Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Апикальная меристема побега. Роль в формировании вегетативных органов растения 10
2.1.1. История исследования меристем 10
2.1.2. Апикальная меристема побега в различных систематических группах растений. Цитологическое зонирование меристемы Покрытосеменных 10
2.1.3. Слои меристемы, их роль в формировании органов растения 12
2.14. Молекулярно-генетические основы идентификации меристемы із
2.1.5. Общие механизмы дифференцировки примордия 14
2.1.6. Взаимодействие слоев меристемы. Вариабельность вклада слоев туники в формирование примордия листа 15
2.17. Формирование осей полярности листового примордия 16
2.2. Свойства химерных растений 17
2.2.1 Получение химерных растений 17
2.2.2. Периклинальные химеры 18
2.2.3. Мериклинальные химеры 19
2.2.4. векториальные химеры 19
2.2.5. Цитохимеры 20
2.2.6. Пестролистные химеры 21
2.2.7. Химерность генеративных органов 22
2.2.8. Трихимеры 22
2.3. Развитие листа 23
2.3.1 Инициация примордия 23
2.3.2. Детерминация формы листа в процессе развития 24
2.3.3. Вариабельность структуры листа 25
2.4. Ультраструктура пластид фотоспнтезирующих тканей. Характеристика ультраструктуры хлоропластов как показатель функционального состояния фотосинтетических тканей 27
2.4.1. Биогенез пластид 27
2.4.2. Структурно функциональные особенности пластидного аппарата 29
2.5. Экзогенная регуляция структуры и функциональной активности фотосинтетического аппарата 31
2.5.1 Индукция флуоресценции хлорофилла как показатель функционального состояния фотосинтетического аппарата 33
2.6. Динамичность фотоситнетического аппарата 37
2.6.1 Донорно-акцепторные отношения в растении как основа эндогенной регуляции 38
2.7. Типы процессов деградации в растительных тканях. Цитологические особенности деградации клеток в условиях углеводного голодания 40
2.7.1 Пути деградации растительных клеток 40
2.7.2. Цитологические особенности автофагии 41
2.7.3. Роль автофагии в растениях 41
2.8. Проводящая система листа. Транспорт фотоассимилятов в листе 42
2.8.1. Развитие терминальной сети листа. Терминальные комплексы флоэмы . 42
2.8.2. Плазмодесмы, строение и функции 44
2.8.3. Загрузка флоэмы в листе 44
3. Объекты и методы исследования 46
3.1. Объекты исследования 46
3.11 Характеристика объектов 46
3.12. Условия выращивания 47
3.2. Световая микроскопия 47
3.3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) 48
3.4. Расчет количественных параметров клеток и органелл 48
3.5. Методы характеристики морфологических особенностей объектов 49
3.6. Определение площади листа по изображению 50
3.7. Определение фотосинтетических пигментов спектрофотометрпческпм методом 51
3.8. Анализ пигментов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 51
3.9. Исследование функционального состояния фотосинтетического аппарата методом регистрации индукции флуоресценции хлорофилла 52
3.10. Определение общих и растворимых Сахаров антроновым методом 56
4. Результаты и обсуждение 58
4.1. Анатомо-морфологические особенности закладки, развития и строения листа пестролистной химеры Ficus benjamina 'Starlight' 58
4.11 Организация апикальной меристемы побега пестролистной химеры Ficus benjamina 'Starlight' 58
4.1.2. Соотношение белой и зеленой зон в ходе роста раскрывшегося листа 60
4.13. Анатомо-морфологическое строение листьев пестролистной химеры Ficus benjamina 'Starlight' и зеленого сорта 'Daniel' 61
4.2. Влияние площади зеленой зоны в побеговой системе (донора фотоассимилятов) на закладку белой зоны в прпмордии листа химеры Ficus benjamina 'Starlight' 64
4.2.1 Зависимость относительной площади белой зоны в листе от его положения в побеговой системе 64
4.2.2. Зависимость площади листа от соотношения белой и зеленой зон 66
4.2.3. Влияние суммарной площади ассимилирующей поверхности на долю белой зоны в образующихся на побеге листьях 67
4.2.4. Влияние света на соотношение белой и зеленой зон в листе пестролистной химерыFicus benjamina 'Starlight' 68
4.3. Характеристика зеленой зоны - донора фотоассимилятов 69
4.3.1. Количественный состав пигментов в зеленой зоне зрелых листьев Ficus benjamina 'Starlight' в сравнении со зрелыми листьями нехимерного Ficus benjamina 'Daniel' 69
4.3.2. Характеристика функционального состояния фотосинтетического аппарата в зеленой зоне листьев пестролистной химеры F. benjamina 'Starlight' и цельнозеленого F. benjamina 'Daniel' 69
4.3.3. Характеристика ультраструктуры хлоропластов зеленой зоны молодых и зрелых листьев 72
4.4. Функциональная активность фотосинтетического аппарата белой зоны листа 74
4.4.1. Количественный состав пигментов в белой зоне зрелых листьев Ficus benjamina 'Starlight' 74
4.4.2. Характеристика функционального состояния фотосинтетического аппарата в белой зоне листьев пестролистной химеры К benjamina 'Starlight' 76
4.4.3. Характеристика ультраструктуры клеток мезофилла белой зоны молодых и зрелых листьев 77
