 1968; Wolf, 1968; Turner, 1977} Tschierpe, Sinden, 1964; Hintikka, Eorhonen, 1970; Smith, стерильная почвя
Как известно, не всякий покровный слой пригоден для развития плодовых тел. Стерильная почва, в отличие от нестерильной и от активированного угля, не дает урожая (Atkins, 1974; Eger, 1972; Couvy, 1974, Angeli-Coi Mbi решили сравнить действие стерильной и нестерильной почвы, а также стерильного активированного угля в различных комбинациях на изменение концентрации ( с течением времени от посева мицелия в субстрат до момента появления плодовых тел (где это возможно).
В предлагаемой серии опытов за основу Взята методика выращивания шампиньонов в колбах, предложенная Гарибовой и др. (1974). Эта методика была описана нами в ч.І гл.І с. 21. Для анализа газовой фазы в ходе роста и плодоношения A. Msporus в описанную методику был внесен ряд частных изменений. Качалочные колбы объемом 1000 мл, либо колбы Эрленмейера объемом 500 мл на 1/3 заполняли стерильным компостированным конским навозом, представленным нам шампиньонницей совхоза "Заречье". Затем субстрат слегка уплотняли, колбы закрывали ватными пробками, сквозь пробки были пропущены стеклянные трубки для взятия атмосферных проб. Для поддержания стерильности на трубки были одеты резиновые шланги с зажимами. Стерилизацию подготовленных колб с субстратом проводили в автоклаве в течение 40 мин. при I атм. избыточного давления. Колбы после охлаждения инокулировали зерновым мицелием промышленного штамма F-2 селекции Somycel (Франция). Затем, замерив исходную концентрацию C0g в колбах с мицелием, их помещали в термостат для инкубации при 24 С. Измерения концентрации С0 проводили химическим анализатором АУХ - 2 в стерильных условиях через каждые сутки. Через 14 суток во всех колбах проводили гобтировку, засыпали компост разнообразными покровными материалами.
Для изучения влияния различных покровных материалов на концентрацию COg и развитие плодовых тел A. Msporus использованы б различных вариантов покровных материалов (Рис.38-43): (I) стерильная почва (Рис.38); (2) стерильная смесь почвы и активированного древесного угля в пропорции 2:1 (Рис.39); (3) нестерильная почва - контроль (Рис.40); (4) стерильный активированный древесный уголь (рис.41); (5) слой стерильного активированного древесного угля поверх слоя стерильной почвы (Рис.42); (6) слой стерильной почвы поверх слоя активированного древесного угля (рис.43). Во время вегетат-ивного роста концентрация углекислого газа равнялась оыбчно 0.4 - 0.5%. С момента гобтировки значения COg в различных вариантах эксперимента начали заметно различаться. В случае гобтировки стерильной почвы (Рис.38) уровень COg составлял большую часть времени 0.7%, при этом как правило, морфогенез прекращался на стадии мицелиальных клубочков - узелков. Со временем начиналось формирование мицелиальной стромы. На 43-и сутки этот опыт был прекращен в связи с отмиранием стромы. В другом варианте опыта, где в качестве покровного слоя использовали стерильную смесь почвы и активированного древесного угля (Рис.39), активированный уголь позволил поддерживать концентрацию углекислого газа на оптимальном уровне около 0.3 - 0.4% до созревания плодовых тел. Можно предположить, что избыточное количество С0, которое могло бы стать ингибитором развития плодовых тел, было поглощено активированным углем, и этот запас, с другой стороны, позволял поддерживать концентрацию С0 на достаточном для морфогенеза уровне. В этом опыте были получены плодовые тела шампиньона во всех повторностях. Плодовые тела имели нормальный внешний видих базидиоспоры проросли в нормальные культуры A. Msporus. Интересно отметить резкие скачки концентрации углекислого газа на последних стадиях формирования плодовых тел. Когда примордии вырастали в "бутоны", концентрация COg падала в течение суток с 0.4 до 0.3% (Рис.39 и 40), затем по мере дифференцировки растущих плодовых тел на шляпку и ножку в течение 3 суток поднималась до 1.2% в момент раскрытия шляпки и оставалась на этом уровне до окончания отбрасывания базидиоспор. Аналогичная картина динамики С0 при созревании плодовых тел обнаружена и у A. campester (Гарибова, Чандра и Дараков, 1982). В момент созревания плодовых тел А. Ьієрогиєнаблюдается резкое повышение концентрации не только углекислого газа, но и этилена (Wood, Hammond, 1977). Причем, авторами показано, что этилен выделяется не плодовыми телами, а мицелием культивируемого шампиньона. Покровный слой в этих экспериментах также состоял из активированного угля (wood,
