Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Роль симбиоза в процессе эволюции живых организмов 10
2.2. Разнообразие мутуалистических ризосферных симбиозов растений с микроорганизмами 16
2.3. Арбускулярная микориза 31
2.3.1. Значение арбускулярных микориз в экосистемах 31
2.3.2. История открытия и описания арбускулярной микоризы 32
2.3.3. Филогения и генетика грибов арбускулярной микоризы 34
2.3.4. Генетические исследования арбускулярной микоризы 36
2.3.5. Развитие арбускулярной микоризы 39
2.3.6. Физиология арбускулярных микориз, их влияние на питательный статус растений 47
2.3.7. Метаболическая интеграция растений и грибов арбускулярной микоризы 49
2.3.8. Роль арбускулярной микоризы в фосфорном питании растений 50
3. Материалы и методы 55
3.1. Растительный материал 55
3.2. Грибной материал 56
3.3. Вегетационный метод 58
3.3.1. Агрохимическая характеристика почвы 58
3.3.2. Подготовка и протокол экспериментов 58
3.3.3. Оценка продуктивности, содержания макроэлементов, пигментов и белков 60
3.3.4. Оценка симбиотической эффективности 61
3.3.5. Метод построения векторной математической модели развития симбиоза арбускулярной микоризы 62
3.4. Метод оценки морфотипов озимых форм 65
3.5. Оценка морфологических показателей микоризообразования 65
3.6. Оценка свойств фотосинтетического аппарата неинвазивным спектрометрическим методом in vivo 71
3.6.1. Оборудование и установка 71
3.6.2. Опытные варианты 73
3.6.3. Оценка изменений отражения листовых пластинок 74
3.6.4. Стандартные спектрометрические показатели 74
3.7. Статистический анализ результатов 79
4. Результаты и обсуждение 80
4.1. Сравнительный анализ микоризации различных форм люцерны хмелевидной 82
4.1.1. Морфологические особенности развития микоризы 82
4.1.2. Количественный анализ микоризации растений люцерны 88
4.2. Внутрипопуляционный полиморфизм по симбиотической эффективности люцерны хмелевидной с грибом G. intraradices' . 90
4.2.1. Показатели продуктивности и симбиотической эффективности люцерны хмелевидной с грибом G intraradices 90
4.2.2. Внутрипопуляционная изменчивость люцерны хмелевидной по эффективности симбиоза с грибом G. intraradices 94
4.3. Сравнительный анализ симбиотической эффективности различных линий п. Павловская со штаммом CIAM8 G. intraradices 110
4.4. Динамика показателей микоризации, продуктивности и интенсивности фотосинтеза линии S9m2 сп. ВИК32 люцерны хмелевидной 119
4.4.1. Динамика показателей микоризации 120
4.4.2. Отклик на микоризацию по показателям продуктивности 124
4.4.3. Отклик на микоризацию по содержанию пигментов и белков в листьях... 132
4.4.4. Неинвазивная оценка влияния микоризы на отражательную способность листовых пластин люцерны хмелевидной 140
4.4.5. Моделирование развития растений и арбускулярной микоризы, образуемой G. intraradices на быстроотзывчивой линии люцерны 154
5. Заключение 160
6. Список литературы
- Разнообразие мутуалистических ризосферных симбиозов растений с микроорганизмами
- Агрохимическая характеристика почвы
- Метод построения векторной математической модели развития симбиоза арбускулярной микоризы
- Внутрипопуляционный полиморфизм по симбиотической эффективности люцерны хмелевидной с грибом G. intraradices'
Введение к работе
Симбиоз представляет собой одну из основных форм существования жизни на Земле (Спайнк и др., 2002). Симбиотические взаимоотношения партнеров поддерживаются взаимной сигнализацией, приводящей к перекрестной регуляции генов, принимающих участие в контроле развития и поддержания симбиотических структур, а также общего метаболизма партнеров симбиоза (Тихонович, Проворов, 2004).
Глобальная роль разнообразия мутуалистических ризосферных симбиозов не оставляет сомнений. Наиболее распространенным из них является арбускулярная микориза (Smith, Read, 1997). Именно этому типу симбиоза отводят центральную роль в завоевании растениями суши -450 млн. лет назад (Pirozynski, Malloch, 1975; Каратыгин, 1993; Simon et al., 1993; Remy et al., 1994; Тихонович, Проворов, 2004).