4.5. Сравнительная характеристика белой и зеленой зоны 81
4.5.1. Возрастная динамика состояния клеток мезофилла белой и зеленой зон 81
4.5.2. Электронномикроскопические особенности клеток белой и зеленой зон как характеристика их метаболизма 81
5. Заключение 84
6. Выводы 89
7. Список литературы
- Апикальная меристема побега в различных систематических группах растений. Цитологическое зонирование меристемы Покрытосеменных
- Экзогенная регуляция структуры и функциональной активности фотосинтетического аппарата
- Определение площади листа по изображению
- Организация апикальной меристемы побега пестролистной химеры Ficus benjamina 'Starlight'
Введение к работе
Пестролистные химерные растения являются удобной моделью для изучения процессов закладки и развития вегетативных органов растений (Satina, 1942; Marcotrigiano, 2000). Для листьев пестролистных химер характерно наличие генотипически разнородных тканей, различающихся по способности к фотосинтезу. У периклинальных бело-зеленых химер относительное расположение белой и зеленой зон в меристеме постоянно, но контуры и соотношение площадей этих зон в листьях могут меняться. Однако вопрос о факторах, определяющих соотношение этих зон, до сих пор является открытым, поэтому изучение физиологических механизмов регуляции закладки и дальнейшего коррелятивного развития генетически разнородных фотосинтезирующей и акцепторной зон является актуальным.
На процесс формирования листа влияют как внешние (интенсивность света, концентрация С02), так и внутренние (физиологические и генетические) факторы. В частности, под влиянием изменений интенсивности и спектрального состава света, температурных колебаний, засухи, изменения содержания С02 в атмосфере и многих других факторов может меняться мезоструктура фотосинтетического аппарата, интенсивность функционирования биохимических циклов, скорость роста и развития, донорно-акцепторные отношения (Мокроносов, 1983; Мокроносов, Гавриленко, 1992). Распределение доноров и акцепторов во времени непостоянно. Все растущие части растительного организма являются акцепторами и, таким образом, донорно-ацепторные отношения играют важную роль в регуляции ростовых процессов и в функционировании фотосинтетического аппарата (Мокроносов, 1983, Turgeon, 2006). Одним из методов характеристики органа как донора или акцептора фотоассимилятов является исследование ультраструктуры тканей листа (Гамалей, 2004). Однако данные по ультраструктуре клеток химерных растений очень малочисленны.
Одной из хороших моделей для изучения регуляции развития листа является пестролистная периклинальная химера Ficus benjamina L. cv. 'Starlight', обладающая постоянным распределением клеточных линий в меристеме, четко отграниченными белой и зеленой зонами в листе, обильно ветвящимися побегами.
Актуальным представляется исследование ультраструктуры клеток мезофилла белой и зеленой зон как в молодом, так и в зрелом листе, а также электронно-микроскопическая характеристика структуры пластид белой зоны. Необходим комплексный подход, позволяющий оценить роль ростовых процессов в регуляции донорно-акцепторных отношений в растении, а также их взаимное влияние.
В биологии термин «химера» используется для обозначения организмов, состоящих из генетически неоднородных тканей. Впервые его применил немецкий ботаник Г. Винклер в 1907 г. для обозначения форм растений, полученных в результате сращивания паслёна и томата (Кренке, 1947). Далее Баур в 1909 г., работая с Pelargonium zonale L'Her., предположил наличие генетически независимых слоев клеток в апикальной меристеме
химер (Джонс, 1936). Первые эксперименты по получению цитохимер Datura stramonium L., в меристеме которых клеточные слои отличались по плоидности, подтвердили наличие трех генетически независимых слоев в апикальной меристеме, LI, L2, L3, участвующих в формировании различных органов и тканей растения (Satina et ai, 1940). Пестролистные химерные растения являются удобной моделью для изучения процессов закладки и развития вегетативных органов растений (Dermen, 1951; Marcotrigiano, 2000). Для листьев пестролистных химер характерно наличие генотипическн разнородных тканей, различающихся по способности к фотосинтезу. В ряде работ отмечена повышенная вариабельность развития вегетативных органов у химерных растений (Dulieu, 1967; Pohlheim, 1973) на морфологическом уровне. В некоторых случаях подобное явление связано в различиях параметров клеточного цикла в генетически разнородных тканях (Marcotrigiano, Bernatzky, 1995). Так, пестролистная химера Abutilon Mill, состава GWG (L1 — зеленый, L2 - белый, L3 — зеленый, где LI, L2, L3 — слои туники в апикальной меристеме побега) имеларазную скорость дел ения бел ых и зеленых клеток: белые дел ились значительно реже, чем зеленые (Marcotrigiano, 2001 Связь между пестролистностыо и параметрами, не связанными с фотосинтезом