Hammond, 1977)9 нашем случае динамика накопления С0 была сходной в вариантах с нестерильной почвой и стерильной смесью почвы и активированного угля (Рис.39 и 40); в обоих случаях были получены плодовые тела. По-видимому, активированный древесный уголь действительно способен играть ту же роль, что и почвенная микрофлора в нестерильных покровных субстратах. В данном случае это проявилось в аналогичной регуляции уровня С0г и появлении плодовых тел. Если полученные в предыдущей серии опытов данные .позволили заключить, что уровень С0 важен при переходе от вегетативной стадии к генеративной в определенный момент развития,следующий вскоре после гобтировки, то анализ результатов, полученных в настоящем эксперименте, позволяет предположить еще один такой критический момент. По-видимому, для успешного прохождения плодовым телом 5-6 стадий развития ("бутон") необходимо снижение концентрации ( до 0.3$. При сравнении диаграмм (Рис.39 и 4Рис. 38, 41, 42 и 43) можно предположить, что ингибирование развития плодовых тел на этой стадии связано со значительной концентрацией COg. Варианты эксперимента, отраженные на диаграммах 41, 42 и 43, уточняют действие активированного древесного угля на развитие A. bisporus.
Микроорганизмы, связанные с плодообразованием Agaricus bisporus
Вопрос о роли микроорганизмов в плодообразовании культивируемого шампиньона, без сомнения, относится к числу наиболее дискуссионных. Более 30 лет назад Б.Б.Столлер впервые высказал гипотезу о связи бактерий покровного слоя с плодообразованиемСБШіег 1952). После большой серии работ английских и австралийских авторов инициацию гаюдообразования в зарубежной литературе стали связывать с бактерией Pseudomonas putida или, более широко, с видами Pseudomonas ІУ группы fluore scene ПО Стайнеру (stainer, Pal-leroni, Doudoroff, 1966 j Hayes, Randle, Last,1969; HayeSfir 1975; Yisscher, 1979). Гораздо меньший отклик в литературе получили попытки связать плодоношение с актиноміцетами (Eger, 1961) или грибами (Сафрай, 1977; Гарибова, 1982).
Поскольку гипотеза о роли P. putida в плодообразовании А. Msporus подкреплена солидным экспериментальным материалом и подержана авторитетом ведущих специалистов в области грибоводства (Hayes, Randle, Last, 1969, Arrold, 1972; Hayes, 1973; Eger, 1972 и др.), а автор ставящий эту теорию под сомнение, всего один (Wood, 1976, 1979b), и тот подвергнут критике в литературе (ViBscher, 1979), мы поначалу приняли гипотезу об исключительной роли этой бактерии как доказанную. Однако, с помощью чистой культуры p. putida, полученной из коллекции ВКЩ, ни нам, ни Ю.Д.Акимовой, ни работавшей с нами д-ру А.Чандра не удалось получить плодовые тела А. МзрогизЕще Г.Эгер заметила, что в случае использования стерилизованного покровного слоя плодообразование шампиньона часто вызывают бактерии, попадающие в него из воздуха в процессе культивирования гриба ( Eger, 1962). Нам удалось наблюдать подобное явление не менее чем в 100 случаях. Практически это происходит всегда, если емкость с грибом закрыта рыхлой ватной пробкой, а пробка должна быть не очень плотной, поскольку иначе аэрация оказывается недостаточной для плодообразования. Уже один этот факт противоречит гипотезе об исключительной роли Pseudomonas: эти бактерии лишены спор или капусул, и поэтому заражение ими аэрогенным путем,да еще в таких количествах, невозможно CStainer, Palleroni, Doudoroff, 1966; Bergey, 1974). В случаях такого заражения из покровного слоя легко выделить на мясо-пептонный агар (МПА) бактерии, колонии которых по морфологии действительно HanoMHHaiOTPseudomonas. Среди них встречаются как грамположительные, так и грамотрицательные изоляты (представители Pseudomonas все грамотрицательные (stainer, Palleroni, Doudoroff, 1966; Bergey, 1974). Однако, при внесении в покровный слой культуры таких бактерий, накопленный на МПА или на питательном агаре (из сухого порошка Дагестанского завода питательных сред) плодовые тела не появлялись. Это свидетельствовало либо о неадекватности использованных питательных сред, что приводит к отчуждению бактерии при ее внесении в покровный слой, либо о том, что присутствия одних только бактерий в покровном слое недостаточно для плодообразования, в соответствии с гипотезой Л.В.Гарибо-вой и А.И.Сафрай (Гарибова, Сафрай, Шалашова, 1974; Гарибова и Сафрай, 1975; Сафрай, 1977; Сафрай и Гарибова, 1977; Гарибова, 1978, 1982; Garibova, 1978).
