Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1. Химический состав клеточной стенки 8
2. Формирование компонентов клеточной стенки 10
3. Клеточная стенка растений в экстремальных условиях существования 12
4. Углеводные соединения как основной субстрат для формирования клеточной стенки 21
5. Углеводные соединения растений в условиях действия промышленных поллютантов 28
Глава II. Объекты и методы исследования
1. Эколого-биологические особенности ели сибирской (Picea obovata Ledeb.) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) 36
2. Характеристика выбросов Мончегорского комбината "Североникель" 40
3. Объекты исследования и методика сбора образцов 42
4. Методы исследования 45
5. Статистическая обработка данных 49
Глава III. Содержание основных загрязняющих веществ в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. в условиях действия Мончегорского ГОКа
1. Содержание серы в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb., произрастающих на разном расстоянии от источника загрязнения в период интенсивного роста и после его окончания 50
2. Содержание тяжелых металлов в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb., произрастающих на разном расстоянии от комбината в период интенсивного роста и после его окончания 53
3. Содержание серы и тяжелых металлов в хвое деревьев Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. разного жизненного состояния 59
Глава IV Клеточные стенки хвои Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. в зоне действия Мончегорского комбината "Североникель" 61
Глава V. Углеводные соединения в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. в зоне действия Мончегорского комбината "Североникель"
1. Динамика содержания углеводов в хвое Pinus sylvestris L. в связи с фазами роста в условиях действия атмосферного загрязнения 77
2. Содержания углеводных соединений в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. в период окончания роста в условиях действия промышленного загрязнения 86
3. Зависимость содержания углеводных соединений в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb. от категории жизненного состояния деревьев 94
Глава VI. Обсуждение 106
Заключение 118
Выводы 120
Список литература
- Клеточная стенка растений в экстремальных условиях существования
- Углеводные соединения растений в условиях действия промышленных поллютантов
- Характеристика выбросов Мончегорского комбината "Североникель"
- Содержание тяжелых металлов в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb., произрастающих на разном расстоянии от комбината в период интенсивного роста и после его окончания
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важных отличительных особенностей растительной клетки является наличие целлюлозно-пектиновой клеточной стенки, которая имеет как функциональную, так и структурную значимость. Основные ее компоненты - это углеводные производные: целлюлоза, гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Клеточная оболочка в значительной степени определяет форму клеток и текстуру ткани (Каткевич, Милютина, 1972; Dasson et. al., 2001; Gu et. al., 2001), содержит регуляторные молекулы, которые контролируют рост и развитие растений (York et al, 1986 по Лозовая, 1987; Fry, 1994; Fry et. al., 1990), играет большую роль в поглощении и передвижении воды и ионов (Саляев, 1969; Полевой, 1989; Schreiber et. al, 1999).
Клеточная стенка является той структурой клетки, через которую осуществляется взаимосвязь растительного организма со средой. Ее значимость усиливается в экстремальных климатических условиях и в условиях загрязнения среды (Саля-ев, 1969; Полевой, 1989; Заботин и др., 1995; Горшкова, 1999; Wierzbickaa, 1998; Vasquez , Leonardi, 1999; Macfie, Welbourn, 2000).
В настоящее время достаточно хорошо изучены различные аспекты строения, формирования клеточной оболочки, химического состава и функциональной активности, как в условиях нормы, так и в условиях, отличающихся, по каким -либо естественным факторам от оптимума, (Можейко, Сергеева, 1957; Одинцов, Каткевич Р.Г., 1965, 1972 а, б; Одинцов и др., 1967; Саляев, 1969; Гамалей, 1970, 1972; Степаненко, Морозова, 1970; Закис и др., 1972; Каткевич Ю.Ю., Милютина, 1972; Васильев, 1984; Тарчевский, Марченко, 1985; Лозовая, 1987; Даффус К., Даффус Дж., 1987; Полевой, 1989; Заботин и др. 1995; Горшкова, 1999; Fry, 1982, 1995; Bolwell 1988; Iraki et.al. 1989; Carpita et.al. 1990; Delmer, Amor 1995; Amor et.al. 1995; Kutschera, 2001).