была выявлена лишь в последние годы, когда было обнаружено влияние развития пластид на морфологию клетки (Chatterlee et ai, 2007), структуру листа (Ahlert et ai, 2003) и даже на эмбриогенез целого растения (Berg et ai, 2005; Baldwin et ai, 2005).). При этом генетически разнородные ткани могут проявлять разную степень и характер взаимодействия, образуя единый орган. У Abutilon клетки генетически зеленого эпидермиса, попадая при периклинальном делении в слой генетически белого мезофилла, приобретали свойственную ему скорость деления. Взаимное влияние может также проявиться не только в клеточном цикле (имеется достаточно много примеров компенсации делений края листа клетками центральной зоны и др., полученных не на химерах), но и в метаболических характеристиках ткани. Так, химера Citrus sinenis Osbeck cv. 'Fuhuhara' и С. nastsudaidai Hayata cv. 'Kawano' в различных комбинациях демонстрировала зависимость рН клеточного сока, содержания Сахаров от комбинации генетически разнородных слоев при формировании плодов (Zhou et al., 2002). Существуют также примеры взаимного влияния клеточных слоев в меристеме у химер (Ingram, 2004; Zhu et al., 2007). Таким образом, химерные растения способны к более широкой вариабельности в развитии, кроме того, химера является не просто набором из тканей двух или трех (известны трихимеры) типов, поскольку генетически разнородные ткани способны взаимодействовать между собой, формируя целостные, функционирующие и, во многих случаях, нормальные по форме органы.
Для пестролистных бело-зеленых растений отмечена способность зеленой ткани компенсировать отсутствие фотосинтеза в белой за счет приобретения параметров, характерных для «световых» листьев (Alum et al., 2001). Данная работа сделана на мутанте по ядерному гену, рисунок листа и соотношение зон неизменно и, т.о., морфологическая компенсация наличия белой зоны не реализуется. Пестролистные бело-зелепые химеры обладают, по сути, автотрофной и гетеротрофной тканями в пределах одного органа — листа и, как было показано выше, способны к большей вариабельности развития, чем
нехимерные растения. Эти факты закладывают основу для морфологической компенсации пестролистности и представляют пестролистные химеры как наиболее подходящую модель для изучения этого явления.
С другой стороны, как лист, так и целое растение являются динамичными, постоянно меняющимися системами с функционирующими в них потоками фотоассимилятов, ориентированными по т.н. «донорно-акцепторным диполям» (Гамалей, 2004), в соответствии с системой донорно-акцепторных отношений в целом растении. Основными донорными органами в фотосннтезирующем непаразитическом растении являются листья, акцепторными - подземные запасающие органы, цветки плоды и семена (Мокроносов, 1983), что позволяет исследовать систему донорно-акцепторных отношений на макроскопическом уровне целого растения. На более детальном уровне донорно-акцепторные потоки обычно исследуют в работах по загрузке и разгрузке проводящих тканей, где в пределах одного органа можно наблюдать клетки-доноры и клетки-акцепторы (Гамалей, 2004; Turgeon, 2006). Хорошей моделью для исследования донорно-акцепторных отношений в пределах одного органа является лист, представляющий из себя вначале акцептор, а при созревании превращающийся в донор (Walter et ah, 2004). Однако поток Сахаров в листе однонаправлен - либо на разгрузку, либо на загрузку флоэмы, и лишь очень короткое время он сочетает в себе донорный и акцепторный участки (Turgeon, 1989). Пестролистное растение сочетает в себе одновременно производителя и потребителя фотоассимилятов, являясь уникальной моделью для исследования донорно-акцепторных отношений.
Регуляторная роль фотоассимилятов проявляется не только в системе донорно-акцепторных отношений. Роль растворимых Сахаров как тонких регуляторов состояния клетки в последнее время привлекла широкое внимание исследователей (Aubert et ah, 1996; Toyooka, 2001; Walter et ah, 2003; Wiese et ah, 2007; Usadel et ah, 2008; Wingler et ah, 2009). Наиболее простая связь наблюдается при нехватке Сахаров. Углеводное голодание не просто является одной из самых распространенных причин автофагии (Aubert et ah, 1996; Usadel et ah, 2008), но и переключателем программы старения органа, определяемого также соотношением углеводов и соединений азота (Wingler et ah, 2009). Не менее интересны работы, демонстрирующие влияние Сахаров на рост и развитие. Так, известно, что растворимые сахара подавляют развитие пластид (Гамалей, 2004), что проявляется в неоднородности донорного статуса клеток мезофилла разных участков развивающегося листа - вблизи крупных жилок и вдали от них (Wiese et ah, 2007). Потенциально перспективной моделью для изучения влияния потоков фотоассимилятов на весь спектр процессов развития клеток листа - от роста и дифференциации до деградации - является пестролистная химера.