Арбускулярная микориза (AM) является наиболее экологически значимой формой растительно-микробных взаимодействий, образуемой большинством наземных растений с грибами типа Glomeromycota (Schachtman, 1998; Renker et al., 2003). Считается, что AM -источник биоразнообразия фитоценозов (van der Heijden et al., 1998). На долю AM приходится не менее 20% объема круговорота веществ в наземных экосистемах (Каратыгин, 1993). В сельском хозяйстве AM является естественной альтернативой внесению больших количеств удобрений, в первую очередь фосфорных. Она может использоваться для восстановления нарушенных экосистем (Miller, Jastrow, 1992; Linderman, 1994; Gianinazzi, Schiiepp, 1994; Allen, 1996), а также оказывать общестимулирующее влияние на растения, в результате которого значительно возрастает урожайность сельскохозяйственных культур (Маршунова, Якоби, 1988). AM обладает оздоравливающим эффектом, защищая растение от корневых патогенов путем синтеза антибиотиков или субстратной конкуренции, либо за счет индукции иммунных реакций у растения-хозяина (Dehne, 1982; Caron, 1989; Linderman, 1994; Newsham et al., 1995; KJ0ller, Rosendahl, 1996; Marsh, Schultze, 2001). AM может изменять гормональный статус растений, влияя на содержание ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты и цитокининов (Allen, Allen, 1980; Danneberg et al., 1992; Allen et al., 1982).
К сожалению, несмотря на актуальность исследования такого полифункционального симбиоза, каким является AM, до сих пор механизмы формирования эффективных сообществ растений с АМ-грибами остаются неясными (Smith, Read, 1997). Симбиотические гены, ответственные за эффективность AM (под которой понимают прибавку продуктивности растений с микросимбионтом в сравнении с неинокулированными растениями) пока не идентифицированы.
В исследовании эффективности AM и механизмов ее формирования существует ряд сложностей. Продуктивность растений — признак комплексный и лишь часть факторов, его контролирующих, непосредственно связана с образованием AM. Кроме того, облигатность микосимбионта приводит к необходимости постановки экспериментов с применением различных почвенных субстратов, а потому значительно усложняет проведение "чистого" опыта на стерильном субстрате в отсутствии иных ризосферных симбионтов. В связи с этим слабо изученным остается отклик растений на моноинокуляцию эндомикоризным грибом в стерильных условиях.
Показано, что действие AM наиболее четко проявляется в том, что она способствует усвоению растениями труднорастворимого фосфора, а сорта, используемые в исследованиях эффективности AM, часто имеют ослабленную способность к симбиотрофному питанию фосфором, так как их селекция проводилась на хорошем агрохимическом фоне, при полном минеральном питании (либо при низком содержании азота в почве). Как результат, сорта растений оказались менее отзывчивыми и менее вариабельными при инокуляции АМ-грибами по сравнению с дикорастущими популяциями (Martennson, Rydberg, 1994; Якоби и др., 2000). Низкая симбиотическая эффективность коммерческих сортов (отсутствие у них ростового отклика) не позволяет выделить контрастные по эффективности растительные линии, следовательно, они не могут быть использованы для изучения эффективности AM. В связи с этим дикорастущие популяции могут представлять собой природный резерв симбиотических генов (Проворов, 1996).
Анализ литературных данных (Проворов, 1996; Якоби и др., 2000) позволяет предположить, что в качестве модельного объекта исследования может быть использована люцерна хмелевидная {Medicago lupiilina L.) как одна из наиболее широко распространенных и высокополиморфных форм рода Medicago (Степанова, 1998). Этот вид является самоопылителем, диплоидом и, тем самым, удобен для получения линейного материала. Кроме того, этот вид бобовых отличается высокой семенной продуктивностью, используется в качестве сидератов и возделывается как пастбищная и кормовая культура (Степанова, 1998).
Целью настоящего исследования является изучение особенностей развития люцерны хмелевидной при формировании арбускулярной микоризы с грибом Glomus intraradices в условиях отсутствия иных эндосимбионтов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи: 1. Охарактеризовать развитие арбускулярной микоризы у люцерны хмелевидной с АМ-
грибом Glomus intraradices;
2. Оцепить внутрипопуляционный полиморфизм по эффективности симбиоза люцерны
хмелевидной с АМ-грибом, отобрать модельные популяции и выделить линии люцерны хмелевидной, контрастные по отзывчивости на инокуляцию грибом арбускулярной микоризы;
3. Выявить особенности развития люцерны хмелевидной с грибом G. intraradices по
показателям продуктивности, содержания фосфора и интенсивности фотосинтеза, а также охарактеризовать взаимодействие партнеров в виде векторной модели развития симбиоза.
Научная новизна.
Установлено, что в условиях вегетационных опытов у всех популяций люцерны хмелевидной с эндомикоризным грибом Glomus intraradices образуется арум тип арбускулярной микоризы. Выявлена способность межклеточного мицелия G. intraradices проникать в зону растяжения клеток, вплотную подступая к зоне деления клеток кончика корня (сп. ВИК32), где гриб образует также арбускулы и везикулы. Такая интеграция партнеров свидетельствует о тесном, активном симбиотическом взаимодействии.