Слабо изученным остается реакция, как структуры, так и функционального состояния растения на антропогенное загрязнение, в частности, в условиях сильного промышленного воздействия. Именно, от состояния клеточной оболочки может зависеть реакция целого организма. Что касается различных соединений углеводной природы, представляющих собой субстратную основу для формирования ком-
понентов клеточной стенки, то в литературе имеется достаточно противоречивая информация об их поведении в условиях загрязнения. Имеющаяся литература свидетельствует о большой значимости локальных условий, которые складываются из типа, силы и длительности действия промышленного загрязнения, зональных и локальных климатических условий, типа фитоценоза и ландшафтных условий произрастания растения. Поэтому простое перенесение закономерностей, выявленных в различных экспериментальных условиях, не совсем корректно и требует уточнения. Особого внимания заслуживают промышленные комбинаты длительно функционирующие, с высоким уровнем загрязнения среды в условиях повышенной напряженности климатических факторов. Именно такими условиями характеризуются промышленные объекты Кольского полуострова, в частности, Мончегорский ГОК. Исследование состояния наружной структуры растительной клетки в условиях мощного антропогенного прессинга позволяет понять потенциальный уровень ее устойчивости.
Цель исследования: выявить закономерности изменения свойств клеточных стенок хвои сосны и ели и фракционного состава углеводных соединений, представляющих собой субстратную основу для формирования компонентов клеточных оболочек, в условиях аэротехногенного загрязнения Мончегорского ГОКА.
Задачи исследования:
Определить структурное и функциональное состояния клеточных стенок хвои сосны обыкновенной и ели сибирской в условиях таежной зоны.
Исследовать изменения химического состава клеточных стенок хвои сосны обыкновенной и ели сибирской в зависимости от уровня аэротехногенного загрязнения.
Исследовать изменения содержания углеводных соединений в хвое сосны обыкновенной и ели сибирской в зависимости от уровня аэротехногенного загрязнения.
4. На основании полученных данных сравнить реакцию сосны
обыкновенной и ели сибирской на действие промышленного загрязнения Мончегорского ГОКА.
Научная новизна.
Впервые в таежной зоне Мурманской области в зоне загрязнения Мончегорского медно-никелевого комбината "Североникель" проведено исследование структуры и функционального состояния клеточных стенок хвои сосны обыкновенной и ели сибирской.
Впервые получены результаты о типах катионообменных групп в структуре клеточных стенок хвои сосны и ели. Определены физико-химические параметры, характеризующие ионообменные свойства клеточных стенок хвои. Показано, что в норме клеточные стенки хвои сосны и ели содержат три типа катионообменных групп. Влияние антропогенного загрязнения не приводит к изменению качественного состава функциональных групп, но отражается на их количестве. Набухание клеточных стенок не является постоянной величиной, а зависит от условий внутри апопласта, которые определяются условиями окружающей среды.
Практическая значимость работы.
Полученные в работе данные по структурному и функциональному состоянию клеточной стенки хвои сосны обыкновенной и ели сибирской можно использовать для диагностики состояния деревьев в различных экологических условиях.
Результаты по составу ионообменных групп клеточной стенки могут быть использованы для оценки физиологического состояния при проведении системы мониторинга в зоне действия Мончегорского ГОКА.
Количественная оценка способности клеточной стенки к набуханию позволит дать дополнительную информацию о вкладе апопласта в процессы передвижения воды и ионов в растении.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова Восточной Фенноскандии" (Петрозаводск, 1999), международной конференции "Физиология растений - наука III
тысячелетия" в рамках IV съезда Общества физиологов растений России (Москва, 1999), международной конференции молодых ученых "" (Санкт - Петербург, 1999), международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар, 2001), конференции "Биологические ресурсы и устойчивое развитие" (Пущино, 2001), международном симпозиуме "Plant under environmental stress" (Москва, 2001), научном семинаре кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ им. Ломоносова (Москва,2001).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, включая 3 статьи.
Положения, выносимые на защиту:
показано участие клеточных стенок хвои сосны обыкновенной и ели сибирской в ответной реакции растений на антропогенное загрязнение
в норме в структуре клеточных стенок хвои сосны и ели содержаться три типа катионообменных групп, влияние антропогенного загрязнения не приводит к изменению качественного состава функциональных групп, а отражается только на их количестве
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 21 рисунок. Список цитируемой литературы включает 184 наименований, в том числе 68 на иностранных языках.