Цель работы. Установить характер взаимодействия зеленой и белой зон в онтогенезе у пестролистной химеры Ficus benjamina L. сорта 'Starlight'. Исследовать влияние донорно-акцепторных отношений на регуляцию закладки листа.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Охарактеризовать функционирование фотосинтетического аппарата белой и
зеленой зон химеры.
Дать электронномикроскопическую характеристику пластид зеленой и белой зон листа пестролистной химеры.
Описать структуру меристемы и процесс закладки примордия листа химеры Ficus benjamina L. сорта 'Starlight'.
Проанализировать анатомические особенности листа пестролистной химеры в связи с взаимодействием генетически разнородных тканей в процессе закладки листа.
5. Проследить динамику ультраструктурных изменений клеток мезофилла белой
зоны в ходе онтогенеза листа.
6. Выявить морфофизиологические корреляции между долей фотоассимилирующей
поверхности в листе и общей фотосинтезирующей площадью целого растения.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Апикальная меристема побега в различных систематических группах растений. Цитологическое зонирование меристемы Покрытосеменных
У Покрытосеменных в апикальной меристеме туника покрывает корпус снаружи. Клеточные слои туники принято обозначать латинской буквой L (layer) с номером. Так, L1 является самым наружным слоем, под ним лежит L2 и т.д. Классическое представление об апикальных слоях сформировано в 1953 году К. Эсау (1969): у большинства видов двудольных в апикальной меристеме побега имеется 3 слоя туники: LI, L2 и L3, т.н. протодерма, гиподермис и субгиподермис, или «корпус». Позднее для однодольных также было показано наличие трех независимых апикальных слоев (LI, L2, L3), чьи производные обнаруживаются в стели, листьях и цветках (Stewart, Dermcn, 1979). Три апикальных слоя также характерны и для сенполий, что подтверждено работами с их периклинальными химерами (Lineberger, Druckenbrod, 1985). Однако не так редки и двуслойные химеры. Таковы, например, Veronica gentianoides Vahl. var. albocincta — двудольная и Hosta sieboldiana Engl. f. albomarginata Hook. - однодольная двуслойная химера (Tilney-Bassett, 1963). Двуслойная туника встречается и у однодольных. Так, Дёринг на периклинальной химере ячменя (Hordewn vulgare L.) показал наличие двух апикальных слоев у этого растения, L1 и L2 (Doring, Lin et al, 1999). В целом, число слоев туники у двудольных может достигать 6, в некоторых случаях ее нет в принципе (Romberger, 1963).
Роль апикальных слоев меристемы в формировании тканей растения была показана на цитохимерах (Satina et al., 1940, цит. по Эсау, 1969; Satina, 1944). Были получены полиплоидные химеры Datura L. посредством обработки колхицином, апикальные слои которых были ди-, тетра- и октаплоидны. Работы Сатиной в целом поддержали концепцию гистогена с некоторыми изменениями: у двудольных слой туники L1 дает только эпидермис, а за образование внутренних тканей отвечают слои L2 и L3. Дермен говорит об участии трех слоев - LI, L2 и L3 в формировании листа у Oxycoccus Hill. (Dermen, 1947) и Mains Mill. (Dermen, 1951). LI, наружный, отвечает за образование однослойного эпидермиса, лежащие под ним L2 и L3 участвуют в формировании остальных тканей листа. При этом вклад каждого из последних двух слоев варьирует. Система жилок образуется в основном путем дифференциации паренхимных клеток, происхождение которых может быть различно, или является производной L2 либо L3. Край листовой пластинки часто формируется из слоя L2 PI центральной части L3 (Dermen, 1951). Несмотря на вариабельность развития следует отметить, что слои туники вполне различимы в формирующемся листе, по крайней мере L1, для которого было оценено соотношение антиклинальных и периклинальных делений, и оно составило »- Адаксиальная протодерма 1:3100 (Stewart, Burk, 1970). Это означает, что примордий по своим структурно-функциональным характеристикам подобен побеговой оси. Французскими морфологами предложена схема гистогенеза листа, основанная на идее подобия листового зачатка и побега. Почти весь листовой зачаток (кроме самой его базальной части) образован апикальной и субапикальной инициалями, вычленяющимися из наружного и внутреннего слоев туники. А.К. Тимонин (1984), поддерживая французских морфологов, говорит о подобии развития листового зачатка и побега в целом: примордий представлен слоями туники и обширным корпусом, играющим немаловажную роль в формировании листа. В современной литературе преобладает идея о детерминированной природе листа -привести примеры, дать ссылки!
Для Amaranthus L. предложена следующая схема (Тимонин, 1984): в тунике можно выделить 2 функционально активных слоя клеток, которые (в силу вышеуказанного подобия) обнаруживаются и в листовом зачатке. Покровные ткани раскрывшегося листа Amaranthus являются производными наружного слоя (L1, на схеме ТІ), а все остальные ткани листа формируются из внутреннего (L2, на схеме Т2).