Впервые такие статистические параметры, как коэффициенты вариации, асимметрии и эксцесса использованы для предварительной оценки внутрипопуляционного полиморфизма по показателям эффективности AM, впервые исследован внутрипопуляционный полиморфизм люцерны хмелевидной по эффективности AM в условиях отсутствия ризобий. В результате выявлен высокий полиморфизм по эффективности AM в дикорастущей популяции Павловская. Впервые показано, что сортопопуляция ВИК32 является облигатно-микотрофной формой. В настоящей работе отобраны быстроотзывчивая на микоризацию линия люцерны хмелевидной и линии, контрастные по симбиотической эффективности с АМ-грибом G. intraradices.
На линиях п. Павловская люцерны хмелевидной впервые выполнено исследование действия инокуляции растений АМ-грибом на содержание макроэлементов (N, Р и К) в растениях, а также выявлены взаимосвязи между различными показателями продуктивности, эффективности, содержания макроэлементов и микоризации. Показана оптимизация фосфатного питания растений и отрицательная эффективность по содержанию азота в растении.
Для люцерны хмелевидной модифицированы спектрометрические индексы отражения листовых пластин, позволяющие проводить неинвазивный анализ активности фотосинтеза с помощью современного спектрометрического оборудования. Этим методом
впервые показан более ранний отклик на микоризацию по фотометрическим показателям по сравнению с биохимическими показателями интенсивности фотосинтеза.
Впервые проведено обобщение данных взаимодействия партнеров АМ-симбиоза в виде векторной математической модели развития растений люцерны и развития AM с участием эндомикоризного гриба Glomus intraradices.
Практическая значимость.
Автором диссертации разработана программа расчета и анализа основных характеристик микоризации, адаптированная для работы в ОС Windows ХР (УДК 581.557.27: 681.3.06), которая в интерактивном режиме указывает степень завершения микроскопии при достижении заданной точности (Yurkov et al., 2006), что имеет научно-практическое значение. Программа может быть использована как в российских, так и в зарубежных лабораториях по исследованию AM.
Выполнен морфотипический анализ популяций люцерны хмелевидной. Результаты могут послужить основой для составления признаковой коллекции люцерны хмелевидной и ее идентификации по морфометрическим показателям на внутривидовом уровне во ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова.
Контрастные по симбиотической эффективности линии люцерны рекомендованы для выявления генов, задействованных в механизмах регуляции эффективности микоризного симбиоза высших растений и АМ-грибов, а также для изучения молекулярных механизмов симбиотрофии.
Семена полученных линий люцерны хмелевидной, контрастных по эффективности AM, переданы в коллекцию ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Линии с высоким симбиотическим потенциалом рекомендованы к созданию высокопродуктивных симбиотических систем «растения-микроорганизмы». Использование сортов с высокой симбиотической активностью позволит снизить нормы минеральных удобрений и сделать производство сельскохозяйственной продукции экологически безопасным.
По материалам исследования готовится методическое пособие по получению высокопродуктивных сортов, обладающих высокой симбиотической эффективностью с АМ-грибами.
Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе: в курсах лекций по "Общей биологии", "Геоэкологии" в РГГМУ и в курсе "Симбиогенетиика" в СПбГУ.
Патентоспособность результатов исследования
Патентоспособностью обладают:
высокоэффективный штамм АМ-гриба Glomus intraradices CIAM8 для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения фосфорного питания растений, а также технология его применения;
программа расчета характеристик микоризации - Mycorriza 1.0 (УДК 581.557.27: 681.3.06), разработчиком которой является Юрков А.П. Программа рассмотрена и утверждена на заседании методической комиссии по экологии почвенных микроорганизмов (протокол №16 от 15.05.05 ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии). Программа способна автоматически в интерактивном режиме указывать степень завершения микроскопии AM при достижении заданной точности. Это позволяет наиболее эффективно планировать эксперименты, экономия времени составляет в среднем 50% от времени проведения анализа. Mycorriza 1.0 — первая программа расчета и анализа основных характеристик микоризации, адаптированная для работы в ОС Windows ХР.