Клеточная стенка растений в экстремальных условиях существования
Работы, посвященные исследованию антропогенного влияния на состав, свойства и метаболизм клеточной стенки, немногочисленны. Более разработанными являются вопросы по влиянию природных стрессовых факторов. Существует обширная литература о реакции клеточной стенки растений на действие засухи, за соления, влияния пониженных температур и водного стресса. Частично она проанализирована в нескольких зарубежных и отечественных обзорах (Тарчевский, Марченко 1985; Лозовая, 1987; Заботин и др., 1995, Заботина, Гродзовская, 1986; Горшкова и др., 1995; Пахомова и др., 1997; Горшкова, 1999; Bolwell, 1988; Iraki et.al., 1989; Carpita, Gibeaut, 1993; McCann et.al., 1994; Valero, Labrador, 1995). Можно отметить, что воздействие стрессовых факторов изменяет количественный состав и соотношение различных фракций полисахаридов между собой.
Замедление роста при воздействии солевого стресса на клетки суспензированной культуры табака приводило к уменьшению высвобождения полисахаридов матрикса в среду культивирования (Iraki et. al., 1989).
При пониженной температуре отмечается резкое увеличение соотношения полисахаридов матрикса и целлюлозы. Возрастание доли матриксных полисахаридов могло происходить как за счет замедления их распада, так и за счет меньшего влияния пониженной температуры на их синтез, по сравнению с синтезом целлюлозы (Горшкова и др., 1995; Горшкова, 1999). В работе А.И. Заботина с соавторами (1995) также было показано, что изменения клеточной стенки в процессе низкотемпературной акклимации связаны с количественными и качественными изменениями фракции гемицеллюлоз, которые вместе с молекулами экстенсина (Carpita, Gibeaut, 1993) формируют и поддерживают пространственную организацию клеточной стенки. Авторы предполагают, что увеличение синтеза гемицеллюлоз связано не только с необходимостью модифицирования физических (механических) свойств клеточной стенки, но также с формированием резервного пула гемицеллюлоз, которые, как известно, легко гидролизуются, или подвергаются в процессе онтогенеза различным превращениям (Заботин и др., 1995).
Возможность утилизации клеткой мономеров, образовавшихся при гидролизе полисахаридов клеточной стенки, широко обсуждается в литературе (Палеев 1938; Лозовая, 1987; Пахомова и др., 1997; Горшкова и др., 1995; Горшкова, 1999). При этом встает вопрос о взаимоотношении резервного фонда Сахаров клеточной стенки и классического резервного полисахарида - крахмала. Судя по данным Т.А. Горшковой (1997), объемы метаболизации крахмала в целом растении превышают объемы гидролиза полисахаридов клеточной стенки. Однако в тканях, интенсивно формирующих клеточные стенки, гидролиз полисахаридов матрикса может быть существенным дополнением в обеспечении углеводными субстратами биосинтетических процессов, особенно в условиях стресса (Горшкова, 1999).
Изменения состава и соотношения различных фракций полисахаридов между собой, в условиях стресса, должно приводить к формированию клеточной стенки с измененными характеристиками. Возможно, в дальнейшем это имеет последствия для клетки и, является одним из сигналов для запуска ответных реакций растительного организма (Горшкова и др., 1995; Fry, 1994; Fry et. al., 1990).
Первым барьером, направленным на предотвращение поступления металла в клетку, является иммобилизация металлов посредством клеточной стенки и внеклеточными углеводами (Vasquez , Leonardi, 1999). Ионы металлов прочно связываются большим количеством анионных карбоксильных групп пектинов и глико-протеинов. Природа их связывания может быть электростатической, ионной или ковалентной (Macfie, Welbourn, 2000).
М. Wierzbickaa (1998) в работе по изучению действия свинца на клетки кончиков корней лука, выявила существование двух основных защитных механизмов, направленных против токсического действия металла. Первый - это увеличение количества полисахаридов в клеточной стенке и толщины стенки, что позволяет аккумулировать большее количество металла. Второй связан с выведением свинца из клетки к апопласту кончиков корня, это делает возможным инактивацию свинца, который оказывает токсическое влияние на корневую систему (Wierzbickaa, 1998).