Таким образом, участие слоя L3 апикальной меристемы в закладке листа варьирует в зависимости от объекта: у Datura, Oxycoccus и Malus в построении листа участвуют 3 слоя туники, тогда как у Amaranthus в закладке участвуют 2 слоя туники и корпус.
Молекулярно-генетические основы идентификации меристемы Как было сказано выше, меристема Покрытосеменных растений имеет постоянную структуру и состоит из клеток, находящихся в разной степени в недифференцированном состоянии. Однако регулярно образующиеся примордий листьев состоят из клеток, стоящих на пути дифференцировки. Логично предположить, что инициация примордия и отделениегруппыклетокдляегоформированиясопровождаетсянетолькоцитологическими и гистологическими перестройками, но и дифференциальной эксперссисй генов в меристеме и примордий. Поддерживать меристему в недифференцированном состоянии помогают гены группы KNOXy Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Hake etal., 1995), у кукурузы - KNOTTED (Jackson et al, 1994). Идентификаторами листа являются семейство генов YABBY, AS1 {A. thaliana), PHANTASTICA (Antirrhinum L.). Далее, после идентификации примордия, в процессе его закладки и развития, последовательно включаются различные факторы, определяющие его адаксиализацию (PHABULOSA (РНВ), PHAVOLUTA (PHV), REVOLUTA (REV)), форму (ROT, ANG), дифференциацию тканей (LAM1, DAG1) и т.д. (Leyser, Day, 2007).
Дифференцировка примордия (как и других органов растения) сочетает в себе два контрастных механизма, которые, тем не менее, совместно функционируют и поддерживают друг друга в ходе морфогенеза (Scheres, 2001; Golz, Hudson, 2002). Первый определяется наличием клеточных линий в меристеме, несущих всю необходимую информацию для формирования определенных типов тканей в определенных участках органа. Второй представляет собой влияние дифференцирующихся соседних клеток (клеточного окружения) на направление дифференцировки клетки.
При реализации первого механизма клетки поддерживают определенные направления клеточных делений, находясь в одном слое. Так, клетки маргинальной зоны примордия, делящиеся антиклинально, остаются преимущественно в одном клеточном слое, формируют далее мезофилл и, вероятно, принадлежат к одной клеточной линии (Golz, Hudson, 2002). Многочисленные исследования роли слоев туники при формировании листа (см. раздел 1.3) также подтверждают значение клеточных линий. Однако этот же ряд работ указывает на важность взаимного положения клеток при дифференцировке. Так, в большинстве случаев при наличии трех слоев туники мезофилл формируется из двух слоев - L2 и L3.
Экзогенная регуляция структуры и функциональной активности фотосинтетического аппарата
Изменения условий окружающей среды могут воздействовать на фотохимические реакции фотосинтеза и на метаболизм хлоропластов. Поэтому модуляция скоростей фотосиитетических процессов является неизбежным и необходимым ответом растений на внешние воздействия.
Свет является важнейшим фактором среды, оказывающим непосредственное воздействие на фотосинтетическую функцию растения. В связи с этим в растительном организме существуют механизмы регуляции в ответ на воздействия света. Они подразделяются на долговременные и кратковременные ответы. Первые включают в себя изменения в экспрессии генов, что влечет за собой изменения структуры фотосинтетического аппарата и листа в целом (Weston, Thorogood, Vinti et я/.,2000). Кратковременныеответыотражаютспособностьадаптироватьсякпостоянно меняющимся условиям освещения, они связаны с модуляциями активности существующего на данный момент фотосинтетического аппарата.
Известно, что даже при средних интенсивностях света скорость переноса электрона избыточна по сравнению со скоростью включения СО, в углеродные циклы. Это может привести к перевосстановлению ЭТЦ, что влечет за собой образование активных форм кислорода (АФК). Основной мишенью для АФКявляется ФСП, что связано с накоплением при высокой освещенности однократно восстановленных молекул первичного хинонного акцептора Q . Дальнейшее освещение стимулирует рекомбинацию зарядов с генерацией триплетного Р680 и дальнейшим образованием синглетного кислорода, разрушающего D1 белок (Ohad et al. 1988).
Существуют различные механизмы быстрой адаптации к условиям освещения. Первый способ-это активация антиоксидантных систем, нейтрализующих АФК, которые возникают при перевосстановлении ЭТЦ. Во-вторых, сенсором редокс-состояния ЭТЦ является пул пластохинонов: при перевосстановлении ЭТЦ стимулирующий миграцию CCKIIb от ФСП к ФСІ путем активирования киназы, фосфорилирующей ССК (Bennett, 1991). Это позволяет снизить долю квантов, достигающих ФСП. Третий способ является более важным для высших растений, чем первые два, это механизм нефотохимического тушения. Закисление внутритилакоидного пространства приводит к активации виолаксантиновой деэпоксидазы и переходу виолаксантина в зеаксантин, что в итоге увеличивает тепловую диссипацию квантов света. Кроме этого существует механизм тепловой диссипации квантов в самом РЦ ФСП, где тушащим центром служит окисленный Р680+. В норме время его жизни мало, но в условиях закислення внутритилакоидного пространства оно увеличивается. При повышении протонного градиента происходит высвобождение Са2+ из водоокисляющего комплекса, снижается скорость донирования электронов к РЦ ФСП, и время жизни P6g0+ увеличивается. Кроме этих механизмов, в целом представляющих собой реакции на снижение рН люмена, существует регуляция темновых реакций при помощи евсторегулируемых ферментов. Их активация связана с восстановлением ферредоксина и далее тиоредоксина на акцепторной стороне ФСІ. Это позволяет скоординировать реакции углеродных циклов, обеспечивающих использование восстановленных продуктов из ЭТЦ, со скоростью переноса электронов и общим редокс-статусом цепи, что снижает потенциальную возможность генерации АФК и последующих фотоповреждений (Бухов, 2004).