Разнообразие мутуалистических ризосферных симбиозов растений с микроорганизмами
Общеизвестными типами мутуалистических ризосферных симбиозов растений с микроорганизмами являются микоризный, бобово-ризобиальный симбиозы и симбиозы со свободноживущими микроорганизмами. К последним относят симбиозы высших растений с ризобактериями, стимулирующими рост растений, — PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobactena). Это ассоциативные симбиозы (эктосимбиозы), при которых не наблюдают проникновения одного из партнеров в другого (Проворов, 2001). Ризосферные /Ч РЯ-бактерии оказывают либо прямое действие на растения, т.е. могут улучшать развитие растений, благодаря фиксации атмосферного азота, синтезу фитогормонов, обеспечению растений фосфором (HiPOi), запуску реакции сверхчуствительности; либо косвенное действие, т.е. обеспечивают выделение ферментов, антибиотиков против патогенных для растения организмов, а также занятие корневых волосков, поверхности эпидермальных клеток и любых иных зон первичного контакта — симбиотического взаимодействия с корнями растений, т.е. создание конкуренции с патогенами за субстрат (Lambert, Joos, 1989; Glick, 1995; Raupach et al., 1996). Известно, что в процессах нитрификации участвуют такие ассоциативные бактерии как Nitrosomonas, Nitrococcus (окисление NHs до NC 2 ) и Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus (окисление NOf до ЫОз ), а в процессах аммонификации - гнилостные и уробактерии (восстановление Ыорг до NH4+). К денитрификаторам (восстановление NOf до Л ), метаболизирующим при низкой концентрации кислорода, относят такие бактерии как Bacillus, Pseudomonas. Свободноживущими фиксаторами молекулярного азота (окисление N2 до ЫОз ) являются бактерии родов Azotobacter, Azospyrillum, Bacillus, Bejerinkia, Derxia, Klebsiella, некоторые штаммы Clostridium, цианобактерии родов Anabaena, Calothrix, Gloeothrichia, Nostoc, фотосинтезирующие бактерии родов Chromatium, Rhodospirillum, архей Methanococcus (Vallad, Goodman, 2004; Walter, Vega, 2007). Модельным объектом многих исследований служат бактерии рода Azospirillum (Bashan, 1999; Steenhoudt, Vanderleyden, 2000; Dimova, Volkogon, 2003).
Отметим, что не все из этих симбиозов являются корневыми. Так, симбиоз травянистых растений рода Gunnera с цианобактериями рода Nostoc, является надземным, поскольку цианобактерии образуют клубеньки на стеблях растения-хозяина. А фиксирующие азот цианобактерии рода АпаЬаепа поселяются в полостях листьев водного папортника Azolla (Rai et al., 2003). Цианобактерии как Nostoc, так и АпаЬаепа в симбиозе с голосемянными Cycas заполняют первичную кору корня и образуют коралловидные корни, функцией которых является фиксация азота (Singh et al., 2004).
Актиноризный симбиоз двудольных небобовых растений с азотфиксирующими актиномицетами рода Frankia (к актиномицетам относят грамм-положительные бактерии 8 семейств, образующие клетки и гифы с истинным ветвлением: микобактерии, нокардии, стрептомицеты, Actinomycetaceae, Frankiaceae, Actinoplanaceae, Dermatophilaceae, Micromonosporaceae) (Baker, 1987; Oakley et al., 2004). В результате симбиоза из перицикла (зачатка бокового корня растения-хозяина) формируется симбиосома - азотфиксирующий клубенек (Ni— -NH/) с корневой топологией (с центральным проводящим пучком), например, у ольхи, восковницы, лоха, облепихи и других в основном древесных растений. Насчитывается более 200 видов небобовьгх растений, которые способны в симбиозе с микроорганизмами фиксировать молекулярный азот (рода Alnus, Casuarina, Ceanothus, Coriaria, Discaria, Elaeagnus, Hippophaea, Myrica, Schepherdia) (Ukmura, 1964).
Бобово-ризобиальиый симбиоз. Бобово-ризобиальный симбиоз образуется между растениями семейства бобовых (Fabaceae, 16000-19000 видов) (Allen et al., 1980) и ризобиями (клубеньковыми бактериями) как минимум 5 родов из а-подгруппы протеобактерий: Mezorhizobium, Synorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium,» Rhizobium (Новикова, 1996). Данный симбиоз является мутуалистическим, биотрофным и специфичным, т.е. отдельно взятый вид или даже биотоп бактерии образует симбиоз лишь с одним или малым количеством видов растений-хозяев семейства бобовых.