Изучение накопления цинка в различных сегментах Hylocomium splendens в районе действия металлургического комбината в Латвии показало, что содержание цинка в клеточной стенке увеличивалось по мере приближения к источнику загрязнения (Brumelis, et. al., 1999).
Растения Piniis radiata, приблизительно 12 месячного возраста были экспонированы Pb(N03)2 в течение 1 недели. В тканях корня свинец в нехелатированной форме был обнаружен исключительно в клеточных стенках. В хвое хелатирован-ный свинец был найден в месте соседства клеточных стенок с внутрицеллюлярным местом. При морфологическом изучении клеточных компонентов, таких как митохондрии, диктиосомы, рибосомы и эндоплазматический ретикулум, не было обна ружено повреждений, вызванных неблагоприятным воздействием свинца (Jarvis, Leung, 2002).
Rana P. Singh с соавторами (1997), изучая поступление свинца в клеточную стенку, выявили, что оно коррелирует с изменением содержания уроновых кислот. Высказано предположение об ассоциации свинца с анионными группами пектиновых веществ клеточной стенки (Singh, et. al., 1997). Возможность координации меди с атомами кислорода карбоксильных групп пептидогликанов и атомами азота аминосахаров или структурных белков клеточной стенки была показана в работе Philip, Iyengar, Venkobachar (2000).
L. Sanita di Toppi и R. Gabbrielli (1999) обнаружили, что в корнях и листьях фасоли кустовой ионы кадмия связывались, в основном, с пектинами и гистиди-ловыми группами клеточной стенки. Однако, по мнению авторов, важность этих механизмов может изменяться в соответствии с концентрациями поступающего кадмия, видами растений и т.д. Было выявлено различие в связывании кадмия клеточными стенками нормальных и Cd-толерантных растений (Sanita di Toppi, Gabbrielli, 1999).
Углеводные соединения растений в условиях действия промышленных поллютантов
Работы по изучению изменения полисахаридного состава и обеспеченности низкомолекулярными метаболитами клеточной стенки хвойных растений в условиях промышленного загрязнения отсутствуют. В литературе в основном обсуждается влияние антропогенного фактора на суммарное содержание или количественные и качественные изменения отдельных фракций углеводных соединений. В связи с этим в этой главе нами будут рассмотрены данные, касающиеся особенностей углеводного обмена растений в условиях действия поллютантов.
Среди газообразных загрязнителей воздуха диоксид серы представляет собой существенную опасность для древесных растений, хотя возможность использования поглощенного листовым аппаратом газа в метаболизме растения широко известна (Барахтенова, 1995; Барахтенова, Николаевский, 1988; Судачкова, 1997). В условиях с повышенным содержанием сернистого ангидрида в воздухе растения не могут полностью использовать сульфаты, проникшие в клетку, в результате чего происходит накопление их в хвое и побегах. Под воздействием фитотоксикантов у растений нарушается углеводный обмен, а углеводы играют значительную роль в устойчивости растений к неблагоприятным факторам (Негруцкая и др., 1981).
Н. Svobodova с соавторами высказали гипотезу, что изменения в содержании и составе неструктурных Сахаров в почках Picea abies может быть индикатором ранних повреждений или прямых метаболических реакций, вызванных влиянием кислых дождей как главных стрессорных факторов (2000). Для анализа неструктурных углеводов использовали 4-х летние деревья ели, которые в течение двух лет обрабатывали кислым дождем (рН 2,9 и 3,9). Содержание крахмала в покоящихся почках ели не изменялось. Наблюдали увеличение отношения фракции пинитола к фракции олигосахаров, включающих в себя рафинозу и рафинозоподобные сахара. Авторы предлагают использовать этот показатель как возможный индикатор ранних повреждений покоящихся почек ели, вызванных действием кислых осадков. (Svobodova, et. al., 2000)
Уменьшение общего количества углеводов и особенно рафинозы в тканях сеянцев и взрослых деревьев Picea rubens наблюдали под влиянием промышленно го загрязнения. Было установлено, что это приводит к ослаблению устойчивости деревьев к холоду (Amundson et al., 1992).