Таким образом, мы пришли к необходимости заново провести анализ микрофлоры покровного слоя. Как известно, покровный слой представляет собой полусинтетический заменитель дерновой почвы, ее искусственный аналог, обычно на основе торфа. В условиях агро-биоценоза при культивировании шампиньонов в нем протекает, по литературным данным, сложная и вместе с тем плохо изученная сукцессия микроорганизмов. Исследования такого рода сообществ микроорганизмов всегда сопряжены со значительными трудностями. Одна только отработка методической части исследования заняла в общей сложности около 5 лет. При этом были проверены все основные существующие на сегодняшний день гипотезы участия микроорганизмов в плодо-образовании A. Msporus и предложены некоторые новые.
На основании имеющихся литературных данных мы приняли следующие рабочие гипотезы. 1. Плодообразование вызывается "Микроорганизмом X", присутствующим в покровном слое (термин Г.Эгер (Eger, 1961)). 2. По мере прорастания мицелия в покровный слой "Микроорганизм X" в нем накапливается. 3. В наиболее сложном случае "Микроорганизм X" может быть специфическим комплексом микрофлоры, в который могут входить не только бактерии, но и актиномицеты,и грибы.
Эти три рабочие гипотезы определили использованные косвенные методы учета микроорганизмов в покровном слое. Однако, при этом в круг поиска должны попасть 150-200 видов бактерий, грибов и актиномицетов, населяющих шампиньонницы. Задача определения специфического комплекса микрофлоры, вызывающего плодообразование, оказывается неразрешимой в рамках проводимой работы без использования дополнительных методов или рабочих гипотез, ограничивающих круг поиска. Одним из дополнительных методов выявления связанных с плодообразованием микроорганизмов послужило прямое наблюдение гифосферы шампиньона и стекол обрастания в покровном слое при помощи сканирующего (растрового) электронного микроскопа. Другим методом ограничения круга поиска потенциальных "Микроорганизмов X" избрали подход, предложенный Т.Г.Мирчинк для характеристики комплексов микромицетов почв (Мирчинк и др., 1981). При этом покровный слой рассматривается как искусственный аналог почвы в условиях агробиоценоза. Согласно подходу Т.Г.Мирчинк, одни виды могут быть типичными в данных условиях и им принадлежит основная роль в сообществе, другие - случайны. Поэтому для характеристики структуры комплексов в биогеоценозах необходимо дифференцировать типичные и случайные виды.
При косвенном методе учета микромицетов путем посева разведений почвы на твердые питательные среды типичными видами считаются те, которые встречаются с частотой не менее 30$. Встречающиеся с частотой 60$ и более считаются доминирующими (Мирчинк и др., 1981; Мирчинк, Озерская, Марфенина, 1982). Аналогичную рабочую гипотезу в неявном виде использовали все исследователи микрофлоры покровного слоя: все, по существу, работали с преобладающими видами. Более 20 лет назад Г.Эгер указывала, что для успешного плодообразования "Микроорганизма X" в покровном слое должно быть много ( Eger, 1962). Как мы позже постараемся показать, указанные два метода ограничения круга поиска дали вполне согласованные между собой результаты, что можно рассматривать как косвенный довод в пользу правильности нашей четвертой рабочей гипотезы, заключающейся в том, что "Микроорганизм X" - типичный для покровного слоя вид или комплекс видов.
На основании принятых рабочих гипотез мы приняли два основных метода изучения микрофлоры покровного слоя: I) рассев на ага-ризованные питательные среды и 2) прямое микроскопироваше микроорганизмов покровного слоя. В обоих случаях старались выделить прежде всего типичные формы, сопутствующие плодоношению культивируемого шампиньона.