В бобово-ризобиальном симбиозе формируется специальный симбиотический орган — симбиосома - фиксирующий азот клубенек на корнях бобового растения. Формирование клубеньков инициируется сигнальными молекулами липоолигосахаридной природы — Nod-факторами, которые синтезируются ризобиями в ответ на определенные виды флавоноидных соединений, выделяемых семенами и корнями бобовых растений (Борисов и др., 1998). Именно специфичность рецепции этих флавоноидных соединений определяет специфичность образования бобово-ризобиальных симбиозов. Например: Род Mezorhizobium - быстрорастущие бактерии — образуют симбиоз с такими культурами как люпин, лядвенец (например, Lotus japonicus с Mezorhizobium loti) (Trevaskis et al., 2002). Род Synorhizobium - быстрорастущие бактерии - образуют симбиоз с такими культурами как люцерна (например, Medicago sativa с S. meliloti) (Kowalski et al., 2004), соя (например, Glycine max с S.fredii) (Bellato et al., 1997), донник, пажитник (Проворов, Аронштам, 1991). Род Azorhizobium — быстрорастущие бактерии - образуют симбиоз с такими культурами как Sesbania Scop., Aeshynomene L. (образование клубеньков на корнях и стеблях, например, у Sesbania virgata с Azorhizobium johannense) (Moreira et al., 2000). Род Rhizobium - быстрорастущие бактерии - образуют симбиоз с такими культурами как горох (например, Pisum sativum с R. leguminosarum bv. viceae) (Appels, Haaker, 1988), клевер (например, Trifolium pratense с R. leguminosarum bv. trifolii) (Biaek et al., 1995), фасоль, козлятник, вика, чечевица, горошек, лядвенец, нут, маш, арахис. Род Bradyrhizobium - медленнорастущие бактерии — образуют симбиоз с такими культурами как соя (например, Glycine max с В. japonicum) (Smith, Wollum, 1989), люпин, лядвенец, нут, маш, арахис.
Агрохимическая характеристика почвы
Рассмотрим роль AM в фосфорном питании растений. Гены АМ-грибов, контролирующие энергетический обмен между партнерами, обладают различной экспрессией в разных частях гриба. Так, по данным Б. Баго с соавт. во внутрикорневых гифах наиболее активны ферменты глиоксилатного цикла (синтез липидов), а во внекорневых гифах - ферменты цикла трикарбоновых кислот, обеспечивающие энергией процессы осмотрофного питания и спороношения (Bago et al., 2000).
В связи с высокой энергоемкостью развития и функционирования AM, часто возникает вопрос о целесообразности ее использования для питания растений. Хотя микобионт потребляет до 20-30% продуктов фотосинтеза, это не означает, что образование микоризы ухудшает энергетический статус растений. По результатам исследований коллективов И. Паради и М. Шенг инфицирование растений АМ-грибами повышает активность фотосинтеза (содержание хлорофилла, площадь листовой поверхности, скорость фиксации СОг), а также усиливает приток его продуктов в корни (Paradi et al., 2003; Sheng et al., 2008). Однако подача растению эквивалентного количества фосфорных удобрений не приводит к стимуляции фотосинтеза. Поэтому для растения в 10-100 раз энергетически выгоднее поддержать микоризу, чем развивать эквивалентную ассимилирующую активность корней.
Показано, что образование AM повышает интенсивность поглощения фосфора корнями фитобионта в 3-4 раза, причем до 80% поглощаемого фосфора приходится на микосимбионт (Schachtman et al., 1998; Hahn, Mendgen, 2001). Таким образом, АМ-грибы являются поставщиками для растений растворимых фосфатов, которые извлекаются наружным мицелием из нерастворимых минералов за счет высокой адсорбирующей активности мицелия, а также благодаря его способности растворять недоступные для питания растений формы фосфора за счет выделения органических кислот и кислых фосфатаз. Показано, что неорганический фосфор (Р,) составляет лишь около 20% от суммарного почвенного фосфора, а растение способно получать из ризосферы только 8% Р/ без помощи АМ-гриба (Schachtman et al., 1998; Harnett, Wilson, 2002). Слабая способность растений к поглощению объясняется тем, что в отсутствии микоризы у поверхности корня и корневых волосков, где происходит активное поглощение фосфора, образуется зона истощения с низким содержанием этого элемента (радиусом в 1-2 мм) (Zhu et al., 2001; Smith et al., 2003). Развитие внекорневого мицелия существенно увеличивает радиус зоны поглощения (до 15 см). При этом мицелий гриба 100-кратно увеличивает абсорбирующую поверхность корня (Smith, Read, 1997). Растение-хозяин и микосимбионт формируют развитую сферу взаимодействия с почвенным субстратом (зона диаметром от 10 до 150 мм вокруг корня), называемую микоризосферой (Rambelli, 1973; Linderman, 1988, 1994; Vancura et al., 1989; Smith et al., 2003).
Следует отметить, что некоторые виды растений в ответ на недостаток фосфатов способны развивать специальные протеоидные корни. Эти корни выделяют большое количество органических кислот, которые за счет окисления мобилизуют почвенный фосфор, переводя его в доступные для питания растений формы. При этом на функционирование протеоидных корней расходуется до 23% энергии фотосинтеза (Schachtman et al., 1998).