По данным L.J. Sheppard (1994), под действием кислых осадков в сеянцах Picea rubens, экспонированных в открытых камерах с мая по ноябрь, наблюдалось падение зимостойкости под влиянием сульфата, который, действуя непосредственно на белки мембран, повреждая последние, также снижал запас углеводов, необходимых в качестве криопротекторов, путем редукции фотосинтеза и связывания Сахаров.
В хвое сосен под воздействием сернистого ангидрида по мере ослабления деревьев наблюдали накопление крахмала, но уменьшение при этом количества растворимых Сахаров. В побегах происходит возрастание растворимых Сахаров и крахмала. Увеличение содержания крахмала авторы связывают с уменьшением его гидролиза под воздействием вредных газов, а увеличение Сахаров с ослаблением оттока углеводов (Негруцкая и др., 1981). Было показано, что добавление S02 в концентрациях от 1.0 до 10.0 М ингибировало поглощение из окружающей среды дисками листьев сахарозы (Lorenc-Plucinska, 1993 а, б).
Исследовано влияние разных концентраций S02 на интенсивность фотосинтеза и транспорт Сахаров у 25-летних деревьев тополя (Populus Deltoides). Установлено, что сернистый ангидрид в концентрации от 2,5 мМ и более интенсивно ин-гибировал транспорт Сахаров во флоэму. Подавление фотосинтеза увеличивалось в вариантах со снижением уровня рН инкубационной среды. Степень ингибирования ассимиляции С02 ионами серного ангидрида была более низкой чем процесс транспорта Сахаров во флоэму (Lorenc-Plucinska, 1993 а, б).
Исследования на четырех видах лесных деревьев: Betula pubescens, В. реп-dula, Picea abies, Pinus sylvestris, показали, что в листьях деревьев, наиболее близко расположенных к источнику загрязнения (диоксид серы и тяжелые металлы: кальций, цинк) повышено содержание крахмала и сахарозы и снижено - глюкозы и фруктозы. У хвойных этот эффект выражен сильнее. Автор также высказывает предположение, что серный ангидрид и тяжелые металлы ингибируют гидролиз крахмала и сахарозы и транспорт последней (Balsberg-Paohlsson, 1989).
Уменьшение дисахаров и накопление крахмала под действием сернистого ангидрида также отмечает Г.М. Илькун (1971), но только при скрытых или на чальных повреждениях листьев. Причину этого автор объясняет влиянием SO2 на активность ферментов: амилаз и инвертазы. При действии на листья сернистого газа активность амилаз падает и интенсивность процесса деполимеризации сложных углеводов снижается, приводя к накоплению крахмала в тканях, а увеличение активности инвертазы способствует ускорению гидролиза сахарозы (Илькун, 1971).
В противоположность приведенным данным, в ряде работ отмечается уменьшение крахмала в условиях действия воздушных поллютантов.
У деревьев, обработанных кислым дождем с рН 3,1, наблюдали тенденцию к снижению общего количества растворимых Сахаров и крахмала в хвое первого года жизни и снижение количества крахмала в хвое текущего года. По мнению авторов, снижение уровня крахмала в хвое текущего года может происходить либо в результате подавления процесса образования крахмала, либо в результате ускорения или преждевременного использования крахмала (Amundson et al., 1990/91).
Данные по содержанию углеводов при разных градациях угнетения древо-стоев свидетельствуют о наличии выраженной тенденции к снижению уровня крахмала и мало изменяющейся концентрации растворимых Сахаров вплоть до стадии деградации. В условиях воздействия неблагоприятных факторов одним из основных защитных механизмов, способствующих выживанию растения, служит поддержание возможно более стабильного уровня Сахаров как источников для последующих синтезов и функционирования важнейших метаболических путей. И только в деградирующих древостоях, где деревья уже нежизнеспособны, уровень Сахаров снижается. Судя по содержанию крахмала, которое, начиная со средней степени угнетения, падает даже ниже уровня зимнего минимального, концентрация Сахаров поддерживается не только за счет новообразования в процессе фотосинтеза, но и за счет гидролиза этого полимера (Михайлова, 1997).