К долговременным ответам относятся перестройки фотосинтстического аппарата, включающие в себя также изменения состава и соотношения фотосинтетических пигментов, фотосинтетических систем, компонентов ЭТЦ. Известно, что количественное содержание пигментов в листе, их качественный состав и соотношение могут существенно меняться в ответ на изменения условий освещения, температуры, снабжения водой, условий минерального питания и других внешних факторов.
Показано, что состояние пигментного аппарата листа зависит от интенсивности и спектральных состава света и может служить индикатором адаптации фотосинтетического аппарата к условиям освещения. Необходимо также отметить, что соотношение хлорофиллов а и b является важным показателем структурного состояния фотосинтетического аппарата, поскольку хлорофилл b в основном сосредоточен в CCKII, и снижение его доли может свидетельствовать о повреждении антенных комплексов и изменении соотношения двух фотосистем (Lichtenthaler, 1987). Таким образом, качественный ті количественный составы пигментов могут служить структурно-функциональной характеристикой фотосинтетического аппарата растения.
Хлорофилл синтезируется и деградирует под действием света. В условиях сильного освещения деградация идет с большей скоростью, чем синтез, поэтому наблюдается более низкое содержание хлорофиллов. Концентрации хлорофиллов и каротиноидов служат индикаторами ответа растений на интенсивность света. Хлорофиллы подвержены фотоокислению под действием высоких интенсивностей. Поскольку каротиноиды способны предотвратить фотоповреждение хлорофиллов, соотношение между хлорофиллами и каротиноидами может быть показателем фотоокислительных повреждений, возникающих под действием высоких интенсивностей света (Hendry, Price, 1993, цит. по Goncalves et ai, 2001).
Энергия солнечного света запускает первичные фотохимические реакции, которые являются начальным звеном в цепи превращения энергии света. На слабом свету в оптимальных условиях первичные процессы протекают с высокой интенсивностью. Первичные процессы фотосинтеза включают в себя несколько стадий: поглощение энергии света пигментами, се миграция к реакционным центрам фотосистем, разделение зарядов, после чего осуществляется процесс переноса электронов по электронтранспортной цепи (ЭТЦ), что сопряжено с запасанием энергии в химических связях конечных восстановленных продуктов - НАДФН и АТФ. Для эффективного поглощения и миграции энергии света молекулы пигментов собраны в антенны и находятся в виде пигмент-белковых комплексов. В результате взаимодействия с белками хлорофилл меняет свои оптические свойства, что позволяет получить в составе антенны набор его спектральных форм, спектры поглощения которых перекрывают друг друга. Тем самым обеспечивается эффективная миграция энергии от антенных хлорофиллов к реакционным центрам.
Определение площади листа по изображению
Для регистрации кривых индукции флуоресценции хлорофилла в листьях F. benjamina DameV и F. benjamina Starlight использовали установку, собранную на кафедре физиологии растений биологического факультета МГУ, а также на флуориметре РАМ 100 в Институте Физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН.
Установка для регистрации индукционных кривых флуоресценции фотосинтезирующих объектов, собранная на кафедре физиологии растений биологического факультета МГУ, состоит из источника света, рабочей камеры, в ячейку которой помещают объект исследования (лист), и регистрирующей части.
Источник света и рабочая камера стационарно закреплены на штативе. Для снижения эффекта нагрева рабочей камеры от лампы между ними на штативе помещен кристаллизатор с дистиллированной водой. Верхняя часть (крышка) рабочей камеры с отверстием (d = 5 мм) снабжена съемной металлической заслонкой. Часть спектра светового потока с длиной волны 370 нм, попадающего в камеру через отверстие, отсекается светофильтром. Таким образом, спектрально ограниченный световой поток, попадающий в ячейку, освещает очень маленький участок листа, который находится непосредственно под отверстием. Это позволяет точно определить освещаемое место листа и снять с одного листа индукционные кривые как для зеленой, так и для белой зон. Необходимо отметить, что это важно именно для белой зоны, так как зачастую размер ее мал. Интенсивность светового потока на уровне отверстия — 550 мкмоль/м2 с.
В нижней части камеры, под ячейкой напротив отверстия и освещаемого участка листа соответственно, расположен фотодиод (фотодиод 1).