Эффект от инокуляции растений АМ-грибами наиболее выражен на почвах, бедных доступными соединениями фосфора, тогда как в присутствии растворимых фосфатов развитие грибов в корне подавлено. С использованием изотопных методов ( 3Р-мечение) показано активное поглощение ортофосфата АМ-грибами и его передача растению-хозяину (Smith et al, 2003).
Транспорт фосфора в мицелий гриба из почвы происходит, главным образом, в форме ионов Н2РО4 (в меньшей степени НРО4 ) посредством белков-переносчиков, обладающих высоким сродством к фосфату (Schachtman et al., 1998). У АМ-грибов выявлено 2 гена, кодирующие белки-транспортеры фосфора (GVPT — от Glomus versiforme Phosphorus Transporter и G;PT - от Glomus mtraradices Phosphorus Transporter), которые переносят фосфор из почвы в гифу (Rausch et al., 2001; Rausch, Bucher, 2002; Karandashov, Bucher, 2005). Выявлено также 2 гена белков-транспортеров растения, которые переносят фосфор из почвенного раствора в клетки корня, а именно Phtl;l или LePTl (Lycopersicum esculentum Phosphorus Transporter), а также Phtl;2 (или LePT2). Они были идентифицированы у растений томатов. Кроме того, выявлен ген белка-транспортера (Phtl;3), который осуществляет транспорт фосфора из периарбускулярного пространства в цитоплазму растительной клетки, однако, до сих пор не выявлены транспортеры фосфора из арбускулы АМ-гриба в периарбускулярное пространство (рис. 17) (Rausch, Bucher, 2002; Karandashov,
Метод построения векторной математической модели развития симбиоза арбускулярной микоризы
Спектральные измерения проведены с помощью оптоволоконного автоматизированного спектрометра AvaSpec (Avantes B.V., Netherlands). Спектрометр (рис. 26) способен измерять свет в диапазоне 300-1000 нм с разрешением от 0,04 нм. Задание автоматизированных режимов работы спектрометра и обработка результатов измерений в режиме реального времени поддерживается программным обеспечением AvaSoft. Для определения особенностей поглощения света основными пигментами, участвующими в фотосинтезе - хлорофиллами и каротиноидами, был выбран диапазон 400-800 нм.
Схема измерительного комплекса оптоволоконного спектрометра AvaSpec На схеме: 1. блок питания (6,8 А, 7 V); 2. галогенная лампа КГМ-9 (70 Вт); 3. конденсор; 4. диафрагма; 5. дихроическое зеркало; 6. столик-препаратоводитель; 7. "красный" широкополосный фильтр; 8. коллиматор окулярной приставки ОЛК-2У42; 9. коллиматор AvaSpec; 10. оптоволоконный кабель; П. спектрометр AvaSpec; 12. компьютер.
Источником света служила галогенная лампа КГМ-9 (70 Вт). В качестве осветителя использован стандартный опак-иллюминатор микроскопа ЛЮМАМ-К (ЛОМО, СПб., Россия), в состав которого помимо лампы входит конденсор, диафрагма и дихроическое зеркало, направляющее свет вертикально вниз на горизонтальную поверхность столика-препаратоводителя, где располагались свежесрезанные листья растений в 50 мм от дихроического зеркала (рис. 27). Свет, отраженный от поверхности листьев, поступал вверх через дихроическое зеркало и "красный" широкополосный фильтр в коллимационную систему окулярной приставки ОЛК-2У42 и фокусировался на срезе оптоволокна спектрометра AvaSpec.
В пилотных экспериментах было установлено, что, несмотря на единую качественную картину спектра отражения от листовых пластин, амплитудные значения в широком спектре колебались в пределах единиц процентов в зависимости от конкретного листа и его ориентации. Чтобы избежать разброса данных, вызванного индивидуальными анатомическими и геометрическими факторами листовых пластинок, анализу подвергались одновременно 12 листьев каждой экспериментальной серии. Листья укладывались на столике в произвольной ориентации сплошным "покровом" 0 15 мм, соответствующим по площади пятну отъюстированного света. Столик поворачивали вокруг оптической оси - центра "укладки" для снятия погрешности, вызванной направлением роста ворсинок листа, длина которых составляла 900 мкм (при толщине ворсинок 10 мкм, тощине листа 90 мкм и размере поверхностных клеток листа 30 мкм, а клеток мезофилла 20 мкм). Для каждой такой "укладки" спектр отражения регистрировался через каждые 45 оборота столика (рис. 27.Ь). Спектральные сканы 8-ми соответствующих позиций корректировались по темновому току прибора, нормировались по эталонному отражателю (тефлон) и усреднялись.