Характеристика выбросов Мончегорского комбината "Североникель"
Объекты исследования и методика сбора образцов Для исследования влияния промышленного загрязнения медно-никелевого комбината "Североникель" на углеводные соединения и клеточную стенку хвои сосны обыкновенной и ели сибирской были использованы данные, собранные и обработанные сотрудниками лаборатории физиологии древесных растений Института леса КарНЦ РАН за 1991, 1992 гг. и наши данные за 1997, 1999 и 2000 гг. Учитывая, что динамика содержания углеводов подвержена значительным изменениям в период роста, исследование углеводного состава хвои сосны у деревьев, подверженных разному уровню промышленного влияния, мы проводили в связи с фазами роста. Хвою собирали в конце июня (1991 и 2000 гг.), в период интенсивного роста хвои; в конце июля (1992 г.), в период созревания хвои и в конце августа (1997, 1999 гг.), в период завершения ростовых процессов. Проведенная статистическая обработка данных по содержанию тяжелых металлов, серы, углеводных соединений позволила объединить изучаемые показатели за 1997 и 1999 гг. в одну генеральную совокупность. Изучение реакции углеводных соединений хвои на загрязнение деревьев разного жизненного состояния проводили на участке 30 км от комбината "Североникель", так как в этих условиях происходит дифференциация деревьев сосны и ели по категориям жизненного состояния.
Образцы хвои разных лет жизни собирали с деревьев сосны и ели, типичных по жизненному состоянию для пробной площади, в верхней части кроны, в одно и тоже время суток (для снижения эндогенной изменчивости). Биологическая по-вторность (количество деревьев, с которых брали хвою на каждой пробной площади) равна 5. При взятии растительного материала на участке 30 км от комбината "Североникель", где представлены деревья 1-4-й категорий, собирали хвою также с 5 деревьев каждой категории жизненного состояния. Для диагностики жизненного состояния дерева использовали методику В.Т. Ярмишко (1997), разработанную для сосны обыкновенной. Оценка жизненного состояния деревьев по данной методике приведена в таблице 2.
Общее содержание серы определяли в аналитической лаборатории Института леса КарНЦ РАН колориметрическим методом (аналитик Коржова М.А.). Метод основан на образовании осадка сернокислого бария при добавлении хлористого бария к кислому анализируемому раствору, содержащему сульфат-ионы, с последующим определением степени помутнения колориметрическим методом (Козлов и др., 2001).
Тяжелые металлы определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии после автоклавного озоления в смеси азотной и соляной кислот (Козлов и др., 2001) в аналитической лаборатории Института леса КарНЦ РАН. Аналитики -Ерофеевская С.Л., Макарова Т.Н., Ракова Н.И. По мнению М.В. Козлова с соавторами (2000), отмывание листьев при анализе содержания тяжелых металлов не имеет смысла, так как только малая часть тяжелых металлов, содержащихся на по верхности, смывается. (Так, до обработки водой листьев берёзы, собранных на загрязненных медно-никелевым производством территориях, содержание (мг/кг) никеля на поверхности листа было 4,80 ± 0,35, меди - 3,68 ± 0,31, а после обработки водой никеля - 4,22 ± 0,47, меди - 2,40 ± 0,33 (Kozlov et al., 2000)).
Выделение клеточной стенки проводили согласно методике (Meychik, Yermakov, 1999). Фиксированный и высушенный материал помещали в стеклянную ионообменную колонку (V 0,25 л) и промывали в следующей последовательности: 10 мМ КОН (V 0.5 л), дистиллированной водой (V 2 л), 10 мМ НС1 (V 0.5 л). Все образцы затем промывали дистиллированной водой до отсутствия
СІ в промывных водах, а затем высушивали до постоянного веса при 55-60.Указанный метод стандартизации, т. е. переведения всех имеющихся в структуре клеточной стенки катионообменных групп в Н+-форму, позволяет проводить сравнительное исследование сорбционных свойств ионообменных материалов с различной структурой функциональных групп (Мейчик и др., 1999; Meychik, Yermakov, 1999). Микроскопическое исследование образцов клеточной стенки хвои показало отсутствие в ней внутриклеточных структур, а анатомическая последовательность расположения клеток при этом не нарушалась.