Камера снабжена блокировочным микровыключателем, отключающим фотодиод 1 при открытой камере, а также дополнительным фотодиодом (фотодиод 2) в крышке камеры, позволяющим контролировать световой поток, который проходит через образец.
К регистрирующей части установки относятся фотодиод 1, микровольтнаноампер-метр Ф-136, усилитель фотодиода 1 и самописец КСП-4. Запись индукционных кривых флуоресценции производили при скорости движения ленты 720 или 1200 мм/ч.
Чувствительность установки регулируется переключателем на микровольт-наноамперметре Ф-136 и переключателями на усилителе фотодиода.
Перед экспериментом каждое растение адаптировали в темноте в течение 15 минут. Всю дальнейшую работу проводили в темном помещении. Исследуемый лист помещали в рабочую камеру, при этом следили, чтобы средняя жилка не попала на отверстие. В случае К benjamina Daniel выбирали более или менее произвольное место листа, желательно ближе к центру. Если же освещали F. benjamina Starlight , то место листа, помещающееся напротив отверстия, выбирали в соответствии с целью получить кривую для белой или зеленой зоны. Мы избегали при этом попадания границы зон или переходной более светлой зоны. После этого закрывали рабочую камеру и сверху ставили заслонку, а все растение тщательно накрывали черной тканью во избежание засветки листьев. Включали лампу, запускали самописец и открывали заслонку. При освещении части листа, находящейся под отверстием, световой сигнал флуоресценции переводился в электрический и его можно было наблюдать как изменение силы тока на микровольтампернаномстре Ф-136. Сигнал регистрировали на ленте самописца в виде индукционной кривой флуоресценции (кривой Каутского). После выхода кривой на плато самописец останавливали, а лампу выключали и меняли лист, либо освещаемое место. С одного листа, если это было возможно, снимали 2 — 3 индукционных кривых, следя за тем, чтобы один и тот же участок не освещался дважды. Это можно было проконтролировать по самой индукционной кривой: засвеченный участок давал явное снижение главного максимума, это было подтверждено снятием индукционных кривых с одного участка несколько раз. Для F. benjamina Starlight во многих случаях было довольно трудно сделать несколько повторностеи с одного листа, поскольку отдельные зоны имеют меньшую площадь, чем целый лист и высока вероятность попадания в одну и ту же точку. Тогда старались сделать повторность с листа, близкого по размеру, возрасту и имеющего аналогичное соотношение белой и зеленой зон.
При обработке данных на ленте, полученной с самописца, измеряли параметры индукционной кривой для каждого варианта. В программе Microsoft Excel эти данные статистически обрабатывали: рассчитывали среднее значение параметра, стандартное отклонение и доверительный интервал, из чего делали вывод о достоверности различий между вариантами. При измерениях для вычисления параметра Fo использовали значение Fst в самой дальней точке вышедшей на плато кривой, поскольку высокие скорости начального подъема не позволяли измерить Fo обычным способом, а данный прибор не обладает возможностями создания освещения для фоновой флуоресценции.
Получение индукционных кривых на флуориметре РАМ 100. Общая схема устройства прибора РАМ 100 представлена на рис. 3.9.1.
Пара эмиттер-детектор (на схеме обведена пунктирной чертой) предназначена для генерации слабого возбуждающего света (эмиттер) и регистрации излучения флуоресценции (детектор). Эмиттером служит светодиод, испускающий модулированный с частотой 1,6 или 100 кГц свет с длиной волны 650 нм. Этот свет дополнительно
пропускается через светофильтр, отрезающий излучение светодиода с длиной волны, превышающей 680 нм. Детектором испускаемой объектом флуоресценции служит фотодиод. Светофильтр, который помещен перед детектором, пропускает только лучи с длиной волны большей 700 нм, предотвращая таким образом попадание на фотодиод рассеянного возбуждающего света. Таким образом, комбинация двух светофильтров обеспечивает спектральное разделение возбуждающего света и излучения флуоресценции хлорофилла.
Модуляция возбуждающего света осуществляется электрически посредством подачи на световод модулированного с частотой 1,6 или 100 кГц тока от генератора импульсов. Возбуждающий свет представляет собой последовательность одномикросекундных импульсов, разделенных в зависимости от выбранной частоты модуляции темновым промежутком в 625 микросекунд (1,6 кГц) или 10 микросекунд (100 кГц). Электрический сигнал от генераторапоследовательноусиливаетсяимпульснымиселективнымусилителя-ми. Последний работает синхронно с подачей на объект возбуждающих флуоресценцию хлорофилла микросскуидных световых импульсов, поскольку электрический генератор импульсов одновременно как формирует последовательность импульсов возбуждающего света, так и поддерживает несунгую частоту для селективного усилителя. Такой принцип усиления позволяет регистрировать только сигнал флуоресценции, модулированный с одной из двух вышеназванных частот, несмотря на присутствие в исходном сигнале от детектора значительной составляющей, связанной с возбуждением флуоресценции хлорофилла постоянным действующим светом
После усиления модулированный сигнал может быть преобразован в форму компьютерных asc-кодов с помощью специально разработанной для прибора РАМІ00 приставки Data Acquisition System PDA-100. Применение PDA-100 позволяет увеличить временное разрешение прибора до 20 микросекунд.