Анализировали листья 4 типов растений. Iй тип - растения, выросшие без микоризы и при низком содержании фосфора в почве (М Р ), 2 тип - растения без микоризы, выросшие на почве со средним (с добавлением в почву 1 дозы Р2О5 по Д.Н. Прянишникову) содержанием фосфора (М Р+), 3й и 4й тип - растения с микоризой (инокуляция штаммом CIAM8 эндомикоризного гриба G. intraradices) на почве с низким и средним содержанием фосфора (М+Р и М+Р+, соответственно). Выбранные сроки анализа соответствовали стадиям полного развития листьев контрольных растений (М Р+) от "округлого" (0) до "четвертого" (4). Анализировали два поколения растений — весеннее и летнее. В приложении 1 представлена временная последовательность экспериментов с указанием сезона и стадии формирования листьев.
Оценка изменений отражения листовых пластинок. При обработке данных изменения отраженного света от листьев, вызванные микоризацией и/или добавкой фосфорного удобрения в почву, определялись в сравнении с отражением от поверхности тефлона (Rx, %), а также в сравнении с контрольной группой М Р (Рх, %) для каждой стадии развития растений. Расчетными формулами являются следующие: [Samplex]-[Darkx-\lQm (П) [TeJIonA]-[DarkJ Ря= 100% (18) RXc где [Samplex] - абсолютное значение отражения от поверхности образца на длине волны Л в ед. Avantes, [Teflonx] - абсолютное значение отражения от поверхности тефлона на длине волны Я в ед. Avantes, [Darkx] — абсолютное значение темнового тока на длине волны Я в ед. Avantes, Rx (Reflectancex) - абсолютное значение величины отражения опытного образца для данной длины волны X или интегрированное амплитудное ее значение для узкого волнового диапазона, Rxc (Reflectancexeontrod отражение контрольного образца для той же длины волны (или того же диапазона длин волн), Рх - относительная характеристика изменения светоотражения исследуемыми пигментами. Помимо характеристики Рх для спектральных областей, соответствующих поглощению света хлорофиллами и каротиноидами оценивались стандартные расчетные показатели.
Были рассчитаны и проанализированы наиболее устойчивые индексы, характеризующие интенсивность фотосинтетических процессов по спектру отражения листовых пластин: 7 хлорофильных {ChlNDI, ChlNDIml, NDVI, ChlNDh, XRE, ChlNDh, ChlNDIm[2), 4 каротиноидных {CRIrededge, CRIgreen, CRImn, CRImti) и 2 фотохимических показателя (PRI, PRImi).
В настоящее время существует огромное разнообразие спектрометрических показателей, которое указывает на отсутствие отработанной расчетной схемы для неинвазивного определения содержания пигментов в листовых пластинах.
Внутрипопуляционный полиморфизм по симбиотической эффективности люцерны хмелевидной с грибом G. intraradices'
В связи с тем, что основное действие AM на растение связано со значительным поступлением фосфатов от микосимбионта в корни растения-хозяина (Smith, Read, 1997), эксперименты поставлены на почве с низким уровнем Р,. Исследован полиморфизм по показателям продуктивности и интенсивности микоризации растений. Для оценки эффективности микоризного симбиоза проведена оценка индивидуальных растений по таким показателям продуктивности, как: средняя высота, кустистость (число стеблей), сухая биомасса (стебли + корни). Под симбиотической эффективностью AM понимается прибавка по анализируемым показателям продуктивности, определяемая действием микосимбионта.
Все исследуемые образцы люцерны были отзывчивы на инокуляцию эндомикоризным грибом Glomus intraradices (табл. 8). Полученные данные о высокой отзывчивости согласуются с результатами, полученными СЕ. Смит с соавт. на люцерне стволовидной (М truncatula Gaertn.) (Smith et al., 2003). Эффективность АМ-симбиоза достоверно значима на 88-е сут от посева по всем показателям продуктивности на 0,1% и 5% уровнях значимости, о чем свидетельствует оценка достоверности различий средних значений показателей продуктивности по ґ-критерию Стьюдента (приложение 3-4).