Весовой коэффициент набухания стандартизированных клеточных стенок определяли методом, предложенным Мейчик Н.Р. и Ермаковым И.П. (2001). Фрагменты набухших в воде стандартизированных клеточных стенок обсушивали CW фильтровальной бумагой и определяли их сырую массу (Gp ). Затем клеточные стенки высушивали при 50 до постоянного веса и определяли их сухую массу CVV (GD ). Весовой коэффициент набухания стандартизованных клеточных стенок CW (К ) определяли по формуле (Гельферих, 1965). CW CW _ CW CW К =(GF -GD )/GD , (1) где GF и Go - сырая и сухая масса образцов, г; индекс cw - обозначает стандартизованную клеточную стенку.
Потенциометрическое титрование осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Сухие навески образца по 50 ± 0,1 мг помещали в шлифованные конические колбы с притертой пробкой (объем 50 мл) и заливали 25 мл раствора КОН или НС1 различной концентрации, но постоянной ионной силы (250 мМ), которую создавали соответствующими растворами КС1. Диапазон изменения концентраций кислоты или щелочи в исходных растворах составлял 0-10 мМ. По истечению 48 часов образцы отделяли от раствора. Материал стандартизованных клеточных стенок обсушивали фильтровальной бумагой, определяли сырую массу CVV CW (GF ), высушивали при 50 до постоянного веса, определяли сухую массу (GD ) и рассчитывали весовой коэффициент набухания клеточных стенок по формуле (1). Для стандартизованной клеточной стенки при каждом значении рН. определяли ко CW эффициент набухания, в результате была получена зависимость К. — г(рН;). В оставшихся растворах определяли рН (рН Meter, Model 3320, фирма "Jenway", Англия) до и после контакта с образцами и соответственно концентра + цию оставшейся кислоты или щелочи. По изменению концентрации Н или ОН в растворе рассчитывали сорбционную способность клеточной стенки при pHj по формуле: scat,an= (С . С.) у / g (2) где scat,an- сорбционная емкость образцов по катионам (Scat) или анионам (San), мкмоль/г сухой массы; С и Q - исходная и соответствующая равновесные концентрации КОН или НС1 в растворе, мМ; V - объем раствора, мл; g - навеска образца, г.
Полученные экспериментальные кривые зависимости рН; = f(S;) разделяли на моносигмоидные участки, для выделения функциональных групп разного типа, по разработанной ранее методике (Meychik, Yermakov, 1999).
Содержание тяжелых металлов в хвое Pinus sylvestris L. и Picea obovata Ledeb., произрастающих на разном расстоянии от комбината в период интенсивного роста и после его окончания
Как показал анализ литературы, работ по свойствам клеточной стенки хвойных растений в условиях загрязнения нет. Выделение клеточной оболочки проводили по методике, в которой не используют предварительную гомогенизацию растительных тканей, детергенты и жесткую химическую обработку (Мейчик, Ермаков, 2001), поэтому одним из важных возникающих вопросов встает доказательство, что выделенный материал действительно представлен клеточными стенками.
Прежде всего, мы провели микроскопическое тестирование образцов, которое показало отсутствие внутреннего содержимого клетки, то есть исследуемый материал представлен только клеточными стенками. Однако это визуальная оценка, для ее подтверждения необходимы и количественные методы.
Количественным критерием качества используемого нами метода выделения, как предполагают Мейчик Н.Р. и Ермаков И.П. (2001), могут служить результаты потенциометрического титрования. В основе этого подхода лежат представления, что если состав интактной клетки характеризуется наличием как катионо-обменных, так и анионообменных групп, то для чистой фракции клеточных стенок характерны в основном катионообменные группы.
Кривые потенциометрического титрования выделенных нами, стандартизированных клеточных стенок представлены на рисунке 5. Градиент рН = рН - рН;, где рН и pHj - значения рН в исходном и равновесном растворах соответственно. Отрицательное значение рН связано с поглощением протонов анионнообменными группами, а положительное с выделением протонов. Процесс поглощения протона происходит только в узкой области pHj =3,2-3,3 (рис.5) при этом абсолютная величина отрицательного градиента составляет около 0,2 единиц рН во всех случаях. В диапазоне pHj 3,3 значения градиента рН только положительные. Это свидетельствует о том, что стандартизированные клеточные стенки содержат в основном катионообменные группы, в отличие от интактного материала, который содержит как катионообменные, так и анионообменные группы (Мейчик, Ермаков, 2001 а).