Организация апикальной меристемы побега пестролистной химеры Ficus benjamina 'Starlight'
Как было отмечено выше, белая зона молодого листа обладает жизнеспособными клетками с функционально активными хлоропластами. Однако практически сразу после окончания роста листа растяжением клетки мезофилла белой зоны начинают деградировать. Это может быть связано со сменой акцепторной функции листа на донорную. Следует подчеркнуть, что начало литических процессов мы видим в листе, еще не закончившем рост растяжением, что согласуется с моментом перехода листа в состояние донора по литературным данным (Мокроносов, 1983; Turgeon, 1989). Таким образом, можно предположить, что белая зона зрелого листа испытывает углеводное голодание, что ведет к частичной деградации клеток. Похожая картина описана при анализе автофагии клеток Acer pseudoplatanus L. в условиях углеводного голодания (Aubert et ai, 1996). Однако следует отметить длительность процессов деградации: она разворачивается в течение месяцев, тогда как по литературным данным это обычно происходит в пределах недели и менее (Aubert et ai, 1996; Toyooka, 2001, Гамалей, 2004). Этот факт, а также гетерогенность деградации клеток (см. предыдущий раздел) говорят о снабжении белой зоны фотоассимилятами. Исчезновение крахмальных зерен из клеток зеленой зоны зрелого листа указывает на участие зеленой зоны в этом процессе.
Метаболические особенности клеток на трансмиссионной электронной микроскопии простейшим образом проявляются в наличии крахмальных зерен, а также различных капель, предположительно липидного и /или липопротеидного состава, различающихся по электронной плотности. Эти различия проанализированы для белой и зеленой зон листа пестролистной химеры F. benjamina Starlight (рис. 4.5.2.1).
Белая зона молодого листа содержит, по меньшей мере, две различающиеся популяции пластид. Первая представлена хлоропластами со слабо выраженной граналыюстью. Они обычно не имеют в своем составе крахмальных зерен и липидных капель, их размер невелик: 0,6 - 0,8 мкм2 (рис. 4.4.3.1). Вторая популяция представлена амилопластами с крупными крахмальными зернами до 50% от площади пластиды на срезе. Для них же обычны электронноплотные капли, предположительно пластоглобулы, занимающие довольно большую площадь - до 30% от площади пластиды на срезе (рис. 4.4.3.2).
Хлоропласты зеленой зоны молодых листьев по своей структуре гранальны, иногда в них встречаются редкие крахмальные зерна (рис. 3.3.1). Практически во всех хлоропластах имеются крупные липидные капли с низкой электронной плотностью - до 31,3% от площади хлоропласта на срезе.
Интересен факт накопления крахмальных зерен в клетках белой зоны молодого листа. Одной из причин необычно сильного накопления крахмала может быть нарушение оттока фотоассимилятов (Гамалей, 2004; Абдрахимов и др., 2008). Однако в этом случае накопление начинается с клеток, близких к терминальному комплексу флоэмы, и деструктивные изменения, следующие за ним, развиваются от проводящих пучков в сторону мезофилла (Гамалей, 2004), а не наоборот, как мы видим в нашем эксперименте. Возможно, это связано с тем, что молодой лист является акцепторным органом, т.е., получаст сахара извне. Объяснить большее накопление крахмала в белой зоне по сравнению с зеленой при этом можно неоднородностью дифференциации тканей и созреванием пластид в разных участках листовой пластинки. Известно, что клетки по краю листа дифференцируются быстрее, чем в центральной зоне (Turgeon, 2005). Более того, показана зависимость созревания хлоропластов от близости к крупным жилкам: в центре, в области центральной жилки и вдоль отходящих от нее крупных жилок хлоропласты созревают медленнее, чем вдали от них, что, вероятно, связано с ингибиторным воздействием Сахаров на дифференцировку пластид (Walter et al, 2004). Следовательно, хлоропласты белой зоны по краю листа созревают быстрее и начинают фотосинтезировать в полную силу, когда фотоассимиляты еще продолжают поступать к молодому листу. Вероятно, в связи с подобными условиями начинается накопление крахмальных зерен.
Следует отметить следующую особенность: в зеленой зоне в составе пластид встречены исключительно капли с низкой электронной плотностью, в белой же зоне -только электронноплотные. Электронную плотность возможно сравнить в относительных единицах шкалы серого цвета, приняв белый за 0, а черный за 1 (или 100%), используя программу количественной обработки цифровых изображений ImageJ (см. разд. 3.4 «Объектов и методов исследований»). Данный метод позволил провести сравнительный анализ электронной плотности капель в белой и зеленой зонах (табл. 4.5.2.1).