Такая высокая симбиотическая эффективность растений объясняется их низкой адаптацией к условиям роста без микоризы, т.е. к неблагоприятным стрессовым условиям низкого содержания Р, в почве (Tsimilli-Michael, Strasser, 2002). Сравнительный анализ эффективности свидетельствует о резких различиях между формами люцерны хмелевидной по продуктивности (приложение 5). Наиболее контрастно эти различия выражены между яровой и озимыми формами (рис. 36). С одной стороны, более высокую симбиотическую эффективность яровой люцерны можно было бы связать с большей интенсивностью ее метаболизма в сравнении с озимой. Однако известно, что некоторые многолетние виды, особенно из рода Fragaria (земляника), также обладают подобной высокой отзывчивостью на инокуляцию АМГ в условиях низкого уровня Р, (Mosse, 1953). С другой стороны, высокая отзывчивость сортопопуляции ВИК32 на микоризацию (30-кратная прибавка по массе, рис. 37) наиболее вероятно является результатом ее слабой адаптации к низкому содержанию доступного для питания растений фосфора в почве (приложение 3). Одним из первичных механизмов такой высокой отзывчивости люцерны может быть адаптация растений к низкому уровню фосфора в почве за счет активации грибом AM секреции фосфатаз растения-хозяина (Ezawa et al., 2005), а среди вторичных механизмові можно выделить гидролиз внекорневыми гифами AMF почвенного органического фосфора (Koide, Kabir, 2000), который затем посредством фосфорных транспортеров поступает в корни растения-хозяина (Karandashov, Bucher, 2005). По-видимому, растения озимых форм без микоризы более адаптированы к низкому содержанию Р, в почве, имея средние прибавки в 40,9-73,2% (рис. Зб.а-в).
Сравнивая эти данные с эффективностью, рассчитанной СЕ. Смит с соавт. для различных видов растений и грибов, отметим, что эффективность инокуляции грибом G. intraradices также была высокой и составила при расчете по сухой массе льна {Linum usitatissimum L. cv. Linetta) -1425%, а по сухой массе люцерны (Medicago truncatula Gaertn. с. Джемалонг) - 220% (Smith et al., 2003). Тем не менее, для томата {Lycopersicon esculentum Mill. с. Рио-Гранде 76R) инокуляция АМ-грибом не влияла на массу растения. G. intraradices способен и подавлять рост растений некоторых видов в тех же условиях, как было показано на пшенице (ТгШсит aestivum) (Li et al., 2008).
Высокая отзывчивость сп. ВИК32 подтверждена многолетними экспериментами (2003-2007 гг.), проведенными нами. Было показано, что контрольные растения (без микоризы) в условиях низкого уровня доступного фосфора в почве имеют признаки карликовости: слаборазвитую корневую систему, измельченный лист, укороченный стебель и отсутствие кущения (рис. 36). Все это говорит о том, что сортопопуляция ВИК32 является облигатно-микотрофной формой в условиях низкого содержания Р/ в почве.
Для того, чтобы использовать популяции люцерны хмелевидной в исследовании развития АМ-симбиоза и выявления взаимосвязей между развитием растений и развитием AM необходимо доказать, что среди них есть контрастные по отклику на микоризацию линии, т.е. линии, которые по-разному откликаются на инокуляцию АМ-грибом. Это позволит выявить и сравнить развитие высоко- и низкоотзывчивых на микоризацию линий люцерны.
Для выявления полиморфизма люцерны по симбиотической эффективности нами использованы следующие статистические параметры: коэффициент вариации (Cv), асимметрия1 (As) и эксцесс (Ех). Эти критерии были использованы ранее Н.А. Проворовым с соавт. при анализе бобово-ризобиального симбиоза люцерны посевной (М sativd), изменчивой (М. varia) и желтой (М. falcata) (Проворов и др., 1987). Результаты статистического анализа авторов указывают на высокий межпопуляционный полиморфизм люцерны по симбиотической эффективности со штаммом СХМ1 Rhizobium meliloti и на возможность отбора растений, контрастных по отзывчивости на инокуляцию ризобиями. Такой подход был использован и позднее при оценке внутривидового полиморфизма люцерны по! симбиотической эффективности с ризобиями (Provorov, Simarov, 1990; Танривердиев и др., 1995). Аналогичных данных о внутрипопуляционном полиморфизме каких-либо видов растений по эффективности AM в литературе не обнаружено.
Статистические параметры изменчивости показателей продуктивности люцерны хмелевидной. Для оценки влияния микоризации на изменчивость образцов определены коэффициенты вариации (Cv) по кустистости, высоте и сухой биомассе. Cv у всех проанализированных образцов имели высокие значения как в контроле (без AM), так и в опыте с инокуляцией G. intraradices, кроме микоризованных растений сп. ВИК32 (рис. 38, табл. 9).
Мы предполагали, что если отзывчивость всех растений внутри популяции одинакова, то микоризация меняет лишь средние значения показателей продуктивности, но не меняет параметры их изменчивости, и популяционная структура также остается неизменной. Напротив, изменения данных статистических параметров могут свидетельствовать о наличии внутрипопуляционного полиморфизма по симбио гической эффективности.
Анализ полученных данных позволяет заключить, что высокое значение Cv указывает на наличие высокого полиморфизма по показателю продуктивности, для которого он был рассчитан, а достоверная разница между Cv в контроле и в опыте (в табл. 9 — это ячейки, отмеченные серым цветом) свидетельствует о наличии полиморфизма по эффективности AM, рассчитанной по показателю продуктивности.