На рисунке 6 показано, что ионогенные группы, имеющиеся в фиксированном материале хвои, способны поддерживать рН раствора (pHj) на постоянном уровне в широкой области варьирования рН внешней среды. Изменение рН внешнего раствора от 3 до 9,3 приводит к колебаниям равновесного раствора в пределах 0,3 единиц.
Все это свидетельствует о том, что хвоя, обработанная согласно использованной в работе методике, представлена в основном клеточными стенками, так как они характеризуются высокой катионообменной способностью и малой способностью к поглощению анионов, т.е. обладают ионообменными свойствами, которые аналогичны свойствам клеточных стенок, выделяемых в соответствии с общепринятой методикой.
Структурную основу клетки составляет целлюлоза, в компоненты матрикса стенки входят гемицеллюлозы, пектины, белки и липиды. В функциональном отношении большой интерес представляют пектиновые вещества, которые включают галактуронаны, галактаны и арабаны (Саламатова, 1983). Основой пектиновых соединений является полимерная цепь полигалактуроновой кислоты. Эти цепи содержат большое количество карбоксильных групп, которые и связывают ионы двухвалентных металлов, особенно кальция. Ионы кальция могут обмениваться на другие катионы, обеспечивая значительную катионообменную способность клеточной стенки, поэтому считается, что поведение растительной клеточной стенки подобно поведению слабоосновного катионообменника с малой степенью сшивки (Гельферих, 1962). В связи с этим, свойства клеточных стенок можно охарактеризовать физико-химическими параметрами, важнейшими из которых являются ионообменная способность, константа ионизации активных групп и коэффициент набухания полимерного матрикса (Мейчик, Ермаков, 2001а, б). Все эти характеристики и были использованы в работе.
В закончившей рост клетке клеточная стенка утрачивает пластичность за счет увеличения числа микрофибрилл, а эластичность ее возрастает. Благодаря тому, что интактная клеточная стенка находится в набухшем состоянии, ее сопротивляемость воде не очень велика, она обладает способностью пропускать в клетку растворенные вещества. И эта функциональная способность поглощения воды может быть оценена по коэффициенту набухания клеточных стенок, который может изменяться при изменении условий окружающей среды.
Главным фактором, определяющим набухание, является степень поперечной сшивки полимерных цепей (Гельферих, 1962; Шатаева и др., 1979). Экспериментальная оценка набухания дает возможность оценить жесткость трехмерной структуры клеточной стенки или ее способность изменять объем под воздействием различных внешних факторов (Мейчик, Ермаков, 2001а).
Значения коэффициента набухания в воде клеточных стенок хвои деревьев сосны и ели представлены на рис. 7. С увеличение расстояния от источника загрязнения величина коэффициента набухания у сосны не изменялась и соответствовала 2,2 ± 0,13. У ели, при приближении к комбинату, наблюдалась тенденция к увеличению коэффициента набухания от 2,3 ± 0,25 до 2,7 ± 0,35.
Изменение окружающих условий в данном эксперименте моделируется за счет замены чистой воды на растворы с разными значениями рН (от 2 до 12) при постоянной ионной силе 250 мМ (рис.8). Величина коэффициента набухания в растворах хлорида калия, по сравнению с коэффициентом набухания в воде, у обоих видов уменьшалась почти в два раза и варьировала в зависимости от рН у сосны в значительно более широком диапазоне от 0,9 до 1,3, чем у ели - от 1,2 до 1,4. В кислой области Kcw была меньше, чем в нейтральной и щелочной областях (рис. 8), что обусловлено разной степень диссоциации ионогенных групп в этих областях. Следует отметить, что исследуемые виды значимо различаются.
Изменение коэффициента набухания клеточных стенок при изменении рН окружающего раствора очень важно именно для условий загрязнения. Поэтому нами был использован дополнительный метод - аналоговое моделирование при помощи макроскопических моделей, которые разработаны ранее для ионообменных материалов (Гельферих, 1962) и были использованы для анализа клеточных стенок в работе Н.Р. Мейчик и И.П. Ермакова (2001а). Как считают авторы, увеличение объема клеточной стенки вызывается в основном двумя причинами. Во-первых, поры полимерного каркаса содержат ионы в высокой концентрации. Эти ионы стремятся к сольватации. Вторым эффектом, способствующим растягиванию матрицы, является электростатическое отталкивание одноименно заряженных фиксированных ионов.